1、专题一 基因工程基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在 DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做 DNA重组技术。（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链 DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。（3）结果：经限制酶切割产生的 DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。黏性末端：当限制酶从识
2、别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的 DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。平末端：当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的 DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。2.“分子缝合针”DNA 连接酶(1)两种 DNA连接酶（ EcoliDNA连接酶和 T4-DNA连接酶）的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别： EcoliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链 DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而 T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与 DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只
3、能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA 连接酶是连接两个 DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶 DNA聚合酶连接的 DNA 双链 单链模板 不要模板 要模板不同点连接的对象 2个 DNA片段 单个脱氧核苷酸加到已存在的单链 DNA片段上作用实质 形成磷酸二酯键相同点化学本质 蛋白质3.“分子运输车”载体（1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA片段插入。具有标记基因，供重组 DNA的鉴定和选择。对受体细胞无害。（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环
4、状 DNA分子。（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。（1）获取方法：从基因文库中获取目的基因（2）人工合成法：化学方法合成 DNA片段（反转录法、直接合成法）（3）PCR 反应扩增 DNA2.基因文库包括基因组文库和部分基因文库（如 cDNA文库）3.PCR技术扩增目的基因（1）PCR 的含义：聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术。（2）目的：获取大量的目的基因（3）原理：DNA 双链复制（4）过程：第一步：加热至 9095DNA 解链为单链；第二步：冷却到 55
5、60，引物与两条单链 DNA结合；第三步：加热至 7075，热稳定 DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成。（5）特点：指数(2 n)形式扩增第二步：基因表达载体的构建(核心)1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA片段，位于基因的首端，是 RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的 DNA片段 ，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的
6、细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。3.重组质粒形成过程:（1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。（2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量 DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）第三步：将目的基因导入受体细胞转化1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。方法的受体细胞多是 受精卵。
7、将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞 ，再将重组表达载体 DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收 DNA分子，完成转化过程。3.重 组 细 胞 导 入 受 体 细 胞 后 ， 筛 选 含 有 基 因 表 达 载 体 受 体 细 胞 的 依 据 是 标 记 基 因 是 否 表 达 。第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测转基因生物的染色体 DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交 (DNA-DNA)技
8、术。2.其次还要检测目的基因是否转录出 mRNA，方法是采用分子杂交(DNA-RNA)技术。3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用抗原抗体杂交技术。4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如生物抗虫或抗病的鉴定等。（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提 高 动 物 生 长 速 度 、 改 善 畜 产 品 品 质 、 用 转 基 因 动 物 生 产 药 物 。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。4.基因诊断：又称为 DNA诊断，是采用基因检测的方法来判断患者是否出现了基因异常或携带
9、病原体。（四）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）转录 翻译蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发；设计预期的蛋白质结构；推测应有的氨基酸序列；找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因） 蛋白质工程与基因工程区别一基因的结构：基因是有遗传效应的 DNA 片段(注：RNA 病毒为 RNA)，分为编码区和非编码区。编 码 区编 码 区 非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区编 码 区 上 游编
10、码 区 上 游 编 码 区 下 游编 码 区 下 游编码区：能转录出 mRNA，原核生物中也就是能编码蛋白质的区段非编码区：不能转录出 mRNA，也不能编码蛋白质的区段（）原核细胞基因的结构 编 码 区编 码 区 非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区RNA聚 合 酶 结 合聚 合 酶 结 合 位 点位 点启 动 子 终 止 子非编码区中存在调控遗传信息表达的核苷酸序列:编码区上游的 RNA 聚合酶结合位点，即启动子，可控制 RNA 聚合酶的结合。RNA 聚合酶是一种蛋白质，能识别并结合调控序列中的结合位点，能催化 DNA 转录为 RNA编码区下游有终止子，可控制 RNA 聚合酶的停止、脱落。（2）真核细胞基因的结构 编 码 区编 码 区 非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区非 编 码 区 编 码 区 下 游编 码 区 下 游调 控 遗 传 信 息 的 表 达调 控 遗 传 信 息 的 表 达(调 控 序 列调 控 序 列 )外 显 子外 显 子能 编 码 蛋 白 质能 编 码 蛋 白 质启 动 子 内 含 子内 含 子不 能 编 码 蛋 白 质不 能 编 码 蛋 白 质
