1、精液冷冻技术概述,四川大学华西第二医院人类精子库,2,精液冷冻历史回顾,1776年Spallanzani偶然发现将人精液埋藏于冰雪仍可存活1886年Mantegazza发现在15下的精子可以存活较长时间； 1937年Jannel报告人类精子可在-196中存活； 1949年Polge首先发现甘油对冷冻精子具有特殊保护作用。,3,冷冻精液的临床意义,供者人工授精（AID）使用方便，并且可以配合女性生殖周期进行；对有先天遗传疾病和严重传染性疾病的患者可以使用；进行生殖保险；如男性绝育手术者，肿瘤患者化疗前，从事危险行业者等；对于少、弱精症者，可多次采集冷冻后加以浓缩；对于取精困难和梗阻性无精症的患者
2、在ICSI治疗时，用冻融精子代替新鲜精子可避免反复抽吸睾丸或附睾，利于医患双方掌握治疗进度。,4,冷冻损伤原理,冰晶损伤学说 ice crystal damage 溶液效应学说 solute damage,5,冷冻原理,降温过程分期：温度休克期RT5潜热扩散期50 冰晶形成期015再结晶期1579保存期80196,6,冷冻损伤原理,精子,示意图：,精子细胞外冰晶形成,胞内冰晶形成,细胞脱水,冰晶损伤,溶液损伤,降温,快速,慢速,7,冷冻对精子产生的损伤,超微结构的损伤： 冷冻复温后的精子外膜变薄，波浪状改变或破损，胞浆、顶体内和线粒体内透光度增加，顶体增宽，线粒体外形变圆，轴丝增粗，提示细胞肿
3、胀是形态改变得主要征象。 精子功能： 日本学者研究根据精子顶体功能和穿透率无显著变化，发现冷冻精子授精能力无下降。染色体： 目前对冷冻保存精子染色体自然畸变率报道不多，仍存在争论,8,冷冻保护原理,冷冻保护液 渗透性 增加细胞内外的渗透压，降低细胞内外液的冰点，减少冰晶的形成。 非渗透性 调节PH，细胞外渗透压，增加营养不同温区最适的冷冻速率 研究表明过快或过慢的降温都是不合适的，应根据不同的冷冻保护剂选择各个温区最佳的降温速度。目前还未找到。,9,冷冻保护剂 （CPM）,根据CPM的特性： 非渗透性CPM：卵黄、葡萄糖、蔗糖 渗透性CPM：甘油根据CPM种类 : 单一甘油型 复合甘油型 无甘
4、油型,10,冷冻保护剂 （CPM）,各成分的主要作用 :甘油：有渗透性，当进入精子细胞内时使精子内的含水蛋白质稳定，降低细胞内液冰点，减少冷冻时细胞内冰晶的形成。但甘油本身对细胞也有一定的毒性，一般终浓度控制在710。 卵黄：提高细胞外渗透压，含有卵磷脂，可以稳定精子的细胞膜，防止顶体外膜破裂。它的缺点是冻融后有大量的颗粒和碎片，并且有病毒感染和过敏反应当可能。,11,冷冻保护剂 （CPM）,各成分的主要作用 :葡萄糖：与调节渗透压有关 缓冲系统：可以结合游离的H+和OH，有助于溶液和精子脱水现在常用CPM: 单一甘油型 GYC型（甘油卵黄柠檬酸钠型） TESTGYC（TESTris缓冲系统G
5、YC）型 GYCG型（GYC谷氨酰胺） 改良TG型（改良Tyrode液甘油型）,12,冷冻保护剂 （CPM）,改良TG型，它的优点 有：相比有较好的冷冻复苏率（本精子库平均62.6）可准确配制不含卵黄，消除可能的病毒感染和过敏反应背景清晰，无大量颗粒和碎片储存时间长，可达3个月,13,降温程序,分类： 程序降温：利用程序降温仪进行精确降温。 手工降温：利用现有降温设备和液氮蒸气分步骤降温。注：由于现在还没有找到降温过程中各个温区最佳降温速率，文献报道的各种降温程序精液复苏率效果不一！降温前处理： 在室温中将精液与CPM 1:1混匀，通常是在20min逐量加入，且用振荡器持续振荡，转速约300/
6、min。此过程在提高精液复苏率中起重要作用之一。,14,降温程序,程序降温 得到多数学者的认同，有精确定降温速率控制，复苏率较高。缺点是仪器昂贵，使用和维护费用也较高，不适合普及。,15,降温程序,手工降温：25（RT下加CPM）4-20minLV（LN上5cm处）-10minLN25（RT下加CPM）4-60min20-20minLN25（RT下加CPM）4-20min20-20minLV（LN上5cm处）-5minLN25（RT下加CPM）LV（LN上5cm处）-15minLN,16,复温程序,原则：是快冻快复、慢冻慢复 方法：37水浴快速复温复温损伤机制：Mohammad等连续观察精子在
7、冷冻过程中的损伤情况发现绝大多数的细胞损伤发生在复苏期。当快速降温时使细胞内产生小冰晶，如果缓慢复温，小冰晶将会融合成大冰晶对细胞形成损伤；当慢速降温时细胞外的水分首先结冰，胞外溶质浓度升高导致精子细胞脱水，快速复温使胞外的水分来不及回渗，造成精子的皱缩，形成溶质性损伤。,17,冷冻复温后的处理,使用精子营养液可使复温后的精子在较长时间内保持良好的活动率。使用化学物质如：己酮可可碱（PF）、2-脱氧腺苷（2-DA）提高冷冻复苏后的精子的活率和活力。,18,精液研究的新进展,玻璃化低温保存 最理想化的精液保存方法。指在溶液降温过程中，相变后直接转变为非晶态（玻璃态）的固态。由于玻璃态分子间的关系
8、和液态没有明显变化，可避免冰晶形成过程中对细胞的损伤。要形成玻璃态必须有两个条件：有极大的冷却速率；极大增加溶液的浓度。,19,精液研究的新进展,冷冻损伤的新理论：活性氧（ROS）的损伤： 精液冷冻过程中产生较多的活性氧，特别是标本中白细胞含量较高时。从样本中除去白细胞或冷冻前用抗氧化剂处理，可以提高精子的活力和功能。膜穿透性：不同保护剂成分对细胞膜的穿透性，水对细胞膜的穿透性，它们的大小决定了冷冻保护剂与精液混合时平衡的时间及降温速率。穿透性越大的冷冻保护剂可以得到较高的冷冻复苏率。,20,精液研究的新进展,冷冻保护剂渗透压冷冻保护剂渗透压的大小也是导致精液冷冻损伤的主要因素之一。冷冻保护剂
9、渗透压2000mOsm时大部分细胞膜会受到破坏。这一损伤同时也与细胞本身可以承受渗透压变化的程度，在冷冻和复温过程中，如果渗透压变化超过细胞本身承受能力，严重的细胞将死亡。冷打击 精子从室温降到0时会受到损伤，我们称之为冷打击。它往往决定于精子本身抗冷打击的能力。,21,本精子库冷冻试验进展,已建立合理的精液冷冻程序共进行精液冷冻试验169例，平均复苏率达62.6随着条件不断的摸索，冷冻复苏率也在不断地提高；已建立比较稳定的精液冷冻方法，冷冻复苏率完全满足卫生部的要求。,22,精液冷冻研究的方向,寻找更加适合精液冷冻的冷冻保护剂；探讨渗透压对精液冷冻产生的影响；活性氧（ROS）对精液冷冻产生的影响及应对方法；根据冷冻保护剂选择各个降温区最佳降温速度；,23,谢谢！,24,返回,25,返回,26,2003.122004.03本精子库每月精液冷冻平均复苏率,返回,
