1、DNA损伤：在生物体生命过程中DNA双螺旋结构发生的任何改变。内源因素：DNA复制错误、细胞代谢活动产生化学物质（如自由基、烷化剂）的攻击。外源因素：紫外线、放射线、污染物、香烟燃烧剩余物和病毒等。,第五章 DNA的损伤、修复和基因突变,DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息，维护DNA分子的完整性对细胞至关紧要；修复DNA损伤的能力是生物能保持遗传稳定性所在；DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的，因此生物才会有变异、有进化,。,DNA损伤修复的重要性,第一节 基因结构异常的分子机制,一、DNA一级结构变异的分子机制,DNA一级结构改变的主要原因 引起DNA一级结构改变的原因主要有
2、两类： 一类是复制时碱基的偶然性错配，由此引起的突变称为自发性突变（spontaneous mutation）。这种突变频率极低，约为10-9，即每合成109核苷酸可能会有一次碱基与模板不相配的错误。 另一类是体内代谢过程中产生的自由基由某些环境因素引起的DNA一级结构改变，由此引起的突变称为诱发突变（induced mutagenesis）。,（一）诱发因素,能引起突变的理化因素或物质称为诱变剂（mutagen），主要有以下一些类型：1、碱基和核苷酸类似物，如5-氟尿嘧啶（5-Fu）、6-巯基嘌呤（6-MP）等。2、烷化剂，如氮芥、环磷酰胺。3、抗生素类，如放线菌素D、丝裂霉素、博来霉素 等
3、。4、染色剂，如吖啶黄、二氨基吖啶等。5、亚硝酸盐。6、电离辐射和紫外线照射。,（二）诱变剂的作用机制,1、碱基类似物诱发突变 碱基和核苷酸类似物，如5-氟尿嘧啶（5-Fu）、6-巯基嘌呤（6-MP），能取代正常的碱基而掺入到DNA当中去，并通过互变异构引起复制错误，或掺入到RNA影响RNA的转录和翻译。,2、烷化剂引起染色体损伤 烷化剂，如氮芥和环磷酰胺的分子有一个或多个活性烷基，可使DNA分子中的鸟嘌呤N7烷化后除去，留下缺失碱基后的空隙。,如：甲基磺酸乙酯 EMS，CH3SO2(OC2H5) 硫酸二乙酯 DES，SO2(OC2H5)2EMS、MMS等烷化剂都带有1个或多个活泼的烷基，这些
4、烷基能够加入碱基的许多位置形成烷基化碱基，改变氢键的结合能力,3、抗生素类，使DNA失去模板作用 抗生素类，如放线菌素D、丝裂霉素和博来霉素能与DNA上脱氧鸟苷形成复合物，使DNA失去模板作用，抑制DNA聚合酶。,丝裂霉素为细胞毒药物，在DNA的两条链之间形成共价键，使双链不能分开。这种作用效应是不可逆的，具杀菌作用。但是由于缺乏选择性，其毒性很大，不能用作抗微生物剂，但作为抗肿瘤剂。,4、染色剂与双螺旋结合，引起DNA变构 染色剂，如吖啶黄和二氨基吖啶，通过与双螺旋结合引起DNA变构，并激活修复性核酸内切酶，影响DNA复制和转录。,5、亚硝酸盐可以除去DNA分子碱基上的氨基基团 亚硝酸盐可以
5、除去DNA中任何一个带有氨基基团的碱基上氨基基团，使DNA上碱基脱氨，则C、A、G变成U、H（次黄嘌呤）、X（黄嘌呤），导致复制转录中碱基配对错误。,6、电离辐射和紫外线照射 电离辐射可导致DNA链的断裂；紫外线照射引起两个相邻碱基之间发生二聚化，尤其是相邻胸腺嘧啶之间形成T-T交联，阻碍复制与转录。,二、突变类型及其遗传效应,（一）突变类型,根据DNA分子的改变，突变可以分为四类 1、点突变 DNA大分子一个碱基的变异，又可以分为转换和颠换两种，嘌呤取代嘌呤，嘧啶取代嘧啶称为转换（transition），有4种转换形式，即AG、GA、TC、CT。嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤称为颠换（trans
6、version），有8种颠换形式。 2、缺失 一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。 3、插入 一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入DNA大分子中间。 4、倒位 DNA链内重组，使其中一段方向反置。,（二）突变的遗传效应,1、遗传密码的改变 从DNA碱基序列改变多少可以分成单点突变和多点突变。 从对阅读框的影响来看，如果插入或缺失1个或2个碱基，可以改变阅读框架，这种突变往往是致死的。如果缺失或插入3个碱基，则阅读框架不变，其产物常常有活性或有部分活性。 从对遗传信息改变来看，点突变中碱基替代突变可以分成同义突变、错义突变和无义突变。 （1）同义突变（same sense mu
7、tation）是指没有改变产物氨基酸序列的密码子变化，不影响蛋白质表型。 （2）错义突变（missense mutation）则引起了产物氨基酸序列的改变。 （3）无义突变（nonsense mutation）是指某个碱基改变使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子。无义突变还可以由移框突变、插入突变和缺失突变造成。,2、对mRNA剪接的影响 如果点突变发生在内含子的剪接位点，可以产生两种影响 （1）使原有的剪接位点消失； （2）产生新的剪接位点。 无论是哪一种形式，都可以导致mRNA的错误剪接，产生异常的mRNA。最终产生异常的表达产物。数个碱基缺失，片断缺失均有可能造成剪接位点的
8、缺失。 3、蛋白质肽链中的片断缺失（1）无义突变和DNA片断的缺失都可以导致肽链中的片断缺失，致使基因编码的蛋白质失去原有的功能。（2）移码突变不仅使翻译后的肽链中氨基酸序列发生改变，而且也导致肽链中的大片断缺失。因为移码使阅读框发生改变后，在结构基因中往往出现多个终止密码子，无法翻译出全长的肽链。,损伤的DNA可以修复,直接修复：如光复活酶,普遍存在在生物机体中,可以把嘧啶二聚体恢复正常状态。切除修复：找出损伤位置并切除，进行修复合成并连接。重组修复： 先复制再修复。子代链在对应模板链的损伤 处留下缺口，先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口。SOS系统：复
9、杂的应急反应。既有避免差错的修复又有引起差错的修复，后者有高变异率但也增加了生存机会。,DNA损伤的修复：是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原来的天然状态。,第二节 DNA的修复,切除修复,重组修复,脱嘌呤、脱氨和形成胸腺嘧啶二聚体都可能造成DNA损伤 DNA损伤常见形式是通过N-糖苷键的水解，鸟嘌呤或腺嘌呤的自发脱嘌呤作用形成脱氧核糖。据估计人体内细胞中每天每109碱基对就有多达103碱基对发生脱嘌呤。另一种类型损伤是胞嘧啶脱氨形成尿嘧啶，如果不能校正，在DNA复制后，一个C-G碱基对就将变成一个A-T碱基对了。,胞嘧啶脱氨如不校正将导致： G-C突变为A-T,C,U,U A,紫外线和
10、离子辐射诱导有可能形成胸腺嘧啶二聚体。一个胸腺嘧啶的C-5、C-6与相邻胸腺嘧啶上同样位置的碳之间形成一个环丁基环，结果使得DNA骨架的结构发生了改变，有可能引起与互补链上的相应的腺嘌呤残基之间的氢键断裂。,胸腺嘧啶形成的示意图,在E.coli中存在4种基本的修复系统 E.coli中存在的4种基本类型的DNA修复系统：直接修复，核苷酸切除修复、碱基切除修复和错配修复。1.直接修复 某些损伤的核苷酸和错配的碱基可以被某些蛋白质识别和修复。他们不切断DNA或切除碱基而是直接实施修复，这样的损伤修复机制称为直接修复。 DNA损伤之一的胸腺嘧啶二聚体可以通过直接修复机制修复。胸腺嘧啶二聚体是紫外线辐射
11、造成的，光激活酶可以结合胸腺嘧啶二聚体引起的扭曲了的双螺旋部位。在可见光存在下，光激活酶催化两个胸腺嘧啶碱基再生，正常的A-T碱基对重新形成，然后光复活酶从已修复好的DNA上脱落。,光修复（light repairing）,通过光复活酶修复胸腺嘧啶二聚体的过程,胸腺嘧啶二聚体其他两种修复策略（暗修复+重组修复）,A. 核苷酸切除修复 修复酶是由基因uvrA、uvrB和uvrC分别编码的三个亚基组成的，所以该酶又称为ABC切除核酸酶。 首先ABC切除核酸酶从损伤部位的两侧切去含有损伤的DNA链，结果都出现一个单链缺口。然后在DNA聚合酶催化下按照互补链填充缺口，切口最后通过DNA连接酶连接。,2
12、、切除修复（excision repairing）,(1)由特异内切核酸酶识别损伤，并在损伤前的糖磷酸骨架上切开一个裂口。裂口处有3-OH和含有损伤区的5端。 (2)DNA聚合酶以3-OH为引物，以另一条完好的互补链为模板进行修复，合成一段新片段 (3)损伤区被DNA聚合酶的5-3外切酶活性作用切除。 (4)新合成的DNA片段和原存在的DNA部分由连接酶催化相连。,是一种多酶的催化过程，包括4个步骤：,参与的酶有 核酸内切酶，DNApol,DNA连接酶,B. 碱基切除修复 DNA糖基化酶是一个能识别DNA中象尿嘧啶、次黄嘌呤和黄嘌呤那样的不正确碱基的酶，这些碱基都是由胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤分别
13、脱氨形成的。这样变型的碱基可以通过DNA糖基化酶切断N-糖苷键除去，这样一来在DNA中制造了脱嘌呤或脱嘧啶的部位，通常将这样的部位称之AP位点。 每种DNA糖基化酶通常对一种类型的碱基损伤特异。例如尿嘧啶糖基化酶就可以除去由于胞嘧啶脱氨形成的尿嘧啶，形成一个AP位点。然后一个称为AP内切核酸酶切去含有AP位点的脱氧核糖-5-磷酸，出现一个核苷酸空隙。然后在DNA聚合酶作用下重新放置一个正确的核苷酸，最后通过DNA连接酶将切口封闭。,尿嘧啶糖基化酶系统的修复过程,3. 错配修复 偶尔错误的DNA复制会导致新合成的链与模板链之间的一个错误的碱基配对。这样的错误可以通过E.coli中的3个蛋白质（M
14、utS、MutH和MutL）校正。该修复系统只能校正新合成的DNA，其主要依据是新合成的链中GATC序列中的A（腺苷酸残基）开始未被甲基化。GATC中A甲基化与否常用来区别新合成的链（未甲基化）和模板链（甲基化）。这一区别很重要，因为修复酶需要识别两个核苷酸残基中的哪一个是错配的，否则如果将正确的核苷酸除去就会导致突变。未甲基化的GATC序列不需要紧靠着错配碱基，因为错配碱基与GATC序列之间的间隔的DNA序列可以被外切核酸酶切除，是从3还是从5方向切除取决于不正确碱基的相对位置。,错配修复,4.重组修复,RecA,DNA pol,切除修复,重组修复：, DNA于复制时会越过受损区域进行复制,
15、 经重组修复，受损的DNA仍然存在于子代的一个细胞中。, 重组修复不会浪费时间， 重组修复可让负伤的DNA在细胞中仍可照常进行分裂。,5.SOS修复：前面介绍的DNA损伤修复功能可以不经诱导而产生，然而许多能造成DNA损伤或抑制复制的处理均能引起一系列复杂的诱导效应，称为应急反应（SOS response）。SOS反应包括诱导出现的DNA损伤修复效应、诱变效应、细胞分裂的抑制以及溶原性细菌释放噬菌体等。细胞的癌变也可能与SOS反应有关。 SOS反应是细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急反应。SOS反应诱导的修复系统包括避免差错的修复（error free r
16、epair）和倾向差错的修复（error prone repair）两类。光复活、切除修复能够识别DNA的损伤或错配碱基而加以消除，在它们的修复过程中并不引入错配碱基，因此属于避免差错的修复。SOS修复能诱导切除修复和重组修复中某些关键酶和蛋白质的产生，使这些酶和蛋白质在细胞内的含量升高，从而加强切除修复和重组修复的能力。此外，SOS反应还能诱导产生缺乏校对功能的DNA聚合酶，它能在DNA损伤部位进行复制而避免了死亡，可是却带来了高的变异率。SOS的诱变效应与此有关。,SOS 修复,Irradiation of bacteria before virus infection enhanced
17、repair of damaged viral genes but led to mutations.,UV,UVd T4 phage,E. coli,Few surviving phage,UVd T4 phage,E. coli,Higher frequency of surviving phage, but many mutants.,SOS 修复诱导 DNA 聚合酶活性,LexA (一种DNA结合抑制蛋白), umuC 和 umuD, 编码 DNA聚合酶活性,允许复制跨过 损伤位点, 常插入一个或几个 A碱基.,AGCTAGTCAT/TCAGTC,AGCTAGTCAT/TCAGTCTC
18、GATCANNNNGTCAG,Replication stopsat T/T dimer,Error-prone polymerase allowsreplication to proceed, albeit inaccurately,SOS response:,RecA-P的三种功能,当DNA复制受阻/ DNA damaged,当DNA复制度过难关后,SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物，它是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。SOS反应主要包括两个方面：DNA修复和导致变异。在一般环境中突变常是不利的，可是在DNA受到损伤和修复被抑制的特殊条件下，生物发生突变将是有利于它的生存。因此SOS反应可能在生物进化中起着重要作用。然而在另一方面，大多数能在细菌中诱导产生SOS反应的诱导剂，对高等动物都是致癌的：如X-射线、紫外线、烷化剂、黄曲霉毒素等。而某些不能造成致癌的诱变剂却并不引起SOS反应，如5-溴尿嘧啶。因此猜测，癌变可能是通过SOS反应造成的。目前有关致癌物的一些简便检测方法即是根据SOS反应原理而设计的，因为在动物身上诱发肿瘤的试验需要花费较大的人力、物力和较长的时间，而细菌的SOS反应则很易测定。,
