1、菌种的复苏传代及保存标准程序目的：建立菌种的复苏、传代及保存标准程序。范围：适用于检定用菌种的复苏、传代及保存的操作。职责：质管部生物测定人员对本规程的实施负责。内容：菌种的复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行。操作中使用过的滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡，试验结束后经 12130 分钟高温灭菌处理。1.菌种的复苏1.1 冻干菌种的复苏检定用标准菌种，由中国药品生物制品检定所提供，为冷冻干燥菌种(0 代)。使用前需将其复苏。1.1.1 准备：用具：灭菌 1ml 滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。培养基：根据菌种的性质选择合适的液体培养基（营养肉
2、汤培养基或改良马丁培养基） 、营养琼脂（或改良马丁琼脂）斜面数支。消毒液：75%酒精、碘酒、0.1%新洁尔灭或 84 消毒液等。1.1.2 操作：1.1.2.1 将准备妥的冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台。1.1.2.2 用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕，再 75%酒精棉擦净菌种管外壁，放在灭菌双碟内待干。1.1.2.3 点燃酒精灯，将菌种安瓿的封口一端在火焰上灼烧红热，用灭菌滴管吸取液体培养基少许，滴在灼热的菌种安瓿封口一端，使其骤冷而炸裂。1.1.2.4 取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开后，把菌种安瓿放入灭菌双碟内。1.1.2.5 另取一支灭菌滴管，在火焰旁吸取适
3、用液体培养基少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，接种至液体培养基内。用接种环取菌液划线接种于琼脂斜面培养基上。1.1.2.6 将已接种的液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下（一般细菌在3035，真菌在 2328 ）培养 24h。1.1.2.7 取出培养物（第 1 代） ，仔细观察菌苔形态、有无杂菌，必要时涂片、革兰氏染色镜检，若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 1.2 为保证工作用菌株的传代次数不超过 5 代，并减少购买冻干菌种的次数，可在对冻干菌种复苏的同时制备部分菌悬液（第 1 代）冷冻保存，并将此冻存菌液复苏后的第 2 代培养物冻存
4、保藏。1.2.1 准备 ：冻存保护液（40%无菌甘油）及灭菌冻存管。细菌冻存液：由液体培养基与冻存保护液按 1：1 比例混匀制成。1.2.2 按 1.1.2.11.1.2.4 操作，将冻干菌复溶后，吸取菌悬液加入到细菌冻存液中，混匀。1.2.3 按 1ml/管的量分装至灭菌冻存管中，密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-20 或-80条件下冷冻保存。1.2.4 制备第 2 代冻存菌悬液时，可用接种环直接刮取第 1 代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长的纯菌落，再接种至细菌冻存液中，混匀后按 1.2.3 冻存。1.3 冻存菌悬液的复苏：1.3.1 准备：用具：灭菌 1ml 滴管、酒
5、精灯、接种环。培养基：根据菌种的特性选择适宜的液体培养基（如营养肉汤培养基 10ml、硫乙醇酸盐流体培养基 12ml 或改良马丁培养基 10ml 等） 、琼脂斜面或平板培养基。消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或 84 消毒液等。1.3.2 操作：1.3.2.1 从低温冰柜中取出菌种冻存管，室温下放置使其自然解冻。1.3.2.2 将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台。1.3.2.3 用 75%酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁，稍干。1.3.2.4 点燃酒精灯，在火焰旁打开菌种冻存管盖，用一支灭菌滴管吸取解冻的菌悬液，接种至 10ml 液体培养基中（生孢梭菌需接种至 12ml 硫乙醇酸盐
6、流体培养基中） 。或用接种环取菌悬液划线接种于琼脂斜面或平板培养基上。1.3.2.5 将用过的滴管和菌种管投入消毒液内浸泡，接种环在火焰上灼烧。1.3.2.6 将上述接种后的培养基在规定温度下培养（细菌在 3035恒温培养 18-24 小时，真菌在 2328恒温培养 24-48 小时，黑曲霉*培养 57 天） 。1.3.2.7 仔细观察培养物：如呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种，注明菌名、编号、代次和接种日期后，置 28冰箱内保存；如发现菌苔形状不典型，可进行平板分离单菌落。1.3.2.8 注意：已解冻的冻存管不可再冻存。2.菌种的接种、传代2.1.准备用具：接种环、酒精灯。培养基：营养
7、琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基或适宜的液体培养基。培养基应新鲜制备，如斜面已干缩，无冷凝水，则不宜再使用。消毒液：75%酒精、0.1%新洁尔灭或 84 消毒液。菌种：根据 2010 年版中国药典的要求，传代次数（n）应不超过 4 代。2.2 将冰箱中取出的菌种斜面，在室温放置 30 分钟，待温度平衡后再移入接种室内或超净工作台。2.3 点燃酒精灯，将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间，试管口斜向上，两试管口平齐靠近火焰旁。2.4 用右手在火焰旁转动两管的棉塞，以便接种时易拔取，再以右手持接种环在火焰上烧红 30 秒钟，随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧，往返通过3 次。2.5 右手
8、用无名指、小指及掌部夹住棉塞，左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手再轻轻拔出棉塞，夹在无名指、小指及掌部，并勿使其与任何物品接触。2.6 将灼烧过的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养基上，待冷后，从斜面上挑取菌苔少许，取出时，接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入至接种管内液体培养基中，或在琼脂斜面的底部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上，注意只划动一次，勿重复移动，且勿使菌苔沾在管壁口。2.7 取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁将试管棉塞塞上，然后将接种过细菌的接种环在火焰上灼烧灭菌。2.8 已接种毕的各管贴好标签，注明菌名、编号、代次（n+
9、1）和接种日期，细菌管置 3035培养 1824 小时；真菌管一般置 2328培养 2448 小时（黑曲霉需培养 57 天） 。2.9 培养到期后取出培养物，仔细观察菌苔形态，是否正常，并与上代菌种比较，有无杂菌。必要时涂片，革兰氏染色镜检，呈典型菌落即可作为日常工作中使用的菌种。如发现菌苔形状不典型，可继续进行平板划线培养，分离单菌落，挑选典型菌苔接种于营养琼脂斜面上，代替原有的工作用菌种。2.10 检查合格的工作用菌种，放入冰箱内 28保存，一般 1 个月转种一次。2.11 菌种（第 n 代）接种至适宜培养基中，在规定的温度条件下的培养物，即为第 n+1 代。注意：黑曲霉*致病性很强，操作
10、时应特别注意：黑曲霉孢子相当稳定，其在 0.9%氯化钠溶液中，4左右的条件下可以保存较长的时间，故可将此孢子悬液作为储备液在 12 月内使用，以减少反复操作的风险性。为防止黑曲霉孢子的传播，接种传代时应关闭风机，近酒精灯操作。若传代的母代菌种为菌悬液，则用无菌吸管吹吸管内液体，取 12 滴滴在改良马丁琼脂斜面，用吸管涂布均匀，置 2328 培养 57 日。接种传代时，改良马丁斜面必须是干燥的，否则影响其孢子的形成。接种传代后，使用过的器具均需在 121，30 分钟高压灭菌后再作处理。3.菌种的保存：3.1 菌悬液冻存法：冻干菌种（0 代）复苏后，可按上述方法制备第 1 代菌悬液、第 2 代菌悬
11、液进行冻存。3.2 琼脂斜面低温保存法：日常使用的工作用菌种可用此法在短期内保存。3.2.1 将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸包好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在 4左右的冰箱中保藏。每隔 1 个月移种一次，继续进行保藏。3.2.2 适用范围：细菌、酵母菌、真菌保藏。3.2.3 各类菌种保藏条件及时间：菌种 培养基 保存温度 传种时间细菌一般多用营养琼脂或根据菌种规定选用培养基46芽孢杆菌 36 个月其它细菌每个月酵母菌 一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵
12、母膏琼脂 46 一般 46 个月丝状真菌一般用 PDA 琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等。46每 4 个月移植一次（每 2 个月移植一次）3.2.4 注意事项：保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。 保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，应在室温下保存。 3.3 液体石蜡保存法：利用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可
13、防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。3.3.1 方法：3.3.1.1 将菌种接种于斜面或穿刺于 0.3 0.5 %琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。3.3.1.2 取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管 1015ml，加棉塞，瓶口包上纸，121高压灭菌 30min，取出置 37温箱或 110170烤箱中 1 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分。3.3.1.3 将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端 1 为宜，将试管直立，放入 4冰箱中保藏。3.3.2 适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。3.3.3 注意事项：保藏时，用新鲜培养物接种
14、，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。将沾有少量液体石蜡的接种针浸于 95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面 1 为宜。制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。4.菌种在传代、保存或使用过程中发现
15、污染、变异，应及时销毁，不得用于常规检验。5.菌种传代、保存及使用、销毁均应填写相应记录：0 代菌种保管使用记录 、冻存菌种保管使用记录 、 菌种传代记录 、 菌种使用记录及菌种销毁记录 。6.菌种按“检定菌管理制度”管理。7.附录：7.1 菌种编号：传代复苏的菌种应有统一编号,编号方法为:菌种代号-G 或 W-代次-管号。G 表示用于冻存的菌种，W 表示工作用菌种。-（）注： 菌种代号：常用菌种的代号见下表：菌种名称 代号 菌种名称 代号 菌种名称 代号金黄色葡萄球菌 JP 生孢梭菌 SB 大肠埃希菌 DC铜绿假单孢杆菌 TL 白色念珠菌 BN 短小芽孢杆菌 DX枯草芽孢杆菌 KC 黑曲霉
16、HQ 藤黄微球菌 TH菌种购进的年、月：如 0608 表示 2006 年 8 月购进菌种代次，用 1、2、3、4、5 表示。母代冻存菌种的编号，用、表示。菌种的序号，用 1、2、3表示。7.2 常用工作用菌种的生物学特征金黄色葡萄球菌形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄状，菌落直径为 0.81.5mm，革兰氏染色阳性。培养特性：在肉汤琼脂培养基、营养肉汤中，生长良好。在 2838生长较好，pH 为 4.59.8，以 pH7.4 左右最好。营养琼脂平板，培养 2448 小时，形成圆形凸出、边缘整齐、表面光泽且金黄色的菌落，直径 12mm（应挑选光滑型菌落） 。营养肉汤培养基，生长迅速，经 3724
17、 小时培养呈均匀混浊，管底稍有沉淀，微微振摇即可上升，消散均匀。但培养基含有可发酵糖类或菌型变为粗糙型者，可出现自然凝集现象，抵抗力：在干燥情况下，可生存数月，在无糖培养基内生存数年。对热 8030 分钟才被杀死。在 1%石炭酸液中 15 分钟被杀死，碘酒中须 1 分钟，75%酒精中须数十分钟才被杀死。藤黄微球菌形态与染色：个体略大于葡萄球菌，直径 0.53.5um，单个成双或四联状排列，或呈不规则的团块。革兰氏染色呈阳性。培养特性：专性需氧菌，营养要求不高，最适温度为 2530。在琼脂平板上培养可形成圆形凸起，光滑、不透明黄色菌落。在液体培养基中均为混浊生长。枯草杆菌形态与染色：菌体细短棒状
18、，0.70.8um 宽，2.03.0um 长，单个或呈链状，两端半圆形，染色均匀。芽孢 0.60.9um 宽，1.01.5um 长，椭圆形或圆柱形，常产生于菌体中央或接近中央。革兰氏染色呈阳性，能运动。培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，凹凸不平，边缘锯齿状，稍有蔓延，呈白色或微黄色，应挑选粗糙形菌落） ，本菌变异时可出现光滑型菌落。营养肉汤培养基中呈少量混浊并生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜，粘附于试管壁上。培养最适温度 3037，生长范围 1555，兼性厌氧或需氧。抵抗力：菌体湿热 55，1 小时即被杀死，芽孢能耐高温，1003 小时才被杀死，12040 分钟才被杀死。短小芽孢杆菌形
19、态与染色：本菌为杆状，革兰氏染色阳性，无荚膜，芽孢偏生，椭圆形，有动力。培养特性：本菌与枯草杆菌相似，培养最适温度 3037，生长范围 1550，兼性厌氧或需氧。此外，短小芽孢杆菌有两点不同于枯草杆菌：在琼脂培养基上，大多数菌株的菌落为光滑型并变为微黄色，用于检定的菌种，应挑光滑型菌落；有些菌株营养需要生物素（维生素 H）及氨基酸。大肠埃希菌形态与染色：短杆菌 0.40.7um 宽，24um 长，两端钝圆，大多数有 58 根鞭毛，运动活波，但亦有无鞭毛，不运动，不形成芽孢，革兰氏染色阴性。培养特性：菌落扁平，光滑，圆润，在 EMB 琼脂平板上呈紫黑色，有金属光泽。白色念珠菌形态与染色：本菌为革
20、兰氏阳性，但染色不均匀，卵圆形，壁薄生芽的酵母样菌。大小为2.54um。培养特性：琼脂平板培养，菌落表面湿润粘稠，圆形，乳白色，微凸，边缘整齐。生孢梭菌形态与染色：大多数菌株周身皆有鞭毛，能运动，并可形成杆状或梭状芽孢杆菌，菌体一般较粗大，长约 38um，宽约 0.41.2um。革兰氏染色呈阳性，菌体老化后常可变为阴性。培养特性：本菌严格厌氧，培养的最适温度为 37。在琼脂平板上培养 2448 小时，生长缓慢，菌落直径 25mm，蔓延生长，边缘不规则，有锯齿状突起；在硫乙醇酸盐流体培养基中 2448 小时生长良好，呈长絮状，伴有恶臭，再培养数日后菌体可自溶，液体由混浊变清。铜绿假单孢杆菌：菌体长短不一，菌落粘连，培养基被染成绿色。革兰氏染色呈阴性。La 型菌落：湿润扁平大山脉状，在营养肉汤培养基中呈易碎菌落，膜下菌液浑浊。Sm 型菌落：表面粗燥突起，呈乳头状，在营养肉汤培养基中形成厚膜，膜下菌液澄清。黑曲霉：菌落为近乎透明的小圆点装或匍匐于培养基表面的不规则丝状物。镜检为 310um 圆形。接种至改良马丁培养基上先是形成黄色菌落，后长出孢子。培养 57 天后可观察到斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。
