1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备与灭菌一、实验目的：1、学习并掌握培养基配制的原理，掌握配制牛肉膏蛋白胨培养基的方法和步骤。2、学习并了解高压蒸汽灭菌的原理和操作技术。二、实验原理：（一）微生物分离与纯化1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备与灭菌牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有牛肉膏、蛋白胨和 NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而 NaCl 提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下 96时溶化，一般实际应用时在下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在 40时凝固，通常不被微生物分解利用。由于这种培养基
2、多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其 pH 调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。三、实验仪器和试剂1、仪器： 分析天平；锥形瓶；移液管；高温电炉；容量瓶；烧杯；无菌培养皿；pH试纸；胶头滴管；玻璃试管；酒精灯；高压蒸气锅；玻璃棒；2、试剂：牛肉膏；蛋白胨； NaCl ；琼脂 ；蒸馏水；四、实验步骤：（一）分离纯化制备试验菌种的菌悬液1、培养基的配置配置牛肉膏蛋白胨的液体培养基，待培养基冷却后进行分装。将分装完毕后的培养基进行高压蒸汽灭菌；称量：按试验用微生物培养基配方，逐一称取各种药品放入烧杯中。液体培养基配方：牛肉膏 蛋白胨 NaCl 葡萄糖 蒸馏水0.6g 2g 1g 2g 200
3、ml溶解：将去蒸馏水加入到上述烧杯中使各种成分溶解，难溶的物质，例如蛋白胨、加热促进其溶解，待全部溶解后，加水补足加热蒸发的水量。制备固体培养基，加热融化琼脂时要不断的搅拌，避免琼脂糊底烧焦。调节 pH 值；初配好的培养基往往不能符合所需要的 pH 值，故需用 pH 试纸检测，并以一定浓度的盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节培养基溶液 pH 值至 78。分装：将调节好 pH 值的培养基分装于十支试管和两个锥形瓶中(注意防止培养基沾污管口或瓶口，避免浸湿橡皮塞塞引起杂菌污染)。分装液体培养基时，每支试管装的量为试管高度的 1/31/2，锥形瓶中各加入 250300ml 培养基。分装完毕后，将试管及锥形瓶
4、用橡皮塞塞紧，防止高压蒸汽灭菌时管内压力过大冲开。包扎：加塞后，在全部试管胶塞外包裹双层报纸，并用棉绳捆扎好，同样的，将两个锥形瓶也用同样的方法包扎好。最后，用记号笔注明培养基名称，日期。2、灭菌本试验采用高压蒸气灭菌法。加水，立式锅是直接加水至锅内底部隔板以下 1/3 处。把需灭菌的器物放入锅内(器物不要装得太满，否则灭菌不彻底)，关严锅盖(对角式均匀拧紧螺旋)，打开排气阀。启动电源开关。待炉内水沸腾后，蒸气将炉内冷空气驱净，关闭排气阀。升压，升温。关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸气不断增加，压力计和温度计的指针上升，当压力达到 1.05kg/cm2(温度为 121)即灭菌开始，这时开、关电源，保证压力维持在 1.05 kg/cm2，20min 左右。中断热源，达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到“0”时，打开排气阀(排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温度没下降而翻腾冲到棉塞处，既损失培养基又沾污了棉塞)。揭开锅盖，取出器物，分装至无菌培养皿中，静置。二十四小时后观察是否有菌种出现。六、试验结论据观察，培养皿中没有菌种产生，说明本次实验的操作合格，没有大问题出现，实验成功。 （附图）10 级水环境检测与保护周超
