1、结核实验室快速诊断技术应用进展,结核实验室 夏强,一、简要介绍,二、新技术应用,结核病实验室,免疫组,结核组,分子组,培养,药敏,镜检,结核病实验室工作分工,结核检测技术应用,液体培养及药敏（金标准）,MGIT960培养及药敏,BACTEC MGIT 960 全自动分枝杆菌检测系统,国内对骨关节结核培养阳性率报道不一：14.5%、46.4%、30.1%、42%、83.87%不等骨关节结核患者一般术前都经过抗结核药物治疗，A 群为生长旺盛菌群，但易被药物杀灭，而 B、C、D 群多为休眠或静止状态，代谢缓慢。骨关节结核标本的培养在参照肺结核痰培养的基础上，应该适当延长培养时间，建议延长到 8 周左
2、右,死骨、肉芽、坏死椎间盘、干酪样坏死等病变组织的培养阳性率（45.45%）略低于脓液及脓血标本组（63.83%）。脊柱结核患者的培养阳性率（61.40%）略高于髋关节、膝关节、踝关节、肘关节、腕关节、骶髂关节等其他部位结核组（41.67%）。第四次全国结核病流行病学抽样调查结果表明，非结核分枝杆菌（NTM）在分枝杆菌分离株中占 11.1%，牛分枝杆菌占全部分枝杆菌株的 2.5%。NTM 感染无论从临床表现、影像学表现，甚至病理学表现，都与结核杆菌感染极为相似，很难鉴别，,结果统计,结果统计,时间,例数,现象：同一耐药患者在治疗的不同阶段，药敏试验结果发生了改变？,1、检测方法本身的可靠性：药
3、物的稳定性，浓度，菌株的生长状况。2、耐药发生了演变：原发耐药和继发耐药3、混合感染问题：感染了多种分枝杆菌,人体对于结核分枝杆菌感染的免疫反应主要是细胞免疫。 T淋巴细胞和巨噬细胞的作用关系到感染的进程和演变。巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后，就会把它们消化成大小不一的片断。特异片断(抗原肽)与巨噬细胞和其他抗原递呈细胞的主要组织相容性复合体相结合，表达于巨噬细胞表面，并递呈给T细胞。特异性CD4 T细胞能产生特征性淋巴因子，包括一种能够刺激T细胞增殖的IL-2和-干扰素。IGRA就是检测被结核菌激活的记忆T细胞释放出-干扰素水平。,2.2 TB-IGRA,APC,T cell,IFNg,IGRA
4、应用,2.3 HAIN技术得到全面认可,HAIN技术,效果评价,中国疾控中心结核国家参比实验室实验数据,分枝杆菌的分类：一、缓慢生长菌群1结核菌群：包括人型结核杆菌，牛型结核杆菌，非洲分枝杆菌，田鼠分枝杆菌。2I 群光产色菌。如：堪萨斯、海分枝杆菌等。3群暗产色菌。如：瘰疠、戈氏分枝杆菌。4群不产色菌。如鸟型、胞内、溃疡分枝杆菌等。二、 迅速生长菌即群菌，包括偶发、龟、耻垢分枝杆菌等。三、需要特殊营养菌包括麻风分枝杆菌、鼠麻风分枝杆菌、副结核分枝杆菌。Runyon分类法中的 、群分枝杆菌又称为非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria ，NTM),经过了全球四年的
5、观察，HAIN技术已经是非常成熟的技术并得到同行的认可与好评。Hain 技术可以在二个工作日检测RIF和INH的耐药可以进一步分析18种常见非结核分枝杆菌。缺点：与960液体快速药敏相比，该方法药敏结果具有假阴性可能，占10%左右。这是所有分子诊断技术的原理缺陷。,2.4 RNA恒温扩增技术（TB-SAT）,DNA和RNA的主要区别就在糖基。DNA是双螺旋结构，RNA是单螺旋结构DNA很稳定，RNA很不稳定。,结核RNA在细胞中拷贝数很多,使用rRNA为靶标，大大提高了取样效率和检测灵敏度。,DNA扩增技术（PCR）用于病原体检验的不足,“死菌检测也阳性”，与临床相关性差 基因与表型不吻合 (
6、耐药检测) 不能区分“潜伏感染”“活动性感性” 交叉污染问题（三个房间） 变温检测，对仪器要求高 反应抑制问题（Taq酶）,RNA扩增技术检验的优势,灵敏度高：RNA 拷贝数 DNA拷贝数（104 16 ）与临床相关性好，可以区分“死菌”“活菌”：病原体死亡，RNA很快降解（=“培养”） 减少无效治疗，比如抗生素滥用可以诊断“活动性感染” 活动性感染：指示RNA转录活跃 潜伏感染：指示RNA不转录不易污染：靶标和扩增产物都是RNA,RNA 用于TB的检测多国诊疗指南,2009：美国CDC更新NAAT法在TB实验室诊断中应用的指南 所有疑似TB的初诊病人，除了做涂片之外，都必须用TB-SAT检测
7、至少一份样本。（RNA获得FDA 认证可检测涂阴、涂阳标本，DNA只获得FDA 认证可检测涂阳标本）,Updated Guidelines for the Use of Nucleic Acid Ampflication Test in the Diagnosis of Tuberculosis (2009) United States,目前，我实验室前期预实验275例，灵敏度达到93%，特异性达到85%.该方法只适合痰标本,2.5结核抗体lgG、lgM,2.6 Gene Xpert,缺点：1、价格昂贵、一个test成本在50欧元2、仅能检测利福平一个药物。,标本留取,结核培养：任何标本，不同标本培养阳性率不同结核DNA(HAIN)：痰、灌洗液、穿刺液等结核RNA：痰、灌洗液、穿刺液干扰素：肝素钠全血4mlXPERT：痰、灌洗液、穿刺液等近期新增项目：肺炎支原体RNA、手足口病RNA、性病三项RNA.,对血液标本建议干扰素检测,
