1、反胶束萃取技术在蛋白质分离和酶固定化上的应用和发展The application and development of Reversed micelle technology in protein separation and enzyme immobilization2011 年 10 月 6 日反胶束萃取技术在蛋白质分离和酶固定化上的应用和发展摘 要：反胶束是表面活性剂在有机溶剂中自发形成的与正常胶束结构相反的纳米尺度的一种聚合体。反胶束可用于蛋白质的分离、酶的固定化等生物上的物质的分离，是一种新型的生物分离技术，本文就该技术的原理、方法、在以上物质分离上的应用及其最新研究进展进行介绍。关
2、键词：反胶束； 萃取； 蛋白质分离； 酶固定化 The application and development of reversed micelle technology in protein separation and enzyme immobilizationAbstract: Reversed micelle is surfactants in organic solvents spontaneously formed with normal glue beam structure of the opposite of a kind of nanometer scale polyme
3、rs. Reverse micelle can be used for protein separation, such as enzyme immobilization of the separation of biological material, a new type of biological separation technology, this paper the principle and method of this technology in the application of more substances separation, and the latest rese
4、arch on progress into introduction.Keywords: reversed micelle; extraction ; protein separation; enzyme immobilization化工前沿讲座论文 第 0 页 共 7 页 1 引言传统的液-液萃取分离技术成本低，易于操作，已广泛用于多组分物质的分离。但由于缺乏具有良好选择性的生化溶剂，采用该技术难以分离蛋白质、核酸的生物活性物质。而反胶束萃取技术的发展，为解决萃取生物活性物质这一问题提供了可靠的方法。七十年代，Wells 等首次提出反胶束中的酶蛋白能具有活性，并在一定 PH 值和离子强度等条
5、件下，反胶束可用于提取酶蛋白。二十世纪八十年代，生物化学家对反胶束萃取蛋白质的原理及工艺条件作了深入研究。反胶束萃取技术因具有成本低，溶剂可重复利用，萃取率高，条件温和，不会引起蛋白质和酶变性的优点，到 20 世纪 90 年代成为生物工程的热门技术 1。另一方面，反胶束酶系统在生物反应中的催化作用研究也取得较大进，在反胶束酶系统中酶的定位和结构、酶的动力学特征、催化活性和稳定性等方面的基础理论研究，为进一步拓宽反胶束技术的应用领域打下良好基础。近年来，此技术又有了许多发展，如设计新表面活性剂和添加亲和性配基、反胶团乳化液膜萃取、用反离子表面活性剂反萃取胶团中酶蛋白及设计新的萃取设备等，解决了传
6、统方法中遇到的酶失活、萃取选择性差等问题，从而大大促进其工业应用的发展。1.1 反胶束相关理论反胶束（或反胶团）是表面活性剂在非极性有机溶剂中超过临界胶团浓度时自发形成的热力学稳定、光学透明的球状或圆柱状聚集体 2。表面活性剂的疏水的非极性尾部指向有机溶剂，亲水的极性头部指向聚集体内部形成一个纳米级大小的极性腔。此极性腔容纳一定量的水，其内部接近细胞内环境，不仅能溶解亲水性分子如氨基酸、多肽和蛋白质等，而且能保持它们的活性。1.2 反胶束技术及萃取原理反胶束（或逆胶束）是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成的与正常胶束结构相反的纳米尺度的一种含水聚合体。常用于形成反胶束的表面活性剂有“Aero
7、sol OT”(简称 AOT)（磺基琥珀酸二辛酯钠盐），CTAB（氯化三辛基甲基胺），磷脂酰乙醇胺等，而有机溶剂通常用四氯化碳、异辛烷、环己烷、苯、烷烃等 3。在反胶束中，组成反胶束的表面活性剂的极性基团朝内形成一个内表面，与平衡离子和水一起构成一个极性核心，称为“水池”，极性分子可溶于这个水池中。蛋白质就是被溶解于“水池”中而被分离萃取，酶也可以被固定在反胶束的“水池中”进行催化作用。表面活性剂溶于水中，当其浓度超过临界胶束浓度时，便形成聚集体，称为正常胶束。表面活性剂溶于有机溶剂，当其浓度大于临界胶团浓度时，会在有机相中形成聚集体称为反胶束。萃取时，待萃取的原料液以水相形式与反胶化工前沿讲
8、座论文 第 1 页 共 7 页 束体系接触，调节参数，使其中要提取的物质以最大限度转入反胶束体系（前萃取），后将含该物质的前萃液与另外一个水相接触，再调节 PH、离子强度等参数分离出提取物质。1.3 反胶束体系性质反胶束体系的性质常用 W0、N 和 等参数表示，其中 W0 是形成反胶束微粒的水分子与表面活性剂分子数之比，是衡量反胶束体系增溶能力最重要的参数。(mol/L)是增溶的水相对于有机相总体积的浓度，N 是组成反胶束微粒的表面活性剂分子堆砌数。一般 W0 越大，有机相形成反胶束微粒的直径越大，当W0 一定时， 和 N 决定了反胶束微粒的相对浓度。1.4 反胶束体系形成方法形成含蛋白质反胶
9、束的方法有三种 4：1.相转移法 将含有蛋白质的水溶液与含表面活性剂的有机相接触，在缓慢搅拌下，部分蛋白质移入有机相中，直接萃取平衡状态。2.溶解法 对于水不溶性蛋白质，将含水的反向微胶束有机溶剂与蛋白质固体粉末一起搅拌，形成含蛋白质的反胶束。3.注入法 向含有表面活性剂的有机相中注入含蛋白质的水溶液。1.5 影响反胶束体系形成原因一般认为，蛋白质在反胶束中的溶解作用，与蛋白质的表面电荷同反胶束的内表面电荷间的静电作用，以及反胶束的大小有关。所以，任何可以增强这种静电作用或导致形成较大反胶束的因素，均有助于蛋白质在反胶束中的溶解 5。实验表明，影响反胶束形成的因素有表面活性剂的种类和浓度、体系
10、中水分的含量、水相的酸碱度、水相的离子强度以及蛋白质分子大小等 4。2 反胶束技术的应用2.1 蛋白质的萃取分离有机相 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 水相反胶束 表面活性剂- - - - - - - - - - - - - - - - - 蛋白质 反胶束萃取蛋白质示意图化工前沿讲座论文 第 2 页 共 7 页 蛋白质的萃取过程是一个协同过程。即在宏观两相（水相和有机相）界面间的表面活性剂层，同邻近的蛋白质发生静电作用而变形，接着在两相界面形成了包含有蛋白质的反胶束，然后含蛋白质的反胶束
11、再扩散进入有机相，从而实现对蛋白质的萃取。上图表示蛋白质萃取过程和萃取后的情况 3。改变此体系水相的条件（例如 PH 值、离子强度等）又可以使蛋白质由有机相重新返回水相，实现反萃取过程。形成了含蛋白质的反胶束后，可用离心法或膜分离方法实现反胶束与混合液的分离。蛋白质的释放可采用反萃取或破乳的方法实现。陆强等 6的试验表明，选择正向萃取率最低时的 PH 值，离子种类和浓度等条件，反萃取率可达 90，蛋白质的萃取分离技术的具体应用主要有以下几方面：1）纯化和分离蛋白质 Nakashio 等 1选用一种或几种表面活性剂注入有机溶剂中，由此形成的反胶束溶液与蛋白质溶液接触，可以极其经济和便利地净化分离
12、蛋白质，且不会发生变性。如对于 0.5kg/m溶菌酶和 0.5kg/m肌红蛋白的混合溶液（两种蛋白质相对分子量相近，等电点分别为 11.1 和 6.8），它的盐浓度为 100mol/m，并用硼酸盐缓冲至 PH 值为 9.0，将此料液用 5-50mol/m二烷基磷酸异辛烷反胶束溶液萃取，则溶菌酶完全进入有机相中，而肌红蛋白则留在水相。2）从植物中同时提取油和蛋白质 从植物中萃取蛋白质,传统方法工艺复杂，得率低且蛋白质易变性。陈复生等 5研究用 AOT/异辛烷反胶束体系同时萃取花生蛋白和花生油，油被直接萃入有机相，而蛋白质则进入反胶束的极性核中，再以离心方法将其分离。油与有机溶剂用蒸馏方法分离，对
13、含蛋白的反胶束层进行反萃取，可得到未变性的蛋白质。3）从发酵液提取胞外酶 Rahaman 等 7采用浓度 250mol/m的 AOT/ 异辛烷反胶束溶液，从全发酵液中提取和提纯碱性蛋白酶，通过优化工艺过程,酶的提取率可达 50，陆强等 6研究从发酵液中以反胶束萃取胰蛋白酶，在适宜的条件下，酶的萃取和反萃取率都很高，显示该技术有良好的应用前景。4）直接提取胞内酶 Giovenco 和 Verheggen 等 7报道用反胶束萃取方法从全料液提取和纯化棕色固氮菌的胞内脱氢酶。在反胶束的表面活性剂作用下，菌体细胞先被溶裂，析出的酶进入反胶束中，再通过选取适当的反萃取液回收高浓度的活性酶。5）反胶束萃取
14、用于蛋白质的复性 重组 DNA 技术生产大部分蛋白,须溶于强变性剂中, 使它们从细胞中抽提出来。对蛋白质的复性过程通常要在非常稀的溶液中操作，以避免部分复性中间体的凝聚。 Hagen 等将单个蛋白质分子置于反胶束中，也能阻止这种有害作用。他们用 AOT/异辛烷反胶束溶液萃取变性的核糖核酸梅，将负载载有机相连续与水接触除去变性剂盐酸胍，再用谷胱甘肽的混合物重新氧化二硫键，使酶的活性完全恢复，最后由反萃取液回收复化工前沿讲座论文 第 3 页 共 7 页 性的，完全具有活性的核糖核酸酶，总收率达 50。2.2 酶的固定化20 世纪 80 年代中期，Wells 等人首先提出“在反胶束中的酶”的概念。反
15、胶束体系能较好的模拟酶的天然环境。所以在反胶束中，大多数酶能够保持较高的活性和稳定性，甚至表现出“超活性” 8。胶束酶学的研究权威 Martinek预言，胶束体系有可能成为生物转化的通用介质 9。反胶束酶系统具有以下几方面的优点：1）固定化：酶通过一定方法固定在反胶束中，酶系统可以反复使用，而且反胶束对酶形成保护作用，使其与有机溶剂分隔而保持活性。2）原位分离：反胶束酶系统对催化反应的抑制物或中间产物进行原位分离而减少或克服产物抑制。3）区域化：反胶束酶系统中，借助分子集约化手段，提供促进酶功能发挥的微环境，这种作用称区域化，使酶获得最适作用条件和稳定性，此外,反胶束酶系统还具有非常高的比表面
16、积，有利于底物和产物的相转移，产物的回收可通过相变调实现等优点。目前反胶束酶系统的应用主要有以下几方面：1）油脂的水解和合成 脂酶能催化具有工业价值的反应，如低级、高级脂肪间的转化，但脂酶仅能催化油水界面上的脂肪分子，对样脂肪体系无能为力。利用反胶束就可以解决这个问题，反胶束中的脂酶可催化脂肪的合成或分解。2）肽和氨基酸的合成 胶束酶催化合成肽的优点是能溶解非极性和极性的底物。Serralbeiro 11在反胶束体系中以-糜蛋白酶为催化剂成功地合成了二肽Acpheleu-NH2,并设计一个膜反应器用于产物分离。Eggers 12以Brij/Aliquat 336/环己醇为反应胶束体系，吲哚和丝
17、氨酸作为底物，色氨基酶为催化剂，在膜反应器中成功合成色氨酸。3）有害物质的降解 水中的芳香族化合物具有较强的毒性，一般物理化学方法难以去除，用酶催化进行氧化作用，可使芳香族化合物转为毒性较低的低聚物或高聚物，用于此类催化反应的多酚氧化酶不稳定,易受其它物质抑制,且反应以后酶难以再利用。Crecchio等 13将这种酶成功固定于反胶束中用于水中的芳香族化合物的解毒，反应产物是水不溶性的，易于分离。4）其他应用 反胶束酶系统还可应用于高分子材料的合成及药物的合成等方面。3 反胶束萃取研究的发展反胶束萃取技术作为一种新型的分离技术，人们对其进行了深入研究。尤其是在生物领域的应用，即蛋白质等生物分子通
18、过反胶束增溶于有机溶剂而不影响其活性，这是分离技术领域的一项突破。在基础理论方面，对反胶束萃取化工前沿讲座论文 第 4 页 共 7 页 的原理、影响因素、萃取过程的平衡特性、热力学模型和萃取动力学等方面都取得较大进展。在应用工艺开发上，Vant Riet等运用两个混合室组成混合-澄清单元，实验连续萃取和反萃取蛋白质的操作。近年来，反胶束萃取研究主要集中于新型反胶束体系的开发及萃取选择性的提高。常用于形成反胶束的表面活性剂AOT，存在反萃取率低，不适合于用于萃取分子量大的蛋白质等缺点。Hu等（1996）以HDEHP形成的反胶束用于于对细胞色素 C和-胰凝乳蛋白酶的萃取，其萃取率远高于AOT 1。
19、史红勤等 14在AOT 反胶束溶液中加入磷脂，能使反胶束的直径增大，并可提高血红蛋白和枯草杆菌-淀粉酶的萃取率，另外，蛋白质反萃取法的改进以及反胶束萃取的工业化模拟也成为近年来的研究热点 7。对于反胶束酶系统的研究，主要集中于反胶束中酶的定位和结构、酶催化的动力学特征、酶的催化活性及稳定性等方面。Greach 15等利用紫外光谱、核磁共振、荧光等技术对反胶束中的酶进行研究,表明酶的二级结构稍有扰动，而这种扰动与反胶束中的含水量有关。有些酶在溶解过程中二级结构变化较大 16。黄文等 17对核糖核酸酶在DAB-环己烷溶液中的活性及构象作了深入研究。 关于反胶束系统中酶的动力特征，一般认为符合Mic
20、hales方程，但酶在反胶束中Km、Kcat与反胶束的组成、酶与表面活性剂的相互作用、底物的分配与交换密切相关，是多变的复杂函数。目前，反胶束中酶催化反应的动力学模型，可归结为扩散模型 18和非扩散模型 19。 反胶束中酶的催化活性由反胶束中的含水量W0决定 20。在一定的W0下，酶表现出远高于其在水中的活性，即所谓“超活性” 9。这对于反胶束酶系统在生化反应中的应用具有较重大的意义。近年来石屹峰 21、郭红 22等也对反胶束酶在具体反应中的动力学及活性作了研究。另外，对于反胶束的一些物理化学特性如静电作用能、反胶束的微结构、反胶束中水的波谱特性等方面的研究,近年来也在不断深入 23-25。4
21、 小结大量研究表明反胶束萃取法提取分离蛋白质和酶的可行性与优越性。不管是自然细胞还是基因工程细胞中的产物都能被分离出来。不仅是蛋白质和酶能被提取，还有核酸、氨基酸和多肽也可顺利溶于反胶束。然而，反胶束萃取目前尚处于实验室研究阶段，离真正的实用还有许多有待于研究和解决的问题。如：如何克服表面活性剂对产品的污染，更多获取扩大至工业规模所需的基础数据，进行反胶束萃取过程的开发、模拟和放大的研究。尽管如此，用反胶束萃取法大规模提取蛋白质技术由于成本低、溶剂可循环使用、萃取和反萃取率都很高等优点，相信随着对反胶束技术基础理论研究的不断深入，新的反胶束体系的构建和具有分离功能的反应器的设计成功，反胶束技术
22、将在应用化学、有机合成、食品工程、生物工程等众多领域中得到广泛的应用。化工前沿讲座论文 第 5 页 共 7 页 参 考 文 献1 赵文华，周文斌 .反胶束萃取蛋白质的研究进展J.食品与机械，1998，（4）：6-7.2 严希康. 生化分离技术M.上海：华东理工大学出版社，1996.3 邓修，吴俊生 .化工分离工程.北京：科技出版社，2000.4 高孔荣，黄惠华 .食品分离技术M.广州：华南理工大学出版社，1998.5 陈复生，赵俊庭 .利用反胶束萃取技术同时分离植物蛋白和油脂J.食品科学，1997,18（8）：43-46.6 陆 强，李宽宏 .反胶束萃取胰蛋白酶的研究J.生物技术，1995,5
23、（2）：13-15.7 陆 强，李宽宏 .反胶束萃取蛋白质技术的新进展J.化工进展，1995，（1）：25-28.8 夏仕文. 反胶束的酶催化研究进展J.化学通报，1998，（2）：8-13.9 MARTINEK K , KL YACHKO N L, KABANOV A V. Micellar enzymology :it relation to membranologyJ. Biochem Biophys Acta，1989,981:161-172.10 黄泓志. 逆胶束酶系统及其在食品工业中的应用J.食品科学，1999,20（2）：12-15.11 SERRALBERIO M L M,PR
24、AZERES D M F , Dipeptide Synthesis and Separation in a reversed micellar membrance rectorJ.Enzyme Microb Technol，1994,16:1064-1073.12 EGGERS D K,BLANCH H.Enzymatic production of L-tryptophan in a reverse micellar reactor J.Bioprocess Engineering，1988，（3）：83-91.13 C CRECCHO, P RUGGRRO,M D R PIZZIGALL
25、O. Polyhenoloxidases immobilized in organic gels:properities and applications in the detoxification of aromatic compound J.Biotechnology and bioengineering,1995,48(6):385-591.14 史红勤，夏雷，沈忠耀.AOT-磷脂反胶团体系萃取蛋白质的研究J.化工学报，1990，（6）：702-708.15 GREACH A L, PRAUSNITZJ M, BLANCH H W.Wtrctural and catalytic prop
26、erties of enzymes in reverse micelleJ.Enzyme Microb Technol.1993,15:383-392.16 BROWN E D,YADA R Y,MARANGONI A G. The dependence of the lipolytic activity of Rhizopus arrhizus lipase on surfactant concentration in Aerosol-化工前沿讲座论文 第 6 页 共 7 页 OT/isooctane reversed micelles andrelation to enzyme struc
27、ture J.Biochim Biophys Acta,1993,1161:66-72.17 黄文，李晓峰，顾惕人.核糖核酸酶A在DAB-环己烷溶液中的活性及构象J.物理化学学报，1996,12（4）：353-356.18 BRU R,SANCHEZ-FERRER A,GARCIA-CARMONA F.Kinetic model in reverse micellesJ.Biochem J,1995,310(3):721-739.19 SANCHEE-FERRER A, GARCIA F.Biocatalysis in reverse self-assembling structures:Re
28、verse micelles and reverse vesicleJ.Enzyme& Microbial Technology,1994,16(5):409-415.20BRU R,SANCHEZ-FERRER A,GARCIA-CARMONA F.The effect of substrate partitioning on the kinetics of enzymes acting in reverse micellesJ.Biochem J,1990,5268(3):679-684.21 石屹峰，虞星炬，袁权.反胶束体系中酶法合成头孢力新的动力学J.化工学报，1997,48（4）：129-135.22郭红，黄文，顾惕人 .核糖核酸酶A在丁酸十二胺-环己烷反胶束溶液中的催化动力学J.化工学报，1998,19（3）：433-437.23 周世琦 ,郭祀远. 反胶束萃取蛋白质中静电相互作用能的研究J. 化学物理学报，1997,10（5）：465-473.24 刘道军, 马季铭,程虎民等. 混合反胶束的电导与微结构研究J . 高等学校化学学报，1997，（5）：800-802.25 许建和 ,周 洁,赵发祥等. 反胶束中水的波谱研究J . 华东理工大学报，1994,20（4）：248-252.
