1、实验五、细菌的芽孢染色法,实验的目的要求,学习并掌握芽孢染色法进一步了解芽孢杆菌的形态特征,细菌芽孢的基本构造,孢外壁芽孢衣皮层芽孢壁芽孢质膜芽孢质芽孢核区,芽胞具有多层厚而致密的胞膜，由内向外依次为核心、内膜、芽胞壁、皮质、外膜、芽胞壳和芽胞外衣 .,形成芽孢需要一定的外界条件，这些条件因菌种而异。炭疽芽孢杆菌在有氧(O2)条件下才能形成芽孢，而破伤风芽孢杆菌则在无氧条件下形成芽孢。通常细菌在营养不足时形成芽胞，但苏云金芽孢杆菌是例外。,细菌芽孢的基本特性,细菌芽孢的基本特性,芽孢对恶劣环境条件有很强的抵抗能力，尤其耐高温。有的芽胞可耐100沸水煮沸数小时。在一定条件下，芽孢保持活力数年至数
2、十年之久。高温灭菌的判断标准就是细菌的芽孢是否被杀灭。,细菌芽孢的基本特性,芽孢在适宜条件下，营养物如葡萄糖、乳酸和水分，会发芽形成菌体，但细菌的数量并未增加，所以芽胞不是一种繁殖方式。,芽胞抵抗力强的原因,1.芽胞含水量少，蛋白质受热后不易变性；2.芽胞具有多层致密的厚膜，理化因素不易透入；3.芽胞中含有一种特有的化学组分吡啶二羧酸（DPA），DPA与钙结合生成的钙盐能提高芽胞中各种酶的热稳定性。,细菌芽孢染色的意义,芽孢又称内生孢子，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之
3、一。,细菌的芽孢具有厚而致密的壁不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽孢不着色(芽孢呈无色透明状)。芽孢染色法就是根据芽孢既难以染色而一旦染上后又难以脱色这一特点而设计的。,细菌芽孢染色原理,细菌芽孢染色原理,所有的芽孢染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽孢着色，再使菌体脱色，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留原有的颜色，然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察。,材料,菌种:苏云金芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌染色剂：5%孔雀绿水溶液0.5%番红水溶液仪器或其他用具：Eppendorf管Eppendorf管架载
4、玻片显微镜电磁炉搪瓷烧杯,方法,Schaeffer-Fulton氏染色法(P78)改良的Schaeffer-Fulton氏染色法,制片染色脱色复染镜检,Schaeffer-Fulton氏染色法,制备菌悬液染色涂片固定脱色复染镜检,改良的Schaeffer-Fulton氏染色法,制 片,生理盐水,1、滴生理盐水,挑取少量菌苔,与生理盐水混匀均匀涂布,或电吹风吹干,2、涂片,滴半滴生理盐水在载玻片中央,3、干燥,室温自然晾干,染 色,5%孔雀绿染液,1、滴孔雀绿染液,滴加数滴孔雀绿染液在菌膜上,2、加热染色,用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热,至冒蒸汽开始计时，维持5min,沸腾：菌体或芽孢囊破裂
5、；加热不够：芽孢难以着色。,注意补充染液，以免涂片干涸,脱色,待玻片冷却后，水洗脱色,不要直接冲菌膜,复 染,0.5%番红水溶液,1、滴番红水溶液,滴加数滴番红染液在菌膜上，染色2min,2、水洗,不要直接冲菌膜,镜 检,或吸水纸吸干,1、干燥,或电吹风吹干,室温自然晾干,2、镜检,显微镜操作,油镜使用,制备菌悬液,生理盐水,1、滴生理盐水,挑取2-3环菌苔,与生理盐水混匀均匀,2、制备菌悬液,在EP管中滴2滴生理盐水,染色,5%孔雀绿染液,1、滴加孔雀绿染液,沸水浴加热15-20min,2、加热染色,在EP管中滴2-3滴孔雀绿染液,涂片固定,经孔雀绿染色细菌悬液,1、滴菌悬液,用接种环均匀涂布,或电吹风吹干,2、涂片,滴半滴菌悬液在载玻片中央,3、干燥,室温自然晾干,4、固定,通过酒精灯火焰3次固定,
