1、选修 3 复习提纲一、 基因工程1、（a）基因工程的诞生（一）基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在 DNA 分子水平上进行设计和施工的，又叫做 DNA 重组技术。2、（a）基因工程的原理及技术原理：基因重组技术：（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。（2）功能：能够识别双链 DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性
2、。（3）结果：经限制酶切割产生的 DNA 片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。2.“分子缝合针”DNA 连接酶(1)两种 DNA 连接酶（EcoliDNA 连接酶和 T4DNA 连接酶）的比较：相同点：都缝合磷酸二酯键。区别：EcoliDNA 连接酶来源于 T4 噬菌体，只能将双链 DNA 片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而 T4DNA 连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。(2)与 DNA 聚合酶作用的异同:DNA 聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA 连接酶是连接两个 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯键。3.“分子运输车”
3、载体（1）载体具备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存。具有一至多个限制酶切点，供外源 DNA 片段插入。具有标记基因，供重组 DNA 的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状 DNA 分子。（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。3.PCR 技术扩增目的基因（1）原理：DNA 双链复制（2）过程：第一步：加热至 90
4、95DNA 解链；第二步：冷却到 5560，引物结合到互补 DNA 链；第三步：加热至 7075，热稳定 DNA 聚合酶从引物起始互补链的合成。第二步：基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。2.组成：目的基因启动子终止子标记基因（1）启动子：是一段有特殊结构的 DNA 片段，位于基因的首端，是 RNA 聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出 mRNA，最终获得所需的蛋白质。（2）终止子：也是一段有特殊结构的 DNA 片段 ，位于基因的尾端。（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的
5、细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。第三步：将目的基因导入受体细胞_1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。2.常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵。将目的基因导入微生物细胞：3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测 转基因生物的染色体 DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA 分子杂交技术。2.其次还要
6、检测 目的基因是否转录出了 mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与 mRNA 杂交。3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行 抗原抗体杂交。4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。（三）（b）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。（四）（a）蛋白质工程的概念蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系
7、作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）（1）蛋白质工程崛起的缘由：基因工程只能生产自然界已存在的蛋白质（2）蛋白质工程的基本原理：它可以根据人的需求来设计蛋白质的结构，又称为第二代的基因工程。基本途径：从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白质工程特有的途径；以下按照基因工程的一般步骤进行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法）设计中的困难：如何推测非编码区以及内含子的脱氧核苷酸序列二、细胞工程（一）植物细
8、胞工程 1.理论基础（原理）：细胞全能性2.植物组织培养技术（b）（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞 愈伤组织 试管苗 植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产。A 植物繁殖微型繁殖：可以高效快速地实现种苗的大量繁殖作物脱毒：采用茎尖组织培养来除去病毒（因为植物分生区附近的病毒极少或没有）人工种子：以植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽和腋芽等为材料，经人工薄膜包装得到的种子。优点：完全保持优良品种的遗传特性，不受季节的限制；方便储藏和运输B 作物新品种培育单倍体育种：a 过程：植株（AaBb）通过减数分裂得到花粉（AB、Ab、aB、ab 四种
9、类型）；对花粉进行花药离体培养（技术是植物组织培养）；得到单倍体植株；对其幼苗时期进行秋水仙素处理；得到了正常的纯合二倍体植株（AABB、AAbb、aaBB、aabb 四种类型）。b 优点：明显缩短育种年限C 突变体利用：在组织培养中会出现突变体，通过从有用的突变体中选育出新品种（如筛选抗病、抗盐、含高蛋白的突变体）D 细胞产物的生产：通过能够产生对人们有利的产物的细胞进行组织培养，从而让它们能够产生大量的细胞产物。（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。3.植物体细胞杂交技术（1）过程：（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。化学法一般是用聚乙
10、二醇（PEG）作为诱导剂。（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。（二）动物细胞工程1. 动物细胞培养（a）（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）剪碎用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞制成细胞悬液转入培养瓶中进行原代培养贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂
11、增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。（4）动物细胞培养需要满足以下条件无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。温度：适宜温度：哺乳动物多是 36.50.5；pH：7.27.4。气体环境：95%空气5%CO2。O2 是细胞代谢所必需的，CO2 的主要作用是维持培养液的 pH。（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞。2.动物体细
12、胞核移植技术和克隆动物（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。（3）体细胞核移植的大致过程是：高产奶牛（提供体细胞）进行细胞培养；同时采集卵母细胞，在体外培养到减二分裂中期的卵母细胞，去核（显微操作）注：为什么要用卵细胞？它可以提供充足的营养；操作简便；细胞质不会抑制细胞核全能性的表达；将供体细胞注入去核卵母细胞；通过电刺激使两细胞融合，供体核进入受体卵母细胞，构建重组胚胎；将胚胎移入受体（代孕）母牛体内；生出与供体奶牛遗传基因相同的犊牛（4）体细胞核移植技术
13、的应用：加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育；保护濒危物种，增大存活数量；生产珍贵的医用蛋白；作为异种移植的供体；用于组织器官的移植等。（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。3.动物细胞融合（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传
14、、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：4.单克隆抗体（1）抗体：一个 B 淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。（2）单克隆抗体的制备过程：对免疫小鼠注射特定的抗原蛋白（目的使小鼠产生了效应 B 细胞）；提取 B 淋巴细胞；同时用动物细胞培养的方法培养骨髓瘤细胞并提取；促使它们细胞融合注：融合的结果是有很多不符合要求的；如有 2 个 B 淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选；在特定的选择培养基上筛选出融合的杂种细胞特点是能迅速大量增殖，又能产生专一的抗体；然后对它进行克隆化培养和抗体检测筛选出能够分泌所需
15、抗体的杂种细胞；最后将杂交瘤细胞在体外做大规模培养或注射入小鼠腹腔内增殖，从细胞培养液或小鼠腹水中可得到大量的单克隆抗体。（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。（5）单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。三、胚胎工程（一）动物胚胎发育的基本过程（1）精子的发生：补充，精原细胞先进行有丝分裂后进行减数分裂；变形过程中，细胞核为精子头的主要部分
16、，高尔基体发育为顶体，中心体演变为精子的尾，线粒体在尾基部形成线粒体鞘膜，其他物质浓缩为原生质滴直至脱落。线粒体为精子运动提供能量（2）卵子的发生：在胎儿时期，卵原细胞进行有丝分裂演变成初级卵母细胞被卵泡细胞包围，减一分裂在排卵前后完成，形成次级卵母细胞和第一极体进入输卵管准备受精；减二分裂是在受精过程中完成的。（3）受精：精子获能（在雌性动物生殖道内）；卵子的准备（排出的卵子要在输卵管中进一步成熟到减二中期才具备受精能力）；受精阶段卵子周围的结构由外到内：放射冠、透明带、卵黄膜，a 顶体反应：精子释放顶体酶溶解卵丘细胞之间的物质，穿越放射冠。b 透明带反应：顶体酶可将透明带溶出孔道，精子穿入
17、，在精子触及卵黄膜的瞬间阻止后来精子进入透明带的生理反应它是防止多精子入卵受精的第一道屏障；c 卵黄膜的封闭作用：精子外膜和卵黄膜融合，精子入卵后，卵黄膜会拒绝其他精子再进入卵内的过程它是防止多精子入卵受精的第二道屏障；精子尾部脱落，原有核膜破裂形成雄原核，同时卵子完成减二分裂，形成雌原核注意：受精标志是第二极体的形成；受精完成标志是雌雄原核融合成合子。（4）胚胎发育：a 卵裂期：细胞进行有丝分裂，数量增加，胚胎总体积不增加；b 桑椹胚：32 个细胞左右的胚胎之前所有细胞都能发育成完整胚胎的潜能属全能细胞；c 囊胚：细胞开始分化，其中个体较大的细胞叫内细胞团将来发育成胎儿的各种组织；而滋养层细
18、胞将来发育成胎膜和胎盘；胚胎内部逐渐出现囊胚腔注：囊胚的扩大会导致透明带的破裂，胚胎伸展出来，这一过程叫孵化；d 原肠胚：内细胞团表层形成外胚层，下方细胞形成内胚层，由内胚层包围的囊腔叫原肠腔。细胞分化在胚胎期达到最大限度9 胚胎工程的理论基础（识记）（1）胚胎工程的概念及技术手段：对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。（2）体外受精属有性生殖过程：a 卵母细胞的采集和培养 对体型小的动物用促性腺激素处理，从输卵管冲取卵子（可直接受精）；对体型大的动物从卵巢中采集卵母细胞（要在体外培养成熟）b 精子的采集 假阴道法、手握法和电刺激法；获能 对啮齿动物、兔、猪等的精子用培养法（放入人工配制的获能液中）；对牛、羊等精子用化学法（放在肝素或钙离子载体溶液中）
