1、本科毕业论文（20届）榨菜低盐腌制体系中优势种群的分子鉴定及分析所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录中英文摘要引言11材料与方法111实验材料1111原料和培养基1112主要试剂和仪器112实验方法2121榨菜腌制的生产工艺流程2122榨菜腌制生产的操作要点2123腌制过程中榨菜体系中的乳酸菌数和酸度的检测212416SRDNA序列检测技术构建基因文库22结果与分析321腌制过程中榨菜体系中不同时期的总乳酸菌数以及腌制液PH的测定322不同腌制时期腌制液样品总DNA的提取及其PCR扩增结果423榨菜腌制体系中细菌16SRDNA的PCR扩增结果524榨菜腌制体系中细菌
2、16SRDNA基因克隆文库的构建525榨菜腌制体系中优势种群样品16SRDNA系统发育分析63结论8致谢9参考文献10附录11摘要采用分子生物学上构建16SRDNA克隆文库的方法对5盐度榨菜腌制体系中的不同腌制时期的优势种群进行了多样性分析，为揭示榨菜低盐腌制体系中优势种群的分子类型和榨菜腌制风味之间的关系奠定基础。本研究在不同时期随机各检测了40个克隆子序列，结果表明，整个腌制体系中的优势种群为乳酸菌。主要分为3个属乳杆菌属LACTOBACILLUS、明串珠菌属LEUCONOSTOC和魏斯氏菌属WEISSELLA。并且，各个腌制时期的菌落组成差异较大。在腌制中前期，主要的优势种群是清酒乳杆菌
3、LACTOBACILLUSSAKEI。到了腌制后期，起主导作用的种群变成了植物乳杆菌LACTOBACILLUSPLANTARUM。关键词榨菜低盐腌制；16SRDNA克隆文库；优势种群；系统发育分析ABSTRACTTHEDOMINANTSPECIESDIVERSITYOF5LOWSALTPICKLEDMUSTARDTUBERPROCESSINGWASSTUDIEDBYTHECONSTRUCTIONOF16SRDNACLONELIBRARYINDIFFERENTPHASES,WHICEWEREREVEALEDTHEMOLECULARTYPEOFDOMINANTSPECIESINLOWSALTPIC
4、KLEDMUSTARDTUBERPROCESSING,ANDLAIDTHEFOUNDATIONFORTHERELATIONSHIPABOUTTHEFLAVOROFTHEPICKLEDMUSTARDTUBER40CLONESWERERANDOMLYSELECTEDFROMTHELIBRARYINTHEDIFFERENTPHASESTHERESULTSINDICATEDTHATTHEDOMINANTSPECIESWASLACTICACIDBACTERIADURINGTHEPROCESSING,ANDCOULDBEDIVIDEDINTOTHREEGENUSESLACTOBACILLUS,LEUCON
5、OSTOCANDWEISSELLAINADDITION,THEDIFFERENCESOFBACTERIACOMPOSITIONSWARELARGEINDIFFERENTPHASESINTHEPROPHASEANDINTERIM,THEDOMINANTSPECIESWASLACTOBACILLUSSAKEI,WHILEINTHELATERPERIOD,THEDOMINANTSPECIESWASLACTOBACILLUSPLANTARUMKEYWORDSLOWSALTPICKLEDMUSTARDTUBERPROCESSING16SRDNACLONELIBRARYDOMINANTSPECIESPHY
6、LOGENETICANALYSIS30引言蔬菜的腌制加工，在我国已有悠久的历史。在我国的秦朝以前，我们的祖先们就已经开始了制作肉酱、酸菜、泡菜和腌菜了。在礼记内则中，就有了用盐腌制牛肉、葱和姜的记载1。勤劳聪慧的劳动人民在长期的生产实践中积累了丰富的经验。榨菜在我国的种植面积广，产量高，是主要的腌制加工蔬菜和世界三大酱腌菜之一，其中富含有维生素C，铁、磷等矿物质和氨基酸、蛋白质等2。传统的榨菜腌制工艺均采用高盐进行腌制。如此一来，腌制得到的成品菜盐度很高。然而，医学研究成果表明，食用过多的食盐易导致高血压，并且对人体的某些器官会造成永久性的损坏。所以，我国人民对高盐腌制食品也越来越排斥，取而代
7、之的低盐腌制榨菜产品正在占领市场3。榨菜腌制过程中，含有丰富的微生物体系，并且在不同的时期，微生物种群体系也在发生着变化4。其中乳酸菌种对榨菜的腌制贡献颇大5。随着分子生物学技术的发展，食品微生物的分子生物学研究进入了一个新阶段，人们对于微生物在分子和基因水平的认识不断深入。近年来，单链构象多态性检测（SSCP）技术方法已经广泛的应用到环境和食品（包括腌制榨菜）微生物的研究中6。SSCP方法是一种可以快速、简便的研究微生物群落结构的方法，但是所测序列较短，个别菌落可能只能确定到科、属阶段，无法精确的鉴定到种。然而，16SRDNA序列检测技术却很好的弥补了这种不足。16SRDNA序列既有保守性，
8、又具有高变性，是目前在细菌分子的分类和鉴定中经常使用的一种检测方法7。保守性可以反映生物物种的亲缘关系，给分析系统发育提供了线索。高变性能则可以表明生物物种的特征核酸序列，并且具有种、属的结构特征。所以高变性是生物种属鉴定的分子基础8。16SRDNA序列分析是对微生物的16SRDNA/RRNA进行特异性扩增后，再对其核苷酸序列进行测定，并且与已知生物的16SRDNA序列进行比较，以此进行分子鉴定和系统学的研究9，是最具权威性和准确性的检测方法之一。本研究即采用16SRDNA序列克隆文库的方法，对5的低盐榨菜腌制体系中的微生物种群体系通过测序并且与已知序列比较确定细菌种类，以揭示榨菜低盐腌制体系
9、中不同时期的优势种群的细菌组成，同时也可以通过克隆文库中克隆子出现的频率来了解样品的细菌组成比例。1材料与方法11实验材料111原料和培养基市售青菜头（榨菜），5盐度榨菜腌制液供试的MRS固体培养基的组成蛋白质100G、牛肉膏100G、酵母膏50G、柠檬酸氢二铵20G、葡萄糖200G、吐温8010ML、乙酸钠50G、磷酸氢二钾20G、硫酸镁058G、硫酸锰025G、琼脂180G、蒸馏水1000ML、PH6266。供试的LB液体培养基的组成蛋白胨100G、酵母提取物50G、NACL50G、水1000ML、PH70。供试的抗性LB固体选择性培养基的组成蛋白胨100G、酵母提取物50G、NACL50
10、G、琼脂1520G、水1000ML、氨苄西林AMP100MG/ML、PH70。112主要试剂和仪器试剂土壤DNA提取试剂盒（FASTDNASPINKITFORSOIL），UNIQ10柱式DNA胶回收试剂盒，5TBE电泳缓冲液贮液、1琼脂糖电泳凝胶；10BUFFER、DNTP、EXTAQ酶、DNAMARKER购自宝生物工程有限公司；大肠杆菌感受态细胞购于上海生工生物工程有限公司；80无菌甘油，溴化乙锭EB。仪器LRH190S型恒温恒湿培养箱广东省医疗器械厂生产；LDZX40BI型立式蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂生产；AB104M型电子分析天平海特勒托利多仪器（上海）有限公司；PHS25型数显PH
11、测试仪上海精密科学仪器有限公司生产；NNK653S型松下烧烤微波炉；双控电泳仪北京市君意机电技术公司制造；显微图像操作仪ALPHAINNOTECH；TGL20M型高速台式冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司；PCR仪EPPENDORF上海中贸集团公司；电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司；SWCJ1FD型单人单面净化工作台；海尔冰箱。3112实验方法121榨菜腌制的生产工艺流程原料预处理切分（控制榨菜的规格）预腌腌制、保藏122榨菜腌制生产的操作要点1221原料预处理、切分将从市场买回的新鲜榨菜的表面的异物用水清理干净，以免影响实验结果。将洗净的榨菜切分成051CM的薄片，称重。预腌所用的塑
12、料桶、石块等均需事先用开水烫过、洗干净。1222预腌按切好的榨菜片总重的5添加食盐在塑胶桶内进行预腌10。预腌是先放一层榨菜，再撒一层食盐，然后再放一层榨菜，再放一层食盐，依次进行，榨菜放完食盐也要放完，而且食盐的量要自下而上依次增多，最上面一层要为食盐，然后用保鲜膜将装有榨菜和盐的塑料桶封住，最后用石块压紧，预腌24小时，以控出水分。1223腌制、保藏经过预腌后，将榨菜片和腌制浸出液分开称量，按总重的05添加葡萄糖，总重的01添加氯化钙，以菜水21的比例进行装坛；如果水不够，则按比例另外配好葡萄糖、氯化钙、食盐溶液添加11。将榨菜片和汁液装坛后，用洗干净的石头压紧。盖上坛盖后，加水密封。12
13、3腌制过程中榨菜体系中的乳酸菌数和酸度的检测在腌制过程中，分别取第5天、第10天、第15天和第20天的腌制液，进行梯度稀释，然后取合适的梯度分别涂布于MRS固体培养基平板上，培养两天后计数，分别得到腌制过程中榨菜体系中不同时期的总的乳酸菌数。另外，将取样得到的腌制液通过PH检测仪测定其酸度，得到榨菜腌制体系在不同时期的酸度变化。实验过程中所使用的试管、三角瓶、移液管等均为灭过菌的无菌仪器。12416SRDNA序列检测技术构建基因文库1241样液的制取分别在榨菜腌制过程中的第5天、第10天和第20天的时候，用事先灭好菌的移液管吸取大约70ML的榨菜腌制液，放置于无菌三角瓶中备用。1242细菌DN
14、A的提取采用土壤DNA提取试剂盒进行细菌DNA的提取，首先将采集得到的榨菜腌制液通过高速冷冻离心机在10000R/MIN、4的条件下离心10MIN，收集菌体，去尽培养液。在沉淀中加入978LSODIUMPHOSPHATEBUFFER，用移液枪反复吹打，使之重悬，混匀后，将混合液转移到一个LYSINGMATRIXE管子中，然后加入122ULMTBUFFER，用混离器（或漩涡震荡仪）振荡混匀约10MIN。震荡混均后，在转速12000R/MIN下离心1MIN。取其上清液到干净的15ML的EP管中，加入250LPPS至上清液中并反复用手颠倒10次左右进行混匀。接着在转速12000R/MIN下离心5MI
15、N，弃去沉淀，将上清液转移到2个干净的EP管中。在得到的这两管上清液中，分别在每管中加入05MLBINDINGMATRIXA液（使用前应摇匀），反复颠倒持续混匀2MIN。将得到的混合物转移到一个干净的SPINFILTER管中，在转速12000R/MIN下离心1MIN，倒掉下层液体，把剩余混合物依旧加入之前的SPINFILTER管中，再次在转速12000R/MIN下离心1MIN，倒掉下层液体，依次继续，直到混合物离心完为止。在得到的沉淀中，加入500L的SEWSM到SPINFILTER管中，用移液枪轻轻反复吹打，使其悬浮。接着在转速12000R/MIN下离心1MIN，去除滤液。为确保沉淀的纯度，
16、再次在12000R/MIN空管离心2MIN，然后弃去原来得呃CATCHTUBE，换一个干净的CATCHTUBE，室温下干燥5MIN。接着在得到的沉淀中加入100LDES液并混匀，55水浴5MIN，并在水浴23MIN时轻轻吹打一次，以此来提高DNA分子的洗脱率。然后在转速12000R/MIN下离心1MIN，弃去沉淀，收集到的滤液即为样品细菌DNA。将得到的细菌DNA在20冷藏备用。1243细菌16SRDNAPCR扩增将上述制备的细菌基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用50L体系进行PCR扩增12。16SRDNA32的PCR扩增总体系为50L10PCRBUFFER（MG2FREE）5L，MGCL
17、25L，DNTPMIX（25MMOL/L）8L，引物27F（10MOL/L）1L，引物1492R10MOL/L1L，基因组DNA模板1L，EXTAQ酶（5U/L）04L，用超纯水（DDH2O）补足反应总体积至50L。16SRDNA扩增引物采用通用引物13，正向引物为27F5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3对应于大肠杆菌ECOLI的827位）；反向引物为1492R5GGTTACCTTGTTACGACTT3（对应于大肠杆菌ECOLI的14921510位）。PCR的循环参数为94预变性5MIN，94变性50S，52退火50S，72延伸1MIN30S，以此为一个循环，进行30个循环后，72末
18、端延伸10MIN。预先制备质量分数是10的琼脂糖凝胶，待扩增反映完毕后，取5L的PCR产物与1L6加载缓冲液混合，加样品于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，90V直流电压电泳仪上电泳30MIN，电泳液为05EB。电泳后，于ALPHALMAGERTM2200型紫外透射分析仪中检测。如果PCR成功，则可见到约为1500BP大小的条带。然后采用琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行切胶纯化回收14。并且将纯化后的片段与PMD18T载体进行连接。1244重组DNA转化大肠杆菌转化所用的大肠杆菌DH5感受态细胞15购买于上海生工。按每200L菌液加100NG已纯化的质粒DNA（无菌操作）的标准，将510LDNA
19、的连接物加入一管感受态细胞中，混匀后放置冰上30MIN。接着在42水浴锅中热激90S，迅速取出立即放于冰上2MIN（在水浴锅中热激时切勿乱晃动）。上述各管中分别加入800L37预热过的LB液体培养基至总体积为1ML，混匀后37180R/MIN培养一个半小时左右至菌复苏（并使转化体产生抗性）。接着用灭过菌的涂布棒将200L的菌液涂布于加了氨苄西林抗生素的LB固体选择性培养基，涂匀，凉于超净工作台上一小时左右至菌液完全被培养基吸收。以上步骤均应在无菌环境中操作，以防细菌被污染。最后将涂布并完全吸收了菌液的培养皿置于培养箱中，于37倒置培养14H左右。平板上长出的白斑（抗性菌落）即为阳性克隆子16。
20、采用无菌牙签挑选阳性克隆子，进行鉴定。1245阳性克隆子的鉴定及检测用特异引物M13和M13随机检测转化得到的克隆子是否为阳性克隆，再用M13和27F这两个引物来确定次阳性克隆子的引物结合端，最后将检测合格者，每个时期各选出40个阳性克隆子，送去上海英俊生物技术有限公司完成测序。最后通过BLAST软件，将测序获得的序列与GENBANK进行比对。具体的检测方法为将上述得到的在平板上长出的抗性菌落选出10株，分别在含有氨苄西林AMP抗生素的LB液体培养基中培养15H左右，以此作为PCR扩增模板，进行PCR扩增，16SRDNA的PCR扩增体系为25L10PCRBUFFER（MG2FREE）25L，M
21、GCL225L，DNTPMIX（25MMOL/L）1L，M13或引物27F（10MOL/L）08L，M1308L，基因组DNA模板1L，TAKARARTAQ酶（5U/L）025L，用超纯水（DDH2O）补足反应总体积至25L。PCR循环参数94预变性8MIN，94变性50S，54退火50S，72延伸90S，以此为一个循环，进行30个循环后，72末端延伸10MIN。预先制备质量分数是10的琼脂糖凝胶，待扩增反映完毕后，取5L的PCR产物与1L6加载缓冲液混合，加样品于琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，90V直流电压电泳仪上电泳30MIN，电泳液为05EB。电泳后，于ALPHALMAGERTM2200型
22、紫外透射分析仪中检测。1246系统发育树的构建将测序得到的序列结果采用DAMBE、DNASTAR、MEGA41等软件进行编辑、分析，并把编辑好的序列提交到NCBI的GENBANK核酸数据库中进行BLAST同源性检索后下载同源性序列，序列相似性97的认为是一个同样的类型并且用一个单独的序列来代表17，并且确定其相似种属。系统发育树的绘制使用MEGA41软件完成，算法为临位相连法18（NEIGHBORJOININGANALYSIS）。2结果与分析21腌制过程中榨菜体系中不同时期的总乳酸菌数以及腌制液PH的测定33对5的低盐榨菜腌制体系中在不同的腌制时期内乳酸菌数变化进行检测，实验结果如图1所示，0
23、510152025303540450510152025时间D乳酸菌数107个/ML图1榨菜腌制体系中不同时期总乳酸菌数的变化对5盐度的榨菜腌制体系在不同的腌制时期内腌制液PH的变化进行检测，实验结果如图2所示，012345670510152025时间/DPH值图2榨菜腌制体系中不同时期腌制液的PH变化通过测定榨菜腌制过程中不同时期腌制体系中的乳酸菌数以及腌制液PH的变化，由上面的图1和图2中得到的结果可以看出在图1中，榨菜腌制体系中的乳酸菌数在腌制过程中的前五天增长缓慢，从第5天开始到腌制中期（第13天左右）增长迅速，在第13天达到最大值，在后期细菌数则开始减少。在图2中，榨菜腌制体系中腌制液
24、的PH在整个腌制过程中都是呈酸性的，并且在腌制前期PH不断降低，即腌制液的酸度不断增加，而到了腌制后期，腌制液的PH又开始增高，即腌制液的酸度降低。结合图1和图2，综合分析可以得出，在榨菜的腌制过程中，腌制液PH的变化主要受乳酸菌数变化的影响，在腌制前期，随着乳酸菌数量的增长，腌制液的PH随之降低，当乳酸菌数量达到最大时，腌制液的PH也降到最低，酸度达到最大；随后，在腌制后期，由于腌制体系中营养环境及其他条件的改变，致使乳酸菌的生长受到抑制，乳酸菌数不断下降，腌制液的PH也随之增加。在榨菜的整个腌制腌制过程中，由于腌制液的PH总体呈酸性，而在酸性条件下，在H的作用之下，微生物细胞的蛋白质胶体等
25、电点会发生变化而导致蛋白质凝固，使其性质完全改变，正常代谢会被破坏，微生物会受到毒害，从而抑制微生物的生长，而乳酸菌却不会受到影响，因此整个腌制过程中乳酸菌为优势菌种。22不同腌制时期腌制液样品总DNA的提取及其PCR扩增结果34对5盐度榨菜腌制体系中不同腌制时期的腌制液分别进行总DNA的提取，经PCR扩增后，进行电泳检测。有实验结果知，提取的各个时期腌制液中总DNA片段大约在21KB左右处有一很明显的主带，提取的DNA片段较为完整，并且纯度较高。说明此低盐榨菜腌制体系的不同腌制时期都有一种微生物是占绝对优势的。总DNA琼脂糖凝胶电泳的条带干净，没有明显的拖尾现象，表明之前提取得到的总DNA较
26、理想。23榨菜腌制体系中细菌16SRDNA的PCR扩增结果利用细菌通用引物27F和1492R进行细菌16SRDNA的PCR扩增，经电泳检测，可以得到1500BP左右大小的条带，如图3所示。由实验结果知，PCR反应特异性较好，满足接下来的16SRDNA克隆文库的构建的需求。用PCR扩增法验证阳性克隆，有1500BP左右大小的特异性条带的样品为阳性克隆，反之为阴性，最后挑取阳性克隆构成细菌的16SRDNA基因文库，并且记录各阳性克隆的的编号。图3第5天样品的部分16SRDNA文库PCR扩增后的琼脂糖凝胶电泳图（M，DL2000MAKER；112,第5天样品的部分阳性克隆子的PCR扩增产物；13，空
27、白对照）24榨菜腌制体系中细菌16SRDNA基因克隆文库的构建随机挑取不同时期样品各40个阳性克隆子，对总共的这120个阳性克隆子进行测序，测序结果在GENBANK数据库中进行BLAST比对，将序列比对结果相同的克隆子定义为一个操作单元OPERATIONALTAXONOMICUNIT,OTU,共得到98个OTU，其中这些OTU均属于乳杆菌目中的不同乳酸菌属和乳酸菌种。并且这些克隆子与GENBANK数据库中已知细菌的16SRDNA序列的相似性最高为100，最低为90，其中96个克隆子与已知序列相似性高于95。归纳不同时期的OTU到确定的乳酸菌种中，结果如表1所示。由表1可得知，5盐度的榨菜腌制体
28、系，在腌制5天时，榨菜腌制液中优势种群主要有三个乳酸菌属，分别为乳杆菌属LACTOBACILLUS、明串珠菌属LEUCONOSTOC及魏斯氏菌属WEISSELLA。其中清酒乳杆菌LACTOBACILLUSSAKEI占绝大多数，为375。并且干酪乳杆菌（LACTOBACILLUSCASEI）为五天腌制液所独有。当榨菜腌制到第10天时，腌制体系中的优势乳酸菌种类也发生了变化，其中主要也有三个乳酸菌属，清酒乳杆菌（LACTOBACILLUSSAKEI）也还是占优势，为47，并且在此期间，弯曲乳杆菌（LACTOBACILLUSCURVATUS）数量有所增加，干酪乳杆菌（LACTOBACILLUSCAS
29、EI）消失，出现了十天期间腌制体系中所独有的LACTOBACILLUSGRAMINIS菌株。当榨菜腌制到第20天时，榨菜体系中的优势菌株发生了巨大变化，魏斯氏菌属消失，乳杆菌属占绝对优势，并且在此期间，植物乳杆菌（LACTOBACILLUSPLANTARM）的数量增加，为总数的636，并且出现了LACTOBACILLUSCORYNIFORMIS菌株和短乳杆菌（LACTOBACILLUSBREVIS）。BP2000100012345678910111213M35表116SRDNA克隆文库法分析不同时期样品的主要细菌组成菌属名菌种名不同时期的OTU数量5D10D20DLACTOBACILLUSLA
30、CTOBACILLUSSAKEILACTOBACILLUSSPLACTOBACILLUSCURVATUSLACTOBACILLUSCASEILACTOBACILLUSGRAMINISLACTOBACILLUSPLANTARUMLACTOBACILLUSCORYNIFORMISLACTOBACILLUSBREVIS1216233136212116LEUCONOSTOCLEUCONOSTOCKIMCHIILEUCONOSTOCINHAELEUCONOSTOCGASICOMITATUMLEUCONOSTOCGELIDUMLEUCONOSTOCCITREUMLEUCONOSTOCPSEUDOMESEN
31、TEROIDES32311122111WEISSELLA2225榨菜腌制体系中优势种群样品16SRDNA系统发育分析近年来，分子系统发育分析已经成为了现代系统发育研究的重点，特别是对RDNA基因的同源性分析，在微生物多样性的研究中发挥着越来越重要的作用19。将送去测序的阳性克隆子得到的碱基序列在GENBANK数据库中进行BLAST比对，在同源性检索后下载同源性的序列，在MEGA41软件中采用邻接法绘制5盐度榨菜腌制体系中不同腌制时期内优势细菌的系统发育树见图4，图5及图6。分别由图4、图5及图6可得知，5低盐榨菜腌制体系中，5天、10天及20天的的榨菜腌制液的优势种群基因文库都具有较高的细菌多
32、样性，每个时期检测出的40个克隆子分别与属于乳杆菌属（LACTOBACILLUS）、魏斯氏菌属（WEISSELLA）、明串珠菌属（LEUCONOSTOC）等3个乳酸菌属的10个左右的不同的乳酸菌种的已知细菌聚类在一起。36图4腌制5天时榨菜腌制体系中优势种群的系统发育树图5腌制10天时榨菜腌制体系中优势种群的系统发育树37图6腌制20天时榨菜腌制体系中优势种群的系统发育树3结论本实验通过测定榨菜腌制过程中腌制体系中乳酸菌和腌制液PH的变化，得知腌制环境中腌制液的PH值先呈现出下降趋势，而到后期却有回升。并且整个腌制体系始终保持在酸性环境中，PH从最初的65下降到最终的395，最低值达到343，
33、乳酸菌数目也经历了一个先急速增加后急速下降的过程，这是乳酸菌发酵代谢的结果。本文采用构建16SRDNA克隆文库的方法分析了5低盐榨菜腌制体系中的优势种群的细菌组成。结果表明，5低盐榨菜腌制体系在不同的腌制时期内，腌制液中的优势种群的组成具有很大的差异在榨菜腌制前期和中期，优势种群乳杆菌科含有三个不同的种属，分别是乳杆菌属LACTOBACILLUS、明串珠菌属LEUCONOSTOC和魏斯氏菌属WEISSELLA，其中的优势菌种是清酒乳杆菌LACTOBACILLUSSAKEI。在榨菜腌制的后期，腌制体系中的魏斯氏菌属WEISSELLA消失。此时的优势菌种是植物乳杆菌（LACTOBACILLUSPL
34、ANTARM），并且还出现了前中期没有的短乳杆菌（LACTOBACILLUSBREVIS）菌株。作为一种新兴的技术手段，16SRDNA克隆文库的方法最大的优点就是可以不经过细菌的分离培养，而直接对样品进行分析。将得到的微生物16SRDNA序列提交到GENBANK，采用BLAST程序与已知的序列进行相似性比对，得到原始样品中微生物的菌群和数量信息，从而揭示微生物的多样性，进而可以进行微生物的分类系统发育分析20。38参考文献1李利军,卢美欢,关安生,等陕西酱腌菜生产技术现状及发展对策研究J中国调味品,2009,341143462吴祖芳,刘璞,翁佩芳榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进展J食品与发酵
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