1、1液相色谱串联质谱联用仪检测技术实 验 指 导（2014、2015 级）课程内容（一个实验 8 学时）：（1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。（2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中 7 种农药的残留量。吉林农业大学 农业部参茸质检中心2017.032实验一 AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱 液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用一 .实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严
2、谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识） 。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。（一）检测仪器 1、 仪器名称 高效液相色谱串联质谱联用仪（简称 LC-MS-MS） 。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems 公司） 。2、 仪器组成 液相色谱部分：岛津 LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分： QTRAP4500，配有 ES
3、I 离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、 主要性能指标 离子化方式：ESI 电离 质量范围：（5 1700）amu 分辨率： 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM 扫描（m/z : 609/195） ，信噪比 S/N 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度： 0.01% （全质量数范围）4、 方法原理 高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以 ESI 或 APCI
4、 方式电离，被加速后进入质量分析器。 4500QTRAP 的质量分析器主要由 Q1、Q2 、Q3 三组四级杆串联组成。 Q1 可将分子离子按质荷比（m/z ）大小分开；Q2 是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3 具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。 4500QTRAP 通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以
5、对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由 PC 计算机 Windows 操作系统支持下的 Analyst 软件控制完成。 3（二）样品 1、样品要求 本仪器适合分子量在 5 1700 amu 范围内的有机样品的定性及定量分析。待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中。若样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现象时，应重新取样或重新配制溶液。 2、试剂要求 所有的试剂均选用色谱纯级，所用水的电导率应大于 18K。流动相必须用0.2m 或 0.45m 滤膜过滤后方可使用。 3、分离条件要求 在液相色谱仪上确定分离条件，使待测组分能完全分离，且该色谱条件中流动
6、相不应含有不挥发性盐，如磷酸盐。 （三） 、操作步骤 实施检测操作的人员，必须熟悉该仪器的操作规程，仪器的工作状态、包括检测灵敏度和分辨率，必须满足检测项目的要求。1、 开机前准备 开机前应检查仪器室内电、气的供应情况及空调机的工作状态是否稳定，检查真空机械泵泵油是否需要更换。只有当 UPS 工作正常，Gas1/Gas2 、Curtain Gas 和 Exhaust Gas的压力分别稳定在 0.35、0.35 和 0.7 Mpa，环境温度为 1030，相对湿度小于 70%时才能开机。2、开机 1) 打开真空机械泵上的电源开关。 2) 真空机械泵继续工作至少 15 分钟后，打开MS 电源主开关。
7、 3) 等真空度达到 210-5Torr（绿色指示灯不闪）后，打开 PC 计算机电源3、仪器调谐 （四） 、方法建立1.在 Analyst 软件 Tools 菜单中选择 ProjectCreate Project。在 Project name 项下输入新建的Project 名称。注意，不要点选窗口中的其他按钮！点击 OK，确认新建 Project。2.在 Analyst 软件界面下，双击导航栏内 Hardware Configuration。在弹出窗口中选择MassOnly，点击 Activate Profile，激活 MassOnly（只联接质谱主机） 。3.在导航栏内单击 Tune and
8、 Calibrate，进入调谐模式。点击上方工具条中的 T 钮。此时，应注意到主机有“扑 ”声音，表明进入调谐状态。此时右下角质谱状态显示绿色。双击 Manual Tuning，进入质谱参数设置及运行窗口。4.使用 1mL 玻璃进样针吸取适当标准溶液，置于进样针座上。点击 MS Method 下拉菜单，选择 Syringe Pump Method，设定针泵流速 Flow Rate 为 10L/min。5.点击 Start Syringe Pump 按钮开针泵进样。6.返回 MS Method，选择扫描模式 Scan Type 为 Q1 MS，设定扫描速度 Scan Rate 为 10Da/s，
9、设定扫描范围 StartStop 设定为 50化合物分子量。 DP 预输入 60。7.点击 start 开始采集数据。运行稳定后，注意观察是否有预期的母离子出现，并控制其响应值4在约 E4 以下。点击 stop，选择第一个峰（后面是同位素峰）的平稳段，双击，选中母离子。点击右键，选择 Delete Pane。8.设定 Scan type 为产物离子扫描 Product Ion（Ms2） ，扫描速度 200Da/s，选择扫描正/负离子，输入母离子（product of） ，设定扫描范围 startstop 为 50MW+20，覆盖可能的子离子质量范围，点击 compoud 标签，设定（DP）60
10、， （CE ）5。9.点击 start，开始采集数据，注意观察是否有预期的母离子出现。手动调节 CE，以 5eV 为步长，逐渐增加。每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子清晰看见。选择平稳的一段，双击，选择子离子。10.选择 Scan Type 为 MRM。设定参数表格中的 Q1 对应的母离子， Q3 对应的子离子，time（ms）为 50，ID 值设为名称 1（定量） ，名称 2（定性） 。11.点击 Edit Ramp，在 Parameter 下选择 Collision Energy，点击 OK。点击 start 开始采集数据，记录每个 MRM 通道的最佳 CE 电压。在 MRM 参数
11、设定表中，右键点击。选择 Collision Energy CE，调出表格中的 CE 列，输入每个 MRM 通道的最佳 CE 电压值，精确到个位数。重复以上步骤，在 Parameter 项下选择 Declustering Potential，优化并保存 DP。完成后选择菜单 File/Save 保存采样方法， 文件名.dam。（五）LCMS 方法的建立：1、连接仪器：打开 HPLC 质谱电源，将 HPLC 系统接上柱子，将 6 号出口管线与离子源连好。调离子源喷雾针位置到 2mm 处，双击 Hardware Configure，在硬件配置菜单下单击 LCMS ( 液相与质谱联用 )，单击 Ac
12、tivate profile 激活仪器，会听到笛的一声，说明仪器已经连接上。2、确认液质同步：选择项目（之前优化方法的时候已经建立的项目） ；双击 Build acquisition method 新建方法，弹出新建方法模板。在模板左侧点击 acquisition method，模板右边显示对应的参数，确认 synchronization mode 选择 LC Sync,表示液质同步。3、设置 MRM 参数：点击方法模板左侧的 MRM, 在模板右侧 Scan Type 下选择 MRM；在polarity 下选择化合物极性：Positive(正离子) 、Negative（负离子） ；Durati
13、on 为 15min(与液相分离相同的时间)；表格中 Q1：母离子分子量，Q3(Da)：子离子分子量，Time （msec ）：50，ID 栏：化合物名称（离子对名称后空格加 1 为定量，空格加 2 为定性） ，在表格中右键分别单击DP、 CE，点击工具栏的 OPEN 打开之前优化的方法参数，调出 DP,CE 值，选中整行，Ctrl+c(复制)参数，关闭窗口，再 Ctrl+v(粘贴 )参数） ；最后点击 Edit parameter 设置离子源参数：Source/Gas 项用以下推荐值：CUR 35，IS:5500(正离子) 或-4500（负离子） ，TEM 600，GS1 60，GS270，
14、点击OK。54、设置液相参数：点击模板左边的 shimadzu LC system，在右边的 pumps 栏下，设置 stop time （运行时间）为 15min， flow 流速为 1mL/min，A 为水相设为 95%，B 为有机相设为5%（设置时改 B，A 自动） ，泵最大压力为 50；点击 time program 设置液相梯度：例咪唑类梯度设置：Time(min) A B- 95% 5%5 5% 95%10 5% 95%10.1 95% 5%15 95% 5%接着在右边的 Auto sampler 栏下，设置清洗时间，在 Rinse mode 下选择 Before and afte
15、r(前后都洗) ，并设置清洗时间为 5s，清洗液用 50%甲醇水。最后点击保存按钮 ,在保存窗口输入该方法的名称。（五）数据处理双击打开 Multiquilt，选择项目，点击 File 下的荧光棒型图标，点击 sample，选择需要的标准品和样品数据，点击 next，create new method，为方法命名，点击 next，选择一个有代表性的样品（一般选择浓度较大的标品数据） ，设置分组（同一物质定量离子和定性离子设置为一组） ，并指定内标，next，对每个物质进行积分。设置积分参数：CausianSmoth（平滑）：一般是 0，如有毛刺可改成 1 或 2；Expeceted Time（
16、保留时间）: 一般不动Expected time 范围：一般 30s，表示在保留时间15s 范围最小峰宽最小峰高背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积，比例越高积分越往下，必要时调整。分峰因子：峰有分叉时设置，如有两个分叉，设置为 2，峰分叉不能大于 2单位：设置单位，勾选 Apply units to all 可将此单位用于所有化合物点击 next，点击 finish。在新跳出窗口内将标准品选定，输入浓度。查看各化合物积分是否正常，点击第三个图标查看标准曲线。6实验二 利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中 7 种农药的残留量1 实验目的：1.1 让学生了解利用液相色谱质谱联用仪测
17、定食品、农产品中农药残留等有害化合物的分析流程。1.2 利用前 2 节课所学内容实际处理样品，增强学生实践能力。1.3 进一步加强液相色谱质谱联用仪的操作和数据处理。2 试剂或材料除非另有说明，仅使用分析纯试剂，水为 GB/T 6682 规定的二级水。2.1 乙腈(C 2H3N)：色谱纯。2.2 氯化钠(NaCl)：140 干燥 4 h。2.3 氨基固相萃取小柱：500 mg/6 mL(或性能相当的其它固相萃取柱)。2.4 二氯甲烷-甲醇混合液: 二氯甲烷+甲醇（体积比）= 95 + 5。2.5 标准品：见表 1。2.6 农药标准溶液配制2.6.1 标准储备溶液分别准确称取一定量（精确至 0.
18、1 mg）农药标准品，用甲醇溶解，逐一配成 1000 mg/L 的单一农药标准储备液，密封贮存在 -18 冰箱中，使用期为 6 个月。表 1 9 种农药标准品农药名称 纯度（%）多菌灵 98吡虫啉 98啶虫脒 98辛硫磷 98阿维菌素 98克百威 98嘧霉胺 982.6.2 混合农药标准溶液分别准确吸取一定体积的 9 种农药标准储备溶液（4.8.1）注入同一容量瓶中，用甲醇稀释至刻度配制成 100 mg/L 的混合标准储备液，-18 冰箱中密封闭光保存，使用期为 3 个月。72.6.3 混合标准工作液吸取一定体积的混合农药标准储备液，用甲醇配制成 0.01mg/L、0.05 mg/L、0.1
19、mg/L、0.2 mg/L、 1.0 mg/L、5.0 mg/L 的 7 种农药混合标准工作液，贮于 4 以下冰箱中，需现用现配。3 仪器设备3.1 电子天平：感量 0.01 g；3.2 破壁食物料理机：不低于 20000 r/min；3.3 均质机：不低于 20000 r/min；3.4 恒温水浴锅； 3.5 旋转蒸发仪；3.6 氮吹仪。4 试验步骤4.1 样品制备4.1.1 鲜人参取不少于 500 g 水果于破壁食物料理机中，以不低于 20000 r/min 的转速将样品制成糊浆状，充分混匀后装入样品密封盒中直接测定或 -18 保存，备用。4.2 样品预处理4.2.1 提取称取 25 g
20、水果样品（水果品种当季待定） ，精确至 0.01 g，于 100 mL 具塞离心管中，加入 50 mL 乙腈，于匀质机中高速匀质 1 min，过滤至装有 7 g 氯化钠的比色管中，振荡 200 下，静止分层，吸取 10 mL 上层有机相于 50 mL 浓缩管中， 60 水浴中氮气吹至近干，用 2 mL 二氯甲烷甲醇混合液溶解残渣，待净化。4.2.2 净化氨基柱用 5 mL 二氯甲烷甲醇混合液溶解进行预处理，当溶剂液面达上层筛板表面时，再倒入上述浓缩管中待净化溶液，用浓缩瓶接收，待液面下降至上层筛板表面，用 8 mL 二氯甲烷甲醇混合液溶解分 2 次冲洗浓缩管并洗脱小柱，将浓缩瓶中洗脱液于 40
21、 水浴中旋转浓缩至尽干，氮气吹干后用 2.5 mL 甲醇和 2.5 mL 水定容，过 0.22 m 滤膜待测。 4.3 仪器参考条件4.3.1 液相色谱串联质谱联用仪: Qtrap 4500 三重四级杆 /离子阱质谱仪(配岛津 30A 超高效液相色谱仪)，电喷雾离子源,美国 AB SCIEX 公司。4.3.2 色谱柱：Kinetex XB-C18，2.1 mm 150 mm 2.6m4.3.3 流动相及流速见表 14.3.4 色谱柱箱温度：40 84.3.5 进样体积：5.0 L表1 流动相梯度及流速步骤 总时间/min 流速/（ l/min） 0.1%甲酸铵水溶液/（%）甲醇/（%）1 0.
22、0 400 90 102 6 400 20 803 6.1 400 5 954 8 400 5 955 9 400 90 106 11 400 90 104.4 质谱条件：4.4.1 扫描方式：正离子扫描，多反应监测 MRM；4.4.2 离子源温度（TEM）：550 4.4.3 电离方式：电喷雾 ESI； 4.4.4 电喷雾电压：5500 V；4.4.5 雾化气压力：60 PSI；4.4.6 气帘气压力：30 PSI；4.4.7 辅助加热气压力：70 PSI；4.4.8 标准曲线的绘制分别吸取 1.0 L 0.02 mg/L、0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg
23、/L 混合标准工作液按照仪器参考条件，由低浓度到高浓度依次进行测定。分别以 9 种农药的质量浓度（mg/L）为横坐标，以 9 种农药的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。4.5 定性分析根据样液中被测物含量情况，选定浓度相近的标准工作溶液，标准工作溶液和待测农药的响应值均在仪器检测的线性范围内。标准工作溶液与样液等体积参差进样测定。 4.6 定量计算试料中 7 种农药的残留量以质量分数 计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,结果保留 3位有效数字，按公式(1)计算： (mV2311)式中:标准曲线校正后所测定该种农药的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L） ；V1提取液中有机溶剂总体积，单位为毫升（mL） ；V2吸取出用于检测的提取溶液的体积，单位为毫升（mL） ；V3样品溶液定容体积,单位为毫升（mL） ；9m称取试料的质量，单位为克（ g） 。
