1、生态环境 2007, 16(3): 954-957 http:/Ecology and Environment E-mail: 基金项目：河南省教育厅科技攻关项目（200510466021） 作者简介：胡元森（1976），男，讲师，博士，研究方向为土壤微生物。Tel: +86-371-67789926；E-mail: 收稿日期：2006-12-08黄瓜根分泌物中化感物质的鉴定及其化感效应胡元森 1, 2，李翠香 1，杜国营 2，刘亚峰 2，贾新成 21. 河南工业大学生物工程学院, 河南 郑州 450052；2. 河南农业大学生命科学学院, 河南 郑州 450002摘要：作物生长过程中能从根系
2、分泌释放出化感物质，此类物质被认为是引起连作障碍的重要因子。 为进一步明确黄瓜（Cucumis sativus L.）根分泌物中化感物质与其连作障碍间的关系，采用 GC-MS 分析法， 鉴定了 XAD-4 吸附树脂收集黄瓜水培液所获得根分泌物化感物质的种类，并考察了根分泌物 对黄瓜种子胚根伸长及鉴定出的酚酸类化感物质对黄瓜枯萎病菌菌丝生长的影响。 结果表明：黄瓜根分泌物中化感物 质主要有苯甲酸、对羟基苯甲酸，香草酸，阿魏酸，苯丙酸等苯甲酸的衍生物。根系分泌物酸性、中碱性组分对黄瓜胚根伸长都有抑制作用，其中酸性组分抑制作用更加明显。 42 h 内，质量浓度低于 50 mgL-1时，酚酸对枯萎病菌
3、菌 丝生长有刺激作用，而高于 50 mgL-1时， 对菌丝生长有抑制作用。随处理时间延长，枯萎病菌对酚酸物质的耐受性增强，对 高质量浓度酚酸的生长抑制作用表现不明显。本研究 为从根际微生态角度揭示连作障碍机理积累了重要数据。关键词：黄瓜；根分泌物；GC-MS；胚根；黄瓜枯萎病菌中图分类号：S625.5 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2007）03-0954-04连作障碍已成为制约一些地区蔬菜生产可持续发展的重要因素，它的发生不 仅同土壤传染性病害和土壤理化性状变劣有关，也同根系分泌物和残茬分解物等引起的自毒作用有关 1-3。黄瓜是温室种植面积最大且不耐连作的蔬菜品种之一，其 连
4、作常导致生长变差，品质下降，枯萎病、根结线虫病严重发生等现象 4。许多研究表明，根分泌物中酚酸类化感物质能够通过多种途径对黄瓜植物产生不利影响，并被认为是黄瓜根分泌物中的主要化感因子 5-7。但这一 结论常常被质疑，原因是几乎所有的作物都能从根系分泌这些酚酸 8-10。此外，尽管病害严重是许多作者在研究连作障碍时描述的一个现象，但造成这一现象的原因、这一现象与根分泌物化感物质间的关系却鲜见报道。本文分离 鉴定了水培42 d的黄瓜幼苗根分泌物中主要化感物质，并对分泌物抑制黄瓜种子萌发与胚根伸长及鉴定出的化感物质对枯萎病菌生长进行了测试，旨在 为黄瓜连作障碍成因研究提供证据。1 材料与方法1.1
5、黄瓜品种及病原菌菌株供试黄瓜（Cucumis sativus L.）品种为津绿。黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）由南京农业大学园艺学院曹清河博士惠赠，具有侵染能力。1.2 实验方法1.2.1 黄瓜培养条件蛭石育苗及黄瓜水培采用营养液配方参照文献 7的方法。将消毒过的黄瓜种子放在 铺有滤纸的培养皿内，加水使滤纸浸透，于30 温箱催芽。看到芽尖后，将种子播于营养液浸透的蛭石中，室外培养。待第二片真叶展平时，取出生长均一的幼苗，用去离子水轻轻洗去蛭石，定植在两个盛上述营养液的培养器中。每培养器定苗8株。每 7 d换一次营养液，黄瓜连续培养6周。采用自动通气泵通气，培养温度夜25
6、，昼35 。用日光灯照明，光照强度约4 000 Lex。黄瓜生长期，定 时补充水分， 调整培养液pH值。1.2.2 树脂预处理购置树脂（XAD-4型，Sigma公司）先用去离子水冲洗多次后，避光保存于甲醇中备用。 树脂装柱(16 mm400 mm)高度约250 mm后，用去离子水洗去残存的甲醇 (用水量不少于 500 mL)，然后用0.25% NaOH冲洗约3 h，再用5倍柱床体积的去离子水冲洗，最后用0.25% HCl冲洗30 min。1.2.3 根分泌物的提取及纯化将黄瓜培养残液过XAD-4树脂柱( 流速约5 mLmin-1)，然后用 10倍柱床体积的去离子水洗约2 h以除去柱中的营养液成
7、分。再用 200 mL甲醇洗脱根分泌物，收集甲醇洗脱液，用冷冻干燥机除去甲醇，加超纯水30 mL溶解干燥后的根分泌物。用0.1 molL-1 HCl调pH至2.0，用乙醚萃取3次后弃水相(得酸性 组分) 。将水相用 NaOH调pH 至8.0，同样用乙醚萃取三次(得中、碱性组分) ，弃水相。将酸性 组分，中碱性组分中乙醚蒸发掉，加少量甲醇溶解后，加去离子水定容至5 mL，一部分用于生物 检测，一胡元森等：黄瓜根分泌物中化感物质的鉴定及其化感效应 955部分用于GC-MS分析。1.2.4 根系分泌物的硅烷化将上述酸性、中碱性组分分别进 行冷冻干燥，在冻干的样品中加入0.25 mL硅烷化试剂(BST
8、FA:吡啶=5:1)，加盖密封后于80 水浴中衍生2 h。1.2.5 根分泌物的GC-MS鉴定硅 烷 化 后 的 各 组 分 根 分 泌 物 于 河 南 省 科 学 院 分析 测 试 中 心 质 谱 室 采 用 17A/QP-5000 GC/MS测 定 。采 用 电 子 轰 击 源 ，轰 击 电 压 70 eV，扫 描 范 围 M/Z30工 协 作 -450AMU，扫 描 速 度 0.4 s扫 全 程 ，离 子 源 温度 250 。毛 细 管 柱 ：SE54（30 m0.25 mm0.25 mm），进 样 口 温 度 280 ，柱 温 120 （3 min），以 15 min-1程 序 升 温
9、 至 250 （保 持 3 min）。载 气 为 He，流 量 l mLmin-1，进 样 量 为 1 L。人 工 分 析 并 与 标 准 图 谱 核对 ，确 定 各 组 分 物 质 结 构 及 名 称 。1.2.6 酸性、中碱性组分收集液对黄瓜种子胚根伸长影响分别取 0.1、0.2、0.4 和 0.8 mL 酸性、中碱性 组分根分泌物。事先将直径 9 cm 滤纸片用无菌水浸透，并置于培养皿上，将上述根分泌物加入到培养皿中，摇匀。每个培养皿放 10 粒黄瓜种子于滤纸片上，25 暗条件下培养，60 h 后测定胚根长度。实验重复进行 3 次，以 3 次测 定胚根长度的平均值作为指标，评估酸性、中碱
10、性组分收集液对黄瓜种子胚根伸长影响。1.2.7 根分泌物中酚酸物 质对枯萎病菌菌丝生长影响将三种酚酸分别添加到PDA培养基中，使之质量浓度分别达到0.01、0.025、0.05、0.1和0.15 mgL-1。预先用PDA 培养基培养黄瓜枯萎病菌，待菌落直径约5 cm时，用打孔器(直径为0.5 cm)取菌落边缘取长势一致的菌丝，接入到添加不同量酚酸的 PDA培养基中。26 培养42 h和64 h后测定菌落直径大小。每个处理三个重复，以不加酚酸的处理作为对照（5个重复）。2 结果2.1 根分泌物中主要物质的 GC-MS 分析根分泌物酸性组分、中碱性组 分的气相色谱图见图 1，图 2。从图中可知，在
11、根分泌物酸性组分中检测出苯甲酸、苯丙酸、对羟 基苯甲酸、香草酸、阿魏酸、丁二酸、2.4-已二烯二酸及三种烷酸等物质，其中前五种都是已被发现存在于多数植物根分泌物中的化感物质 10-11。丁二酸是三羧酸循环中的一种机酸，不是化感物质。2.4-已二烯二酸也未发现具有化感效应。4-羟基-噻吩并3.2.C吡啶可能是一种潜在的化感物质，但目前没有其 标准品，其化感活性有待于验证。在中碱性组分中 检测出丙三醇、脯氨酸、及二种甲基脂类物质，这也似乎并不是根分泌物中的化感物质。在酸性组 分中，未 发现与已报道的非酚酸类化感物质相似的成分。2.2 酸性、中碱性组分收集液对黄瓜种子胚根伸长影响上述酸性、中碱性组分
12、收集液 对黄瓜种子胚根伸长的影响见表1，从表中可以看出，从分泌物中萃图 1 根分泌物酸性组分气相色谱图Fig. 1 Gas-chromatograph pattern of acid componet of cucumber root exudates.1. 磷酸；2. 苯甲酸；3. 2,4-已二烯二酸；4. 苯丙酸；5. 对羟基苯甲酸；7. 丁二酸；8. 十四碳酸；10. 香草酸；16. 十六碳酸；17. 十八碳酸；18. 阿魏酸图 2 根分泌物中碱性组分气相色谱图Fig. 2 Gas-chromatograph pattern of alkaline mixtures of cucumbe
13、r root exudates.1. 磷酸; 2. 丙三醇; 3. 苯甲酸苯甲酯; 4. 脯氨酸;6. 十六烷酸甲基脂; 8. 4-羟基-噻吩并3,2,C吡啶956 生态环境 第 16 卷第 3 期（2007 年 5 月）取得到的酸性组分和中碱性组分对黄瓜胚根生长均具抑制作用，其抑制效果随其收集液添加量的增加而增强。与中碱性组分相比，酸性组分的抑制活性更加明显。2.3 根分泌物中酚酸物质对枯萎病菌菌丝生长的影响几种酚酸物质对黄瓜枯萎病菌菌丝生长影响见表 2。从表中可见，培养 42 h 后，苯甲酸、 对羟基苯甲酸、香草酸、苯丙酸质量 浓度在 50 mgL-1 及以下时， 对枯萎病菌菌丝生长都具有
14、促 进作用，其中，苯甲酸、对羟基苯甲酸在 25 mgL-1时刺激作用显著。而这几种酚酸在高于 50 mgL-1时对病菌菌丝生长表现出抑制作用，150 mgL-1 的苯甲酸及 100 mgL-1 和 150 mgL-1 的苯丙酸对菌丝生长抑制极显著。值得注意的是，阿魏酸在 10 mgL-1 和 25 mgL-1时均表现出显著的菌丝生长刺激作用，在 质量浓度高达 100 mgL-1时这种刺激作用仍然存在，但在150 mgL-1时又表 现出显著的抑制作用。64 h 后 菌 丝 生 长 似 乎 对 高 浓 度 酚 酸 的 抑 制 作 用具 有 耐 受 性 。几 种 酚 酸 处 理 后 ，黄 瓜 枯 萎
15、 病 菌 菌 丝 生长 更 多 地 表 现 出 刺 激 生 长 作 用 。如 高 浓 度 对 羟 基 苯甲 酸 处 理 42 h 后 ，菌 丝 生 长 受 到 抑 制 ，但 在 64 h 后 ，菌 丝 生 长 又 表 现 出 微 弱 的 刺 激 作 用 。而 在 42 h 表 现出 显 著 抑 制 作 用 的 150 mgL-1 的 苯 甲 酸 、阿 魏 酸 和100 mgL-1 的 苯 丙 酸 ，在 64 h 后 抑 制 作 用 也 有 减 弱 。3 讨论本文研究表明，酸性组分能显 著抑制黄瓜胚根伸长，而中碱性组分抑制能力随添加量增加而 变化不大，这说明起化感抑制作用的物 质主要存在于酸性组
16、分中，化学鉴定进一步证实 了这一观点。在酸性组分中检测到苯甲酸，对羟 基苯甲酸，香草酸，苯丙酸，阿魏酸等苯甲酸的衍生物，这些化合物已被证明在黄瓜根系分泌物中存在，并对黄瓜生长起自毒作用 12。虽 然中碱性组分也表 现出一定的抑制作用，但在随后的化学鉴定中未 检测到与已报道化感作用物质相同的成分，这可能是 实验中根系分泌物收集量过少所致。在中碱性 组分中，稠 杂环化合物4-羟基 -噻吩并 3,2,C吡啶有可能是潜在的化感物质，但目前仍没有此标准品生 产，其化感活性 还无法验证。在质谱检测时，峰值较大的都是一些脂肪酸，脂类物质，峰值较低的才可能是要分析的根分泌物中的化感物质。因此，上述报告的化感物
17、质只是根分泌物中的一部分，可能还有一些分泌量较少，但毒性较强的化感物质没有被 检测出来。值得一提的是，除根系分泌物以外，黄瓜植株淋溶物、残茬分解物乃至自身挥发物也有可能导致产生自毒作用物质。但在大田复 杂条件下， 这些化感作用物质在何种程度上影响黄瓜生长还有待于研究。本文研究表明，低质量浓 度的酚酸对黄瓜根部枯萎病菌菌丝生长有刺激作用，吴 凤芝等用连作土壤浸出液及土培黄瓜根系分泌物也得出相似结果 12。此外，研究表明酚酸物质对黄瓜幼苗根表皮 细胞细胞膜造成损伤 13，影响根部对 养分的吸收 5，抑制作物种子萌发及幼苗生长 9,14等，可 见，根分泌物中酚酸物质对黄瓜连作病害发生有双重作用，一方
18、面它使植株本身受到伤害，使其生 长势变弱，抗逆性下降。另一方面，它直接刺激病原菌的生长，使作物连作以最直观的表象土传病害增加的形式表现出来。表 1 根分泌物收集液中酸性、中碱性组分不同添加量对黄瓜种子胚根伸长影响Table 1 Effect of acid, neutral and alkaline fraction of cucumber exudates on the elongation of radicle胚根 长/mm添加量/mL对照 酸性组分 中碱性组分0.1 48.3 51.90.2 47.8 57.00.4 45.0 42.20.850.535.6 45.6表 2 酚酸物 质对
19、黄瓜枯萎病菌菌丝生长影响Table 2 The effect of phenolic compounds on hypha growth of cucumber wilt枯萎病菌菌落平均直径 /mm酚酸种类 (酚酸)/(mgL -1)42 h 64 h对照 0 23.75 31.510 25.6* 36.5*25 25.8* 35.5*50 25.57* 34.03100 23.33 32.5对羟基苯甲酸150 23.27 32.2710 25.13 35.47*25 25 35.27*50 24.83 35.33*100 23.33 33.47香草酸150 22.67 33.3310 26*
20、 34.5725 26.1* 33.9750 25.5 32.67100 24.57 33.5阿魏酸150 21.33* 31.0710 24.43 3425 25.67* 34.250 24.33 32.03100 23.77 30.1苯甲酸150 20.33* 29.1710 25.97* 36.6*25 25.43 36.17*50 24.87 33.83100 17.97* 29.33苯丙酸150 17.7* 27.67*注：运用统计软件 SPSS(V10.0) Dunnett 法进行方差分析，*P0.05 ，*P0.01胡元森等：黄瓜根分泌物中化感物质的鉴定及其化感效应 9574 结
21、论（1）GC-MS 鉴定黄瓜根分泌物中主要化感物质有苯甲酸、对羟基苯甲酸，香草酸，阿魏酸，苯丙酸等苯甲酸的衍生物。（2）收集得到的黄瓜根系分泌物中酸性、中碱性组分对黄瓜种子胚根伸长有抑制作用，其中酸性组分抑制作用更加明显。（3）质量浓度低于 50 mgL-1时，香草酸、苯甲酸等酚酸对枯萎病菌菌丝生长有刺激作用，而高于50 mgL-1时， 对菌丝生长有抑制作用。随处理时间延长，枯萎病菌对酚酸物质的耐受性增 强。参考文献：1 范小峰, 俞诗源, 范亚娜, 等. 黄土高原大棚黄瓜不同年限连作对土壤主要理化性状的影响. 中国土壤与肥料, 2006 (6):20-22.FAN Xiaofeng, YU
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32、sporumHU Yuansen1, 2, LI Cuixiang1, DU Guoyin2, LIU Yafeng2, JIA Xincheng21. College of Bioengineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450052, China; 2. College of Life Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, ChinaAbstract: Allelochemicals, secreting or releasing from ro
33、ot in course of crop growth, were generally regarded as an important factor inducing continuous cropping obstacles. To gain insight into the nature of allelochemicals and root disease incidence, the aqueous exudates collected by XAD-4 resin was identified by GC-MS technique, whereafter the effect of
34、 root exudates on cucumber radicle as well as phenolic compounds on F. oxysporum growth was investigated. Results revealed that the main components of root exudates were identified as benzoic acid and its ramification such as vallinic acid, ferulic acid, benzene-propanoic acid and p-hydroxybenzoic a
35、cid. Additionally, some long chain fatty acid including hexadecanoic acid, octadecanoic acid, butanedioic acid, tetradecanoic acid were also detected. The acid, neutral and alkaline components of collected exudates showed a certain restrain effect on cucumber radicle elongation, but the restrain eff
36、ect of acid component was more apparent. Within 42 hours, F. oxysporum growth was stimulated under low concentration of 50 mgL-1, and restrained when higher than 50 mgL-1. After 64 hours, however, the tolerant ability to phenolic compounds enhanced and the repress effect was not so evident. Our work contributed much to the mechanism of continuous cucumber cropping in the view of rihzosphere microecology.Key words: cucumber (Cucumis sativus L); root exudates; GC-MS; radicle; cucumber wilt
