1、第五章 繁殖辅助技术,Assisted Reproduction Technology,第一节 人工授精,Artificial Insemination （AI）,一 人工授精的概述二 采精三 精液品质检查四 精液的稀释五 精液的保存六 输精操作七 精液冷冻保存技术,第一节 人工授精,一、人工受精的概述,1 定义2 优越性3 AI主要技术环节,第一节 人工授精,人工授精是指用器械采集公畜（禽）精液，经过检查处理，再用器械将一定量的精液注入到发情母畜生殖道的一定部位，以人工操作代替公母畜本交的一种畜牧技术。,1 定义,一、人工受精的概述,在1780年意大利生理学家Spallanzani将犬的精子
2、注入母犬体内，获得3只小犬；1890年，法国兽医，马人工授精；1914年，意大利，Amantea设计了假阴道；1921年，俄国人Ivanoff，扩大到牛、羊、家禽；1937年，丹麦兽医发明了牛直肠把握输精；1949年，Polge，甘油，冷冻精液。 中国从1950年以后开始。,发展简史,一、人工受精的概述,2人工授精优越性,公畜利用率节约经济加快改良防病提高受胎率远距离交流和运输,就本交的几种方式而言的优越性有：,一、人工受精的概述,3 AI主要技术环节,采精,精液品质检查,精液稀释保存,精液运输,母畜发情鉴定,输精,一、人工受精的概述,二、采精,1 采精的方法种类及评价标准 2 采集技术,第一
3、节 人工授精,1 采精的方法种类及评价标准,（1）假阴道法,二、采精,（2） 手握或筒握法,1 采精的方法种类及评价标准,二、采精,（3）电刺激或按摩法,1 采精的方法种类及评价标准,二、采精,（4）阴道收集法,（5）海绵、集精袋法,（6）外科瘘管法,1 采精的方法种类及评价标准,二、采精,评价标准,全 量,无损伤,简 便,原 质,1 采精的方法种类及评价标准,二、采精,2 采集技术,二、采精,2.1 采精前准备（以假阴道为例）,场地：采精室要求宽畅、明亮、地面平整，安静，清洁，设有采精架、台畜、假台畜和精液操作室等必要设施,二、采精,台畜,1、健康、温顺、卫生,2、设计合理、方便,假阴道：,
4、公畜性欲,体况适中,定期检疫,定期清洗,饲料全价,适当运动,二、采精,2.2 公畜采精调教法,外 激 素 法,偷 梁 换柱 法,榜 样 示 范 法,二、采精,2.3 采精须知,采精者在公畜的右后侧（站住）；马性反射慢，压力重要；牛、羊性反射快，温度重要，勿触及阴茎，可触包皮；猪性反射慢，压力为节律性收缩；兔可用羊假阴道，倒向一侧并叫一声，表示射精；鸡按摩手法要准确实在。,二、采精,2.4 采精频率,马、牛和猪每周2-6次，鸡每3天停1天，羊在春分之前最差，秋分时可达714次/周。 牛：每周2天采精，当日采2次 猪：隔日一次，最好3天一次 羊：每周3天，当日采2次。 犬：隔日一次 主要根据精液品
5、质与公畜的性机能状况而定。,二、采精,在人工授精技术中，我们要采集公畜的精液，并在体外进行一系列的处理。那么精液的质量必然要受到公畜本身的生精能力、健康状况，以及采集方法、处理方法的影响。因此，检查精液品质是人工授精技术中一个非常重要的技术环节。,三、精液品质检查,第一节 人工授精,（一）重要性（二）精液品质检查项目（三）精液品质检查方法,三、精液品质检查,第一节 人工授精,（一）重要性,1.检查种公畜的配种能力 2.公畜的饲养水平和性机能 3.确定精液可稀释的倍数 4.检查精液的处理方法是否正确 5.检查精液产品的质量 6.反映技术操作水平,三、精液品质检查,（二）精液品质检查的项目,1.直
6、观项目 2.微观项目,三、精液品质检查,1.直观检查项目,射精量色泽气味云雾状PH值美兰退色试验,三、精液品质检查,A 射精量的测定方法B 射精量不正常的原因,射精量,三、精液品质检查,A 射精量的测定方法,概念: 射精量是指每次射精的体积测定: 以连续3次以上正常采集到的精液的平均值代表测定方法: 可用体积测量容器如刻度试管或量筒,也可用电子秤称重近似代表体积,三、精液品质检查,B 射精量不正常的原因,三、精液品质检查,色泽,三、精液品质检查,云雾状分级标准,+ 翻滚明显而且较快+ 翻滚明显但较慢+ 仔细看才能看到精液的移动- 无精液移动,三、精液品质检查,2.微观检查项目,2.1 精子活力
7、估测2.2 密度测定:计数板计数、比色计测定2.3 畸形率：形态畸形率、顶体畸形率,三、精液品质检查,2.1 活力的估测,A 概念:精子活力是指在37下,精液中前进运动精子占总精子数的百分率。B 主要测定方法:估测法,三、精液品质检查,活力测定时精液的稀释用品,三、精液品质检查,例：牛精子活力检查的程序,载玻片预温,精液稀释,取样检查,镜检,活力估测,活力记录,将恒温加热板放在载物台上，打开电源并调整控制温度至37，然后放在载玻片,将生理盐水与精液等温后，按1:10稀释,取10ul放在预温后载玻片中间，盖上盖玻片,用100倍和400倍观察,判断视野中前进运动精子占的百分率,按10级制评分和记录
8、,三、精液品质检查,2.2 密度测定20111020091,A 密度的概念及表示方法,单位体积精液中所含的精子数表示方法:个/ml 或亿/ml,也可以用个/ul表示,B 各种家畜精液的精子密度,三、精液品质检查,C 精子密度的测定方法,精子密度计数板(器)简介精液的稀释精液注入计数室精子计数精子密度计算,2.2 密度测定,三、精液品质检查,a 精子密度计数,精子计数室长宽各1mm,面积1mm2高度0.1mm,体积0.1mm3由双线或三线组成25个(5X5)中方格每个中方格内有16个小方格(4X4)共计400个小方格,三、精液品质检查,精子计数室及一个中方格,三、精液品质检查,b、精液的稀释,将
9、精液注入计数室前必须对精液进行稀释,以便于计数稀释的比例根据动物精液的密度范围确定稀释方法:用5-25ul移液器和100-1000 ul移液器,在小试管中进行组合不同的稀释.如牛精液稀释100倍,为5ul原精+500ul稀释液稀释液:3%氯化钠溶液,用以杀死精子,便于计数,三、精液品质检查,注入计数室前各种家畜精液建议稀释比例,b、精液的稀释,三、精液品质检查,c、精液注入计数室,将洁净的计数板放在载物台上固定好,盖上干净的盖玻片取25ul稀释后的精液,将吸咀放于盖玻片与计数板的接缝处缓慢注入精液,使精液依靠毛细作用吸入计数室,三、精液品质检查,注意：让稀释后的精液通过毛细作用自行吸入！,用吸
10、管稀释后精液注入计数室,共有两个对称的计数室,用移液器注入精液,b、精液的稀释,三、精液品质检查,d、精子计数20111008081,将计数板固定在显微镜的推进器内，用100倍放大找到计数室，再用400倍找到计数室的第一个中方格。计数左上角至右下角五个中方格的总精子数，以精子的头部为准，依“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数格线上的精子。,三、精液品质检查,进行精子计数的中方格数可以是四角一中心共5个中方格,也可以是从左角到右下角五个中方格,以图示次序计数，精子的头部为准，依“数上不数下，数左不数右”的原则进行计数格线上的精子。白色精子不计数,三、精液品质检查,计算精子密度,精子密度=5个
11、中方格总精子5101000 稀释倍数,b、精液的稀释,三、精液品质检查,例：牛精子密度测定程序,放计数板于载物台上,取样稀释精液,精液注入计数室,镜检,精子计数,密度计算,计数板和盖玻片一定要清洁,取500ul 3%氯化钠于小试管中,加入5ul原精液,混合均匀,取25ul小心地从计数板与盖玻片的接缝中加入,使其自行吸入计数室中,用100倍和400倍观察,计数五个中方格的总精子数,计数以头部为准,在格线上的数上不数下,数左不数右,精子密度= 5个中方格总精子数5101000 100,将载玻片放在400或600倍的显微镜下进行观察，共记录若干个视野100-200个左右的精子。,附图，正常精子的结构
12、模式图,畸形率=畸形精子数/总精子数,2.3 畸形率,三、精液品质检查,畸形精子（右）,2.3 畸形率,三、精液品质检查,视野中的畸形精子,四、精液的稀释,第一节 人工授精,（一）精液稀释的目的,精液稀释是向精液中加入适宜于精子存活的稀释液。其目的有两个：1.扩大精液容量，从而增加输精头数，提高公畜利用率。2.延长精子的保存时间及受精能力，便于精液的运输，使精液得以充分利用。,四、精液的稀释,（二）精液稀释液的成分及作用,1营养物质 2保护性物质 1)缓冲剂 ：柠檬酸盐，磷酸盐2)防冷抗冻物质：卵黄，甘油 3)抗菌物质 ：短期保存，青霉素，链霉素；长期保存，庆大霉素，先锋，头孢3.稀释剂 ：氯
13、化钠4.其它添加剂 1)酶类 2)激素类 3)维生素类 ：VB12，VB6，VE 4)有机酸、二氧化碳等,四、精液的稀释,（三）稀释液的配制方法,用品的清洗与消毒药品的称量、水的量取基础液的配制：溶解过滤消毒（水浴或直接加热）放凉稀释液的配制：基础液按比例加入抗生素、卵黄 液：按比例加入卵黄和抗生素的稀释液 液：按比例加入抗冻剂,四、精液的稀释,（四）稀释倍数和稀释方法,四、精液的稀释,1稀释倍数确定,精液适宜稀释倍数与家畜种类和稀释液种类有关。确定稀释倍数应根据原精液的质量，尤其是精子的活率和密度、每次输精所需的精子数、稀释液的种类和保存方法。一般牛4-6倍，猪1-3倍，兔3-5倍，鸡5-1
14、0倍。,四、精液的稀释,正确的表示方法： N倍稀释：即1份精液:N份稀释液1:N稀释：意思同上 实际应用表示方法： 稀释后体积是原精液体积的多少倍。因此所谓的N倍稀释，实际上是1:(N-1)，但这种方法有利于进行相关计算。如N倍稀释后，精子密度为原来的1/N，体积为原精液体积的N倍，可分装的份数为： 原精液体积稀释倍数/每份精液体积,1稀释倍数确定,四、精液的稀释,2.普通稀释倍数的计算,稀释倍数=原精液精子密度原精液活力稀释后每份精液的体积/稀释后每份精液中所含的有效精子数,四、精液的稀释,3.冷冻精液稀释倍数的计算,四、精液的稀释,4稀释方法,1）精液经检查合格后应立即进行稀释，越快越好。
15、2）稀释时，稀释液的温度和精液的温度必须调整一致，以30-35为宜。3）稀释时，将稀释液沿精液瓶或插入的灭菌玻璃棒缓慢倒入，防止剧烈震荡。4）若作高倍稀释，应先低倍后高倍，分次进行稀释。5）稀释后立即镜检，活力应和稀释前一样。6）稀释后精液立即进行分装（一般按一头母畜的输精量）保存。,四、精液的稀释,5.冷冻精液稀释,第一次稀释倍数的计算：应为最终稀释后体积的50%。第二次稀释为1:1稀释 意义：总稀释倍数受总有效精子密度的影响，第二次稀释时，稀释液中含有防冻剂，而防冻剂应在稀释后在精液中含有固定的浓度。最后一次稀释时，1:1稀释，可以保证稀释后防冻剂的浓度为液的1半。这样无论总稀释倍数是多少
16、，最终精液中含的防冻剂浓度是不变的。,四、精液的稀释,五、精液保存,第一节 人工授精,（一）精液的保存方法,现行精液保存的方法按保存的温度分：常温保存（15-25）低温保存（0-5）冷冻保存（-79- -196）三种。按精液的状态分：液态保存：常温保存和低温保存温度都在0以上，故称液态精液保存冷冻保存：超低温保存精液以冻结形式作长期保存，故称冷冻精液保存。,五、精液保存,（二）低温保存,原理：低温能抑制精子的代谢和微生物的繁殖，但迅速降温会使精子遭受冷休克，加低温保护剂和缓慢降温并保持较低温度，可使精液保存数天。稀释液主要成分：抗生素、15-25%的卵黄、基础液保存方法：用纱布包数层于装冰块的
17、保温瓶中或冰箱中保存。保存温度： 2-5,五、精液保存,低温保存的关键性环节,1、含卵磷脂、抗生素的稀释液2、等温稀释3、缓慢降温4、保持恒温（2-4 ）5、在保质期内使用，用前进行活力检查,（二）低温保存,五、精液保存,（三）常温保存,原理：精子自身所产生的酸性物质和稀释液中的酸性物质使精液的pH降低到一定的水平，能够抑制精子的代谢，从而延长精子的存活时间。抗生素能够抑制微生物的繁殖。稀释液成分：抗生素、单糖、缓冲剂保存温度： 15-25,五、精液保存,常温保存的关键,1、含缓冲剂、营养、抗生素的稀释液2、等温稀释及缓慢降温3、保持恒温（15-25）4、防止精子沉淀堆积时间过久5、在保质期内
18、使用，用前进行活力检查,（三）常温保存,五、精液保存,六、输精操作,第一节 人工授精,（一）输精前的准备,六、输精操作,1. 输精器械的准备,与精液接触的用品，必须经过清洗、消毒灭菌，并且不能有任何不利于精子存活的化学物质残留。用前最好用稀释液或生理盐水冲洗，确保对精液无毒害作用。 最好一头母畜准备一个输精枪或枪头，一次性输精器只能一畜一支。 开膣器最好一畜一个，用前在消毒剂中浸过，用凉开水冲过后，放入干燥箱中干燥后，放凉使用（冬季应防止过冷）。,六、输精操作,2. 精液的准备,输精前应将精液准备好，应确定精液品质符合要求方可用输精大剂量低温或解冻后精液，应将温度升至20-30后输精常温保存精
19、液不须要升温小剂量冷冻精液也应正确解冻后输精,六、输精操作,3. 母畜的准备,牛、马、羊等家畜输精前应进行保定，以确保顺利输精。大家畜可保定在输精栏内或六柱保定架内，羊也可倒提保定。猪输精前应对母猪进一步发情检查，并刺激相应部位，以促进母猪产生宫缩，有利顺利输精。由助手将动物的尾部拉向一侧，马输精前应将尾毛用绷带扎好，防止带入阴道内。输精前应将母畜外阴部用肥皂水清洗后，用清水洗净，擦干。母猪的外阴可用干纸巾擦净即可。,六、输精操作,4. 输精人员准备,输精人员可戴一次性长臂或PE手套操作，也可洗净双手即可。操作人员应指甲剪短，锉光马输精时手要伸入阴道内，手臂应用75%酒精消毒凉干后，涂少量石蜡
20、油牛输精时，手臂要伸入到直肠内，应清洗双手，戴长臂手套醮少量水或石蜡油或肥皂水，也可不戴手套操作。,六、输精操作,（二）输精操作,1 牛的输精2 羊的输精3 猪的输精,六、输精操作,1 牛的输精,1.1 开膣器法1.2 直肠把握子宫颈深部输精法,六、输精操作,子宫颈口,尿道口,膀胱,卵巢,子宫颈,子宫体,六、输精操作,1 牛的输精,对母牛进行发情鉴定，母牛发情结束，不再爬跨其它母牛，精神趋于稳定时输精。将母牛保定，尾部拉向一侧，外阴用高锰酸钾水棉球擦拭，并擦干。将冷冻精液解冻，剪去封口端，剪口端向前放外套管中，输精器通针向后拉出15厘米。将外套管套在输精器上。分开外阴，将套管连同外塑料膜向前上
21、方伸入阴道10厘米，将输精器捅透外膜。,六、输精操作,1 牛的输精,左手（或右手）戴上长臂手套涂少量石蜡油伸入直肠，排出宿粪。手伸至直肠狭窄部后，将直肠向后移，向骨盆腔底下压，找到子宫颈（棒状，质地较硬有肉质感，长约10-20厘米）。手移至子宫颈后端（子宫颈阴道部），使子宫颈呈水平方向，并用力将子宫颈向前推，使阴道壁拉直，方便输精器向前推进。右手将输精器前端伸到子宫颈外口附近，左手配合，使前端对准子宫颈外口。左右手配合，上下调整，使输精器前端进入子宫体内。,六、输精操作,1 牛的输精,等确认输精器到达子宫体时（短距离前后移动时，没有明显阻力），不要再向前推送输精器。将精液缓慢注入，并慢慢抽出输
22、精器。注意：输精器插入阴道时，应向前上方。当遇到阻力时，切忌用蛮力。输精器插入子宫颈管时，推进力量要适当，以免损伤子宫颈、子宫体粘膜。如果输精器后端为胶头，将精液压子宫内后，不要松开胶头，以免精液流回输精器内。,六、输精操作,六、输精操作,牛直肠把握子宫颈输精示意图,六、输精操作,直把输精示意图,六、输精操作,2 羊的输精,六、输精操作,2.1 羊输精前准备,用试情公羊对发情母羊进行发情鉴定，发现允许试情公羊爬跨的母羊应进行标记，并安排输精时间在母羊允许公羊爬跨后的6-12小时第一次配种将母羊保定在保定架内或着将其倒提，前肢着地。消毒外阴部，开膣器上涂以石蜡油。,六、输精操作,2.2 羊输精操
23、作,将开膣器侧扁方向与阴道呈同一方向，插入母羊阴道内，向下转动开膣器，并保持打开状态。将准备好的输精器前端对准子宫颈外口，伸入1厘米或更深。将精液缓慢注入后抽出。注意：开膣器应保持开张状态，以免夹伤阴道粘膜。如果无法找到子宫颈口，应拨动粘液，使子宫颈口暴露。如果仍无法确认，可将精液注入颜色较深的区域。,六、输精操作,开膣器,羊的输精,3 猪的输精,六、输精操作,3.1 输精时间掌握,用种公猪试情的，后备母猪发现发情，24小时后作第一次输精，间隔12小时第二次输精；经产母猪发现发情12小时后第一次输精，12小时后第二次输精。地方品种均推迟6小时。无种公猪试情的，后备猪压背反应后6-12小时，经产
24、猪立即输精，地方品种均推迟6小时。,六、输精操作,3.2 输精清单,拿到消毒过的输精导管存储精液在16-20的恒温箱中每天都用公猪检查发情次在出现静立发情的当天进行第1次输精清洗双手清洁母猪阴户、润滑输精导管，将输精导管向上、向前插入阴道并按逆时针方向旋转直到锁定摇动输精瓶几次，充分混合精液，剪掉输精瓶的顶端慢慢地向输精瓶加压：输精将要持续5-10分钟,六、输精操作,3.2 输精清单,精液流出阴户时，要重新锁定输精导管 使用后，立即用清水和去离子水清洗输精导管记录公母猪耳号间隔12-24小时后重复输精蒸煮10分钟消毒输精导管避免使用洗涤剂和消毒剂来清洗人工授精设备将输精导管头部向上挂在有热空气
25、处使其干燥当输精导管内外部干燥后，保存在清洁的输精导管袋中第二次输精时要用不同的、清洁的、干燥的输精导管,六、输精操作,3.3 输精操作,擦拭外阴部,六、输精操作,3.3 输精操作,在输精器上涂润滑剂,六、输精操作,分开外阴将输精器前端向上呈45度角向左旋转插入母猪阴道内,3.3 输精操作,六、输精操作,3.4 输精过程,六、输精操作,六、输精操作,七 精液冷冻保存技术,第一节 人工授精,（一）精液冷冻概述,1950年英国科学家Polge和Smith采用卵黄和甘油作保护剂，用干冰作冷源进行精液的冷冻，解冻后授精成功，开创了世界人工授精的新时代。到90年代，发达国家的全部奶牛和绝大多数肉牛采用冻
26、精输精。精液冷冻保存成为最可靠的保存方法。精液冷冻保存是目前精液保存最有效的方法。,七、精液冷冻保存技术,（二）精液冷冻的原理,1、超低温使精子处于零代谢状态，升温后能使精 子复苏并且不失去受精能力。2、但精子冷冻过程会由于形成冰晶使精子受到损害，这些损害包括：精子外的水分先形成冰晶，而形成精子内外的渗透压差，导致精子水分外渗，精子内渗透压增高，电解质浓度提高，酸碱失去平衡。冰晶的形成造成：产生机械压力，导致细胞表层破坏精子内部冰晶，破坏精子结构,七、精液冷冻保存技术,3、如果在冷冻过程只形成微小冰晶，即玻璃化状态，则精子就不容易受到损伤，解冻后能恢复活力。4、形成玻璃化状态的条件：防冻剂干扰
27、晶格排列，不形成“过冷溶液”快速降温，使水分子来不及移动和排列，就失去了能量，不形成“过冷溶液”快速降温使液体只能形成极微小的“微晶”,（二）精液冷冻的原理,七、精液冷冻保存技术,5、保存和解冻过程的变化：冰晶很微小，所以表面能很高，微晶总是力图合并成大冰晶。一旦吸收一定的能量，冰晶就会合并成大冰晶，从而使精子受到破坏。保存过程中，即使冻精温度只升高到-60，也可能使精子死亡。冻精在解冻时也需要快速升温，才能保证防止微晶在解冻过程中形成大冰晶。,（二）精液冷冻的原理,七、精液冷冻保存技术,（三）精液冷冻的稀释液,低温保护剂：糖类：蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖卵黄、奶类冷冻保护剂：甘油、二甲基亚砜、
28、乙二醇抗生素类： 庆大霉素、青霉素、链霉素等,七、精液冷冻保存技术,（四）冷冻精液稀释液的组成,基础液：由糖类和盐类、水配制的等渗液第一液：由基础液和卵黄（15-20%）组成的低 温保存稀释液。用于在33下稀释和逐步降温。第二液：由第一液和甘油或其它防冻剂组成。甘油含量通常比稀释后浓度高一倍。用于精液的第二次稀释（2-4 ）,七、精液冷冻保存技术,（五）解冻液的配制,一般采用2.9%的柠檬酸钠作解冻液猪的冻精解冻液用常温保存稀释液BTS也可用VB12注射液作解冻液如果解冻液中加入2mmol的咖啡因有利于提高受胎率,七、精液冷冻保存技术,(六) 冷冻精液的程序,1、采集精液。2、品质检查：精液的
29、密度和活力都必须符合要求。3、稀释前处理：羊、猪的精液在稀释前进行离心或清洗（羊）有利于提高解冻后活力。4、稀释：可采用一次稀释也可采用二次或三次稀释。最常用的是二次稀释。,七、精液冷冻保存技术,5、稀释第一次稀释：在30温度下，根据计算的稀释倍数进行第一次稀释，放在500毫升的烧杯中与第二液一起缓慢降温至2-5 。第二次稀释：在2-5 下进行6、平衡：是精液与防冻剂（甘油）相互作用的时间。一般2-4小时。7、分装：冻精的剂型有细管（0.25ml、0.5ml），安瓿（2.5ml、5ml)、颗粒（0.1ml）、袋装等。,(六) 冷冻精液的程序,七、精液冷冻保存技术,8、冷冻：冷源：干冰（-79
30、）、液氮（-196 ）冷冻用品：冷冻面：铜网、氟板（聚四氟乙烯）、铝板冷冻槽：广口液氮罐、液氮槽钢匙、镊子、低温温度计冷冻方法：干冰埋藏法液氮熏蒸法,(六) 冷冻精液的程序,9、解冻检查：活力0.3以上,七、精液冷冻保存技术,精液冷冻仪,七、精液冷冻保存技术,（七）颗粒冻精的制作,七、精液冷冻保存技术,1 冷冻条件,冷源：液氮或干冰冷冻面：可以用铜网、聚四氟乙烯板、铝板等冷冻温度：-98- -110 液氮槽,七、精液冷冻保存技术,2 颗粒冻精制作流程,冷冻面的预冷：将冷冻面放入液氮中浸数分钟，待不再有大量气体放出时，取出，架在液氮面上1.5cm高处，数分钟后即可冷冻。冻前精子活力检查：平衡的精
31、液应进行活力检查，如果活力合格方可滴冻。滴冻：预冷至2-4 的滴管吸取精液，均匀地滴在冷冻板上，并使之间距为一个颗粒直径。每个颗粒0.1ml。,七、精液冷冻保存技术,2 颗粒冻精制制作流程,滴冻练习：每次用取样器取1ml精液，将其滴成10个大小相等的颗粒。熏蒸：一块冷冻板滴满后，可将冷冻板面加盖（也可不加）。将冷冻板浸入液氮：并用预冷后的不锈钢勺将颗粒铲下，倒入下面的网面上。将纱布袋浸入液氮中，将一塑料漏斗口插入纱布袋中。取出液氮中的纱网将颗粒冻精倒入漏斗中。,七、精液冷冻保存技术,2 颗粒冻精制制作流程,取样解冻检查精子活力。将纱布袋口抽紧，在袋口的线上作好标记。将提漏从液氮罐中取出，放入液
32、氮槽中，将纱布袋放入提漏中。将提漏迅速放入液氮罐中。,七、精液冷冻保存技术,3 颗粒冻精液制作要求,形状一致，不连片，大小均匀，体积0.1ml无气泡（在液氮中不漂浮）解冻后活力0.3以上总有效精子数1200万个（牛）每ml中不得检出大肠杆菌,七、精液冷冻保存技术,（八）细管冻精的制作,七、精液冷冻保存技术,1 细管冻精的优点,封闭包装，卫生安全：保存、输精时不与外界接触便于标记取出方便：直接用镊子夹取解冻方便：直接投入水浴中解冻输精方便：可安装在专用的输精枪内输精,七、精液冷冻保存技术,2 细管冻精的缺点,制作成本高必须进行大规模生产才有意义,七、精液冷冻保存技术,3 细管分装,常温分装：一次
33、性稀释后进行分装标记，然后 进行精液降温与平衡 优点：不需要低温操作台 缺点：对精子损害较大低温分装：在第二次稀释后进行分装标记，然 后进行平衡，最后冷冻。 优点：对精子损伤小，解冻后活力大 缺点：对设备要求高,七、精液冷冻保存技术,4 细管冻精的冷冻,1、大口径液氮罐冷冻 将平衡后的细管用毛巾擦净，放入铜网上，将铜网降至距液氮面10cm的高度10分钟后沉入液氮中，取出分装在提漏内，放入液氮罐中。2、程序冷冻仪冷冻,七、精液冷冻保存技术,5 细管冻精的要求,细管上要对供精者的场家、号码、生产日期进行标记容量0.25,0.5,5ml不等，牛细管冻精一般为0.25ml每剂有效精子数1000万个活力
34、0.3以上其它同颗粒冻精,七、精液冷冻保存技术,（九）冻精的解冻,解冻温度：有冰水解冻，30-40 解冻，高温（50-75 ）解冻，以第二种方法最常用解冻后温度：5-8解冻后保存：在2-5下或冰瓶中可保存12小时以上。,七、精液冷冻保存技术,1、解冻方法,湿解冻法：在试管中加入0.5-1ml解冻液，升温到30-40 ，投入一粒冻精，摇动并取出干解冻法：先将试管预热至30-40 ，投入冻精颗粒后，至融化一半时，取出加入20-30 的解冻液细管冻精解冻：将细管从液氮罐或液氮槽中取出，投入30-40 的水中至融化一半时取出用手搓至完全融化或用体温解冻,七、精液冷冻保存技术,2、细管冻精的解冻,将水浴
35、温度调整到40 将提漏提至罐口下3-5cm处，用镊子夹住细管的超声波封口端迅速移入水浴中不断摇动，3-4秒后全部变色后取出，用手搓动使之全部解冻,七、精液冷冻保存技术,3、颗粒冷冻精液的解冻,取2.9%的柠檬酸钠0.5ml放入灭菌的平底试管中将试管放入40 的水浴中预温1分钟将液氮倒入广口保温瓶或泡沫塑料槽中将液氮罐的提漏提至罐口下3-5cm处，看清标记后，将纱布袋取出放液氮槽中将镊子放入液氮中预冷片刻，夹取颗粒冻精后，迅速投入试管中，并摇动试管，至冻精解冻至绿豆大小时取出，摇动至全部融化。,七、精液冷冻保存技术,（十）冷冻精液的保存,冻精（颗粒）应进行标记：公畜名（号）、采精日期、容量。保持
36、液氮罐中液氮面高度。接触冷冻精液的用品都要进行预冷。在冻精进行转移时，应尽可能减少在空气中暴露的时间。如果是颗粒冻精应先移入液氮槽中再解冻。液氮罐应放在凉爽通风处，避免放在高温或通风不畅的地方。液氮罐在运输中应防止暴晒和碰撞。,七、精液冷冻保存技术,Embryo transfer20111010081,第二节 胚胎移植,一 胚胎移植概述二 胚胎移植的原理三 胚胎移植的技术程序四 牛的胚胎移植五 羊胚胎移植,第二节 胚胎移植,一、 胚胎移植概述,1.胚胎移植的定义2.胚胎移植的历史3. 胚胎移植技术的意义,1.胚胎移植的定义,胚胎移植又称受精卵移植，俗称人工授胎或借腹怀胎，是指将雌性动物的早期胚
37、胎，或者通过体外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。,2.胚胎移植的历史,一、胚胎移植概述,1.1 初始阶段：1890-1900 W.Heape将安哥拉兔和荷兰兔的受精卵分别移植到比利时兔的输卵管内，分别获得仔兔2只。,1.2 初级阶段：1900-1950 主要由英美科学家在家兔、绵羊、山羊小家畜方面研究，成功率35%左右。,一、胚胎移植概述,1.3 发展阶段：1950-1970 日本首次在牛胚胎移植上成功，之后日、美采用非手术法移植成功。胚胎移植成功率达70-80%。,一、胚胎移植概述,1.4 实用化初始阶段：1970-198
38、0 加美开始成立牛胚胎移植公司，1973年牛冻胚移植成功（英）。,一、胚胎移植概述,1.5 实用化研究阶段：1982大规模胚胎移植、核移植、嵌合体、胚胎分割、性别鉴定、体外受精在英美日德广泛开展。克隆羊诞生。,一、胚胎移植概述,3 胚胎移植技术的意义,一、胚胎移植概述,从低产母畜得到高产后代。加速引进品种的繁殖和新品种的培育。比用现有品种进行长期杂交育种更为经济有效。加速家畜改良进度。通过超数排卵和胚胎移植技术可使供体繁殖的后代增加7-10倍。增加双胎率，加速繁殖。,使不孕母畜获得生育能力，对因解剖或内分泌缺陷而不能妊娠的母畜，可以根据具体情况专门作为供体或受体，继续发挥其繁殖作用。促进基础理
39、论方面的研究，为繁殖生理学、生物化学、遗传学、细胞学、胚胎学、免疫学、动物育种和进化等方面开辟了新的试验研究途经。满足畜牧业现代化的需要。,3 胚胎移植技术的意义,一、胚胎移植概述,挽救濒临灭绝的野生动物方面，胚胎移植技术越越来发挥出重要作用。胚胎移植技术是许多现代技术的基础：如克隆技术、试管婴儿、转基因及动物生物反应器研究。,3 胚胎移植技术的意义,一、胚胎移植概述,二、胚胎移植的原理,1.胚胎移植的生理学基础2.胚胎移植的基本原则,第二节 胚胎移植,激素同期发情,1 胚胎移植的生理学基础,成年母畜卵巢上存在数千到上万个卵泡，在外源激素作用下，每个发情期的卵泡发育和排卵数可达十多个。早期胚胎
40、处于游离状态。胚胎发育不存在免疫问题。胚胎发育到一定阶段会与子宫发生生理和组织上的联系。胚胎的遗传性不受受体的影响。,二、胚胎移植的原理,2 胚胎移植的基本原则,胚胎移植前后所处的环境的同一性；供体和受体在分类学上的同属性；动物生理上的一致性；受体和供体在发情时间上的同期性；动物解剖位置上的一致性；空间环境的一致性。胚胎的发育期限：必须处于周期黄体期内胚胎的质量：胚胎必须是正常的，并在处理过程中不受不良因素的影响,二、胚胎移植的原理,三、胚胎移植的技术程序,1. 供体和受体的选择2. 供体的超数排卵3. 同期发情4. 供体母畜的配种5. 收集胚胎6. 胚胎的保存与培养7. 移植胚胎,第二节 胚
41、胎移植,1 供体和受体的选择,供体应具有相当高的育种价值。供体生殖机能应处于较高的状态：产后60天以上，无生殖系统疾病，体质强健。受体应容易购买，繁殖性能好，对地方适应性强，体型中上等，非优良品种。受体健康状况良好，已进入发情季节。供受体发情时间应接近或一致。,三、胚胎移植的技术程序,2 供体的超数排卵,通常用于单胎家畜，其主要目的是让优良母畜排出大量卵子，充分发挥繁殖潜能。通常采用PMSG或FSH，以促进卵泡的发育。第一次配种后静脉注射hCG或LH，可排出多数卵子。,三、胚胎移植的技术程序,3 同期发情,为了胚胎移植成功，使供体受体发情同期化，让两者的生殖器官处于相同的生理阶段是必须的步骤。
42、发情时间应该控制在12h之内。诱发同期发情的首选理想药物为PGF2及其类似物。,三、胚胎移植的技术程序,4 供体母畜的配种,必须用优秀的种公畜进行多次配种，一般隔8-12小时进行一次配种，直到发情结束。配种前应对种公畜的精液进行质量检查。当优秀种公畜不足时，可考虑首次采用本交，以后采用人工授精，也可以全部采用人工授精。,三、胚胎移植的技术程序,5 收集胚胎,胚胎冲洗液的配制：杜氏磷酸缓冲液PBS，布林斯特液SOF合成输卵管液。手术法收集胚胎输卵管冲胚：顺向冲胚、逆向冲胚子宫角冲胚非手术法收集胚胎二路法三路法,三、胚胎移植的技术程序,收集到的冲洗液静置，冲洗液分离。拣胚：将胚胎移至培养液或保存液
43、中。胚胎鉴定：根据透明带、胚胎细胞、发育阶段及细胞在透明带中的比例确定胚胎级别。,三、胚胎移植的技术程序,胚胎的降温：使胚胎停止发育，延长其体外生存时间。体外培养：将胚胎置于体温条件下，在培养液中，使其继续发育。胚胎冷冻：通过一定的处理程序，将胚胎降温冷冻后，保存于液氮中。,6 胚胎的保存与培养,三、胚胎移植的技术程序,手术法移植（羊、犬、猪）非手术法移植（牛）,7 胚胎移植,三、胚胎移植的技术程序,1 供体牛的选择2 超数排卵处理3 采卵（胚）,4 检卵（胚）5 胚胎的鉴定和分级6 胚胎的移植,第二节 胚胎移植,四、牛的胚胎移植,应符较高的生产性能。1.58岁，体格健壮，无遗传性疾病，繁殖机
44、能正常。产犊记录清楚，无流产史，产后有两次正常发情记录。生殖器官正常，无繁殖疾病。重复超数排卵间隔60d左右。最多连续处理4次后，自然繁殖后再使用。凡2次超数排卵反应差的母牛不再用作供体。应选择性情温顺的母牛作供体，以便于操作。,四、牛的胚胎移植,1 供体牛的选择,2 超数排卵处理,四、牛的胚胎移植,2.1 FSH法,四、牛的胚胎移植,2.2 PMSG法,孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法 在情期的1112d，一次肌注PMSG25003000IU，48h后宫注PGF22.4mg。发情后约18h肌注等量的抗PMSG。,四、牛的胚胎移植,2.3 发情观察和配种,PGF2处理后4048h，大部分处
45、理牛发情。通常要求从注PG第2天傍晚开始观察发情，至少早晚各观察一次。在观察到接受爬跨后46h进行第一次输精，间隔12h后第二次输精。每次有效精子数不得少于50106，输入两侧子宫角或子宫体。注意输精时不得触摸卵巢。,四、牛的胚胎移植,3 采卵（胚）,四、牛的胚胎移植,3.1 采卵时间,以发情日为第0d，在第56d检查卵巢确定黄体数，以便于安排受体头数。第7d(或第68d)非手术回收卵。,四、牛的胚胎移植,3.2 器械和冲卵液的准备,灭菌处理过的冲卵管用PBS液冲洗23次，插入钢芯，检查气球。在无菌间用导管连接吊瓶和集卵杯灌流装置。装入PBS液的吊瓶在37水浴中预温待用。准备好必要的麻醉剂、注
46、射器、酒精棉球和冲洗消毒剂等。,四、牛的胚胎移植,3.3 供体牛的保定和麻醉,供体牛保定完毕后，在第一、二尾椎骨间酒精消毒，用2%普鲁卡因35ml作硬膜外麻醉，或肌注2%静松灵l ml。,四、牛的胚胎移植,3.4 外阴清洗、消毒,麻醉后将牛尾竖直绑在保定架上，清除粪便，用清水冲洗会阴部及外阴，再用高锰酸钾液冲洗消毒，用灭菌卫生纸擦干，最后用酒精棉球消毒外阴部。,四、牛的胚胎移植,3.5 冲卵管的插入和冲卵部位,助手将准备好的冲卵管交给术者的右手，术者左手食指和拇指压开阴门插入冲卵管，再将左手伸入直肠，仔细小心地诱导冲卵管经子宫颈进入一侧子宫角至大弯处，抽出少许钢芯，再将冲卵管向前推，使其尖端靠
47、近子宫角深部。由助手持30ml注射器一次推入10ml空气，然后按术者要求，以1ml计数充气。根据子宫大小及冲卵管在子宫的位置确定充气量，一般青年牛充气1416ml，经产牛为1825ml。冲卵管固定后抽出钢芯，开始灌流。,四、牛的胚胎移植,3.6 灌流方法,将吊瓶挂在距外阴部1.0m高处，接通三通管(Y型)和冲卵管。术者用右手控制进流和出流开关，每次灌注3050ml，由少到多，每侧总量为300500ml。左手通过直肠辅助按摩子宫角。每侧子宫角冲810次。或者用50ml注射器，每次注入3050ml的PBS冲卵液，分次冲洗子宫角，回收后注入加盖量筒。另一侧子宫角的冲洗是由术者右手拉直冲卵管，助手小心插入钢芯。术者的左手在直肠内诱导钢芯插稳后，给气球放气。术者再将冲卵管插入另一侧子宫角，用同样的方法冲洗。全过程需在室温(20左右)操作。,四、牛的胚胎移植,四、牛的胚胎移植,3.7 术后处理,两侧子宫角冲卵完成后，从气球放出一部分空气，将冲卵管抽至子宫体灌注土霉素溶液(3g土霉素粉溶于100ml灭菌双蒸水或生理盐水)或10ml青霉素(80万u)和链霉素(100万u)，拔出冲卵管。,四、牛的胚胎移植,4 检卵,四、牛的胚胎移植,
