提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤模板.doc

上传人:hw****26 文档编号:2361473 上传时间:2019-05-08 格式:DOC 页数:6 大小:235.80KB
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资源描述

1、【一、提 RNA】一、实验准备:1、试剂:75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口 EP 管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA 专用)、2、配 75%乙醇(DEPC 水+无水乙醇),放-20冰箱预冷;3、预冷离心机(1.5mL EP 管用的);4、清洁桌面,酒精喷过之后擦干,新手套、两层口罩;二、操作步骤:01、弃上清(不回收,直接倒去);02、1mL/孔 PBS 洗两遍(不回收,直接倒去,随后用 200L 枪吸尽 PBS);03、每孔加 500L Trizol,轻晃,随后室温放置 2min 左右;04、枪头吹打,吸出放入 1.5mL 进口 EP 管;05、加入 100L 氯仿(即 1/5 体

2、积的 trizol);06、4离心机,12000g,15min;07、吸 200L(可减少)上清放入新的 1.5mL 进口 EP 管中(注意:只能吸到上清);08、加入等体积异丙醇,充分混匀,常温放置 10-30min(15min);09、4离心机,12000g,10min;10、倒掉液体,加入 1mL 预冷的 75%乙醇剧烈混匀;11、4离心机,7500g,5min;12、倒掉上清,加入 1mL 预冷的 75%乙醇,混匀;13、4离心机,7500g,5min;14、倒掉上清,倒扣在餐巾纸上,5-10min,用针头或者 200 微升枪头去掉管壁上的水珠;15、每管中加入 40L(40-60L)

3、的 DEPC 水,吹打溶解;16、测浓度(先知楼 21 楼测 RNA 浓度,带 DEPC 水、灭菌的 dd 水、10 微升枪和枪头);三、注意事项01、如果当时不测 RNA 浓度,可暂时把 RNA 放在-20冰箱。但长时间(24h)保存,需要放在-80冰箱;02、异丙醇作用是沉淀 RNA,作用比乙醇好;03、04、05、06、07、08、09、【二、测 RNA 浓度】一、实验准备:01、先知楼 21 楼-2109 教室,一个冰盒+DEPC 水+10 微升枪、灭菌 dd H2O、10L 枪头(RNA 专用)、本子+笔;二、操作步骤:01、登记;02、打开电脑=打开“N”软件=点击“Nucleic

4、 acid”=选择“OK”=选择“RNA”;03、灭菌 dd H2O 清洗 2-3 遍,擦干;04、DEPC 水 校零:即加 DEPC 水一滴,点击“Blank”,擦干;05、测 RNA:加样品一滴,点击“measure”,擦干,随后加下一个样品;06、记录数据,包括 RNA 浓度(0.1。(请注意,这个值跟仪器无关,核酸的吸光度必需大于 0.1,其值才有效和可靠,因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收,其值加 1 号试剂(2L)=加 3 号试剂(0.5L)=加 4 号试剂(0.5L)=加 2 号试剂(0.5L)=加 RNA=离心=上机;02、上机:OPEN=点击“User

5、”菜单下的“clx”,点击“Accept”=选择“run”下面的到“exp001 rt”=修改体系“10L”(默认为 25 微升)=点击“Start”,进入界面;03、37.0 15min=85.0 5s=4.0 60min;04、4冰箱保存;三、注意事项01、加液尽量无气泡,枪不要打到底;02、严格冰上操作,防止 RNA 降解;【qRT-PCR】一、实验准备:01、试剂:Roche 的 SyBr Green(rox)02、1.5mL EP 管、0.2mL EP 管、96 孔板/八连冠;10L、20L、100L、200L、2.5L、1000L 枪;03、冰盒一个、Rox 化冻(避光)、引物化冻

6、(GAPDH)、cDNA、DEPC 水;二、操作步骤:01、 Rox 10L;+ dd H2O 6L;+ P1(F) 1+ P2(R) 1+ cDNA 2-20L 体系02、计算:每个样,X 个抗体(至少包括 GAPDH-内参,还有目的),三个副孔。即如果六个样,2 个抗体(GAPDH,PLK1),三个副孔。6*1*3=1820(PLK1),6*1*3=1820(GAPDH);1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 126/PLK1 6/PLK1 6/PLK1 5/PLK1 5/PLK1 5/PLK16/GAP 6/GAP 6/GAP 5/GAP 5/GAP 5/GAP4/PLK1 4

7、/PLK1 4/PLK1 3/PLK1 3/PLK1 3/PLK1 2/PLK1 2/PLK1 2/PLK1 1/PLK1 1/PLK1 1/PLK14/GAP 4/GAP 4/GAP 3/GAP 3/GAP 3/GAP 2/GAP 2/GAP 2/GAP 1/GAP 1/GAP 1/GAPPLK1Rox:10*20=200LDEPC 水:6*20=120LF:1*20=20LR:1*20=20LGAPDHRox:10*20=200LDEPC 水:6*20=120LF:1*20=20LR:1*20=20L03、稀释 cDNA 10 倍(18L DEPC 水+2L)=配置 Mix(Rox+ DE

8、PC 水+F+R)=加样(一横排先加 18L mix(GAPDH),随后加入 18L mix(PLK1)。随后六个孔加同一个 cDNA;06、去除气泡:加好样后,观察有无气泡。如果有气泡,弹开,随后2000rpm 离心,时间不定(5s 即可);07、上机+设置程序:A、双击打开程序“ StepOne Software v2.1 ”=点击“ OK ”=点击“Ignore 1.5;3;6;9;12) ,则点击“Add New Sample ”,出现 “Sample 1、Sample 2、Sample 3、Sample 4、Sample 5、Sample 6”六个=将其重命名;Plate Setup

9、 界面-Assign Targets and Samples 界面:GAP/1 GAP/1 GAP/1 GAP/2 GAP/2 GAP/2 GAP/3 GAP/3 GAP/3 GAP/4 GAP/4 GAP/4Plk1/1 Plk1/1 Plk1/1 Plk1/2 Plk1/2 Plk1/2 Plk1/3 Plk1/3 Plk1/3 Plk1/4 Plk1/4 Plk1/4Akt/1 Akt/1 Akt/1 Akt/2 Akt/2 Akt/2 Akt/3 Akt/3 Akt/3 Akt/4 Akt/4 Akt/4PI3K/1 PI3K/1 PI3K/1 PI3K/2 PI3K/2 PI3K/2

10、 PI3K/3 PI3K/3 PI3K/3 PI3K/4 PI3K/4 PI3K/4GAP/5 GAP/5 GAP/5 GAP/6 GAP/6 GAP/6Plk1/5 Plk1/5 Plk1/5 Plk1/6 Plk1/6 Plk1/6Akt/5 Akt/5 Akt/5 Akt/6 Akt/6 Akt/6PI3K/5 PI3K/5 PI3K/5 PI3K/6 PI3K/6 PI3K/6D、Run Method 界面:设置温度;随后修改“Reaction Volume Per Well”,将其改为“20L 体系”;E、点击“Start Run”三、注意事项01、注意一定要禁止气泡。吸液体时,观察枪头中有没有气泡和液体;打加入液体时,延管壁加入,枪头只能打到第一档,随后观察枪头有没有打尽;02、加入引物时,一定要涡旋混匀;03、Rox 加入后,一定要避光;04、加入的液体一定要等量;

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