1、264蛋白类药物生产工艺蛋白质类药物是生化药物中非常活跃的一个领域，目前的生化产品主要是从动物脏器或组织包括人的血液中分离而得。20 世纪 70 年代后，人们开始应用基因工程技术生产一些蛋白质药物，已实现工业化生产的产品如胰岛素、干扰素、白细胞介素、生长素、EPO、 tPA、TNF 等，现正从微生物和动物细胞的表达转向基因动植物发展。 第一节 主要蛋白质类药物的制备蛋白质类药物主要包括蛋白质类激素、蛋白质细胞生长调节因子、血浆蛋白质类、黏蛋白、胶原蛋白及蛋白酶抑制剂等，其作用方式包括对机体各系统和细胞生长的调节、被动免疫、替代疗法等。一、蛋白质激素类蛋白质类激素主要包括垂体蛋白质激素、促性腺激
2、素和其他蛋白质激素。其中垂体蛋白质激素包括 生长素(GH)、催乳激素(PRL)、促甲状腺素 (TSH)、促卵泡激素(FSH) 等。促性腺激素包括人绒毛膜促性腺激素(HCG)、血清促性腺激素( SGH )等。其他蛋白质激素包括胰岛素、胰抗脂肝素、尿抑胃素等。(一) 生长素(growthhormone，GH)生长素是动物脑垂体前叶外侧的特异分泌细胞分泌的一种促进生长的蛋白质激素，具有调节生长与发育的功能，对多种人类疾病有很好的疗效。人生长素（human growth hormone，hGH）由一条 191 个氨基酸的多肽构成的一链多肽的球形蛋白质，分子中含两条二硫键，分子量为 21700，等电点
3、4.9，沉降系数 S20，W 2.179，其活性不需要整个分子结构，N 端 1134 氨基酸为活性所必需，C 端的肽链起到保护作用，其化学结构与催乳素近似，故生长素有弱催乳素作用，而催乳素有弱生长素作用。生长素包含大小两个环，以亲水球蛋白的形式存在。不同种类动物的生长素，其化学265结构与免疫性质等都有较大差别。生长素的生产工艺有传统的方法和基因工程技术方法。1生长素的传统生产方法 传统方法是从脑垂体前叶分离纯化，其生产工艺见图 11-1 所示。图 11-1 提取法生产生长素的工艺路线透析内液提取硫酸铵pH5.5 离心上清夜分级沉淀硫酸铵pH7.5盐析沉淀垂体前叶透析内液溶解除盐 透析上清夜盐
4、析沉淀盐析硫酸铵pH4.0 离心除盐透析Tris-HCl 缓冲液除杂蛋白离心吸附 DE-52洗脱Sephadex G-75pH8.5透析硼砂-盐酸液pH8.7离子层析DE-52pH8.7 洗脱硼砂-盐酸缓冲液生长素 洗脱峰组分冻干（-30）除盐透析脑垂体前处理透析内液透析内液活性组分传统的工艺过程如下: 材料获取 处死动物，立即解剖，取出脑垂体，冰上速冻，-20冷冻保存。 预处理 脑垂体使用前，用蒸馏水冲洗数次，解冻，剥离前后叶。 匀浆 取动物垂体前叶，分割成小块，加水，用硫酸铵调 pH 至 5.5，置组织捣碎机中匀浆。提取 对匀浆以水抽提，10 000rpm 离心 30min；取沉淀，以 p
5、H 4.0 的 0.1molL硫酸铵溶液抽提，离心（同上） ，取沉淀，再用 pH 5.5 的 0.25molL 的硫酸铵溶液抽提，离心，取上清抽提液。沉淀 调节抽提液 pH 7.5，加饱和硫酸铵溶液至硫酸铵浓度为 lmolL，离心，取上清液。再沉淀 对上清液再加饱和硫酸铵溶液至 1.8molL，离心，得沉淀。除盐 将沉淀溶于少量蒸馏水中，对蒸馏水进行透析，得透析内液。等电点沉淀 将所得透析内液用 HCL 或 NaOH 分别依次于 pH 4.0 和 pH 4.9 进行等Comment 园园园园1: 对所有的图，在图的图题后添加（引自 xxx,200x）266电点沉淀以除去杂蛋白，离心、取上清液。
6、盐析 调上清液 pH为 4.0，加饱和硫酸铵溶液至浓度为 1.25molL 盐析，离心，得沉淀物。除盐 将沉淀物溶于少量蒸馏水中，对含 0.1molL 氯化钠的 Tris-HCL (pH 8.5) 缓冲溶液进行透析，得透析内液。凝胶过滤 透析内液上 Sephades G-75凝胶柱，用含 0.1 molL 氯化钠的50mmolL Tris-HCL (pH 8.5 )缓冲溶液进行洗脱，分步收集，活性 GH存在于第峰中。透析 将活性峰部分对 6.5mmolL 的硼砂-盐酸 (pH 8.7)缓冲溶液进行透析，得透析内液。层析 将透析内液上 DEAE-C(DE-52)柱，用含 00.3molL 氯化钠
7、的6.5mmolL 硼砂-盐酸 ( pH 8.0 ) 缓冲溶液进行梯度洗脱，合并活性峰，脱盐，冻干得GH。2人生长素的基因工程法hGH的种属特异性很强，动物生长激素不能用于人，所以开始时 hGH的惟一来源是从人尸体的脑垂体中取得，来源困难，价格昂贵，应用受到限制。目前已利用基因工程技术生产出 hGH，美国的 Genentech公司利用枯草杆菌系统表达的 hGH产量高达 1.5g/L，这也是第一代重组人生长激素，商品名称为 Protropin.生产路线如图 11-2所示。发酵培养种子培养 离心G-25色谱Phenyl色谱S-100色谱DEAE色谱生长激素图 11-2 利用基因工程菌生产生长素的工
8、艺路线（）构建高效分泌型工程菌 粗提267（1）工艺过程如下： 工程菌的构建 利用基因工程技术构建高效分泌型基因工程菌株，在生长激素的N-端增加分泌信号肽序列，使表达合成的重组人生长激素结构和天然人生长激素完全一致。 菌种繁殖 采用 M9 培养基，添加 CAA(酪蛋白氨基酸)，调节 pH 至 70，置于摇床上，30，进行菌种培养繁殖。发酵 培养基同菌种繁殖培养基，种子培养过夜，开始进行发酵，时间一般为1618h，温度为 37，pH7.07.5，溶解氧不能低于20%。补料发酵 在发酵进行57 h后，需要适量补充葡萄糖、酵母浸出物、氮源、CAA、无机盐和微量无素，如PO 43-、Fe 2- 、Co
9、 2- 等离子，通过添加补料，可使菌体生长的对数期延，发酵菌体产量增加了一倍。其余的发酵条件与上述条件相同，菌体生长至稳定期放罐。 。离心 将发酵菌体进行冻融破碎，按一定比例，加入预冷的由 10 mmol/L Tris 和1mmol/L EDTA 组成的缓冲溶液（ pH 7.5） ，80rpm 搅拌 1h，离心，收集上清液。粗提 在上清液中加入硫酸铵至饱和浓度 45%，4放置 2h，10000rpm 离心30min，收集沉淀。脱盐 沉淀用 10 mmol/L Tris 和 1mmol/LEDTA 组成的 pH 值为 8.0 的缓冲溶液溶解，用 Sephadex -G25 脱盐。纯化 采用 Ph
10、enyl-Sepharose，DEAE-Sepharose 进行色谱，再加入固体硫酸铵达到饱和浓度 45%，沉淀 2h，离心，收集沉淀，溶解沉淀，再通过 sephacryl S-11HR 及DEAE-Sepharose 进行纯化，得到人生长激素原料药半成品.。（2）质量检验：质量必须符合2005 年版二部附录规定。目前，人和动物生长素基因都已在大肠杆菌中表达成功，重组人生长激素将会得到大规模的生产，从而造福人类。 Comment 园园园园2: 这个图的一些文字不知是对那个步子说的，我建议将图中的说明在下面的268(二) 胰岛素 ( insulin )胰岛素是胰脏中胰岛 细胞分泌的一种蛋白质激素
11、，它是促进合成代谢的激素，在调节机体糖代谢、脂肪代谢、核蛋白质代谢方面都有重要作用，是维持血糖在正常水平的主要激素之一。广泛存在于人和动物的胰脏中，正常人的胰脏约含有 200万个胰岛，占胰脏总质量的 1.5。胰岛由 、 和 三种细胞组成，其中 细胞制造胰高血糖素和胰抗脂肝素， 细胞制造胰岛素， 细胞制造生长激素抑制因子。胰岛素在 细胞中开始时是以活性很弱的前体胰岛素原存在，进而分解为胰岛素进入血液循环，能使血糖降低，起到调节血糖作用。临床上主要用于治疗胰岛素依赖性糖尿病及糖尿病昏迷和酮症酸中毒、精神分裂症、休克等。胰岛素由 A、B 两条链组成，A 链含 21个氨基酸残基，B 链含 30个氨基酸
12、残基，两链之间由两个二硫键相连，在 A链内部含有一个二硫键。不同种属动物的胰岛素分子结构大致相同，主要差别在 A链二硫桥中间的第 8位、 9位和 10位上的三个氨基酸及 B链C末端的一个氨基酸上，随种属而异，但其生理功能是相同的。生产胰岛素的方法较多，有传统的方法和基因工程技术方法。1动物胰脏制胰岛素由动物胰脏生产胰岛素的方法较多，目前被普遍采用的是酸醇法和锌沉淀法。现以酸醇法为例，介绍胰岛素的生产工艺。其工艺路线如图 11-3所示。269碱化液酸化液酸醇提取液胰片冻胰酸化硫酸 pH3.63.8刨碎37，2h提取 乙醇，草酸pH2.53,122碱化氨水pH8.08.4盐析物 溶液 浓缩液减压浓
13、缩30以下去脂速热速冷盐析氯化钠pH2.02.5精制品除酸性蛋白水，丙酮，氨水 pH4.24.3锌沉淀氨水，醋酸锌pH6.0结晶沉淀滤液除碱性蛋白，结晶柠檬酸，醋酸锌，丙酮，氨水pH8.0,5以下过滤后调 pH6.0洗涤，干燥水，丙酮，乙醚图 11-3 酸醇法生产胰岛素的工艺路线（1）工艺过程如下： 提取 冻胰块用刨胰机刨碎，加入 2.32.6 倍的 8688乙醇(质量分数)和 5草酸，在 122搅拌提取 3h，离心。滤渣再用 1 倍量 6870乙醇和 0.4草酸提取2h，离心，合并乙醇提取液。沉淀用于回收胰岛素。 碱化、酸化 边搅拌提取液边加入浓氨水调 pH 8.08.4 (122)，立即过
14、滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至 pH 3.63.8，降温至 5，静置 4h 以上，使酸性蛋白充分沉淀。 减压浓缩 吸取上清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，取上清液，30以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液相对密度为 1.041.06 (约为原体积的11019 为止)。 去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅内，5min 内加热至 50后，立即用冰盐水降温至5，静置 34h，分离下层清液 (脂层用于回收胰岛素 )。用盐酸调 pH 2.32.5，于222搅拌加入 27(质量体积分数)固体氯化钠，保温静置数小时。析出物即为胰岛素粗品。 精制 盐析物按干重计算，加入 7 倍量蒸馏水溶解
15、，再加入 3 倍量的冷丙酮，用4molL 氨水调 pH 4.24.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为 73。充分搅270拌后，低温 5以下放置过夜，次日在低温下离心分离，取上清夜，在上清夜中加入4molL 氨水使 pH 6.26.4，加入 3.6(体积分数)的醋酸锌溶液( 浓度为 20)，再用4molL 氨水调节 pH 6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。 结晶 将沉淀用冷丙酮洗涤，得干品，再按干品质量每克加冷 2柠檬酸50mL、6.5醋酸锌溶液 2mL、丙酮 16mL，并用冰水稀释至 100mL，使其充分溶解，5以下，用 4molL 氨水调 pH 8.0，迅速过滤。滤液立即用
16、10柠檬酸溶液调 pH 6.0，补加丙酮，使整个溶液体系保持丙酮含量为 16。慢速搅拌 35h 使结晶析出。在显微镜下观察，外形为正方形或扁斜形六面体结晶，再转入 5左右低温室放置 34d，使结晶完全。离心收集结晶，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素。（2）质量检验 测定胰岛素效价，各国药典规定有家兔血糖降低法和小鼠血糖降低法。（3）在整个生产过程中，为提高胰岛素的质量和产量，应注意以下几个方面： 胰脏质量是胰岛素生产中的关键，在我国是一个薄弱环节。工业生产用的原料主要是猪、牛的胰脏。不同种类和年
17、龄的动物，其胰脏中胰岛素量有所差别，牛胰含量一般高于猪胰。采摘胰脏要注意保持腺体组织的完整，避免摘断，并且离体后要立即深冻，先在-30 以下急冻后转入-20保存备用，如用液氮速冻，效果更好。在胰脏中，胰尾部分胰岛素含量较高，如单独使用可提高收率 10。 浓缩 浓缩工序的条件，对胰岛素收率影响很大。如采用离心薄膜蒸发器，在第一次浓缩后，浓缩液用有机溶剂去脂，再进行第二次浓缩，被浓缩溶液受热时间极短，避免了胰岛素效价的损失。 产品纯度 在常规的结晶胰岛素中，除了胰岛素主成分外，还含有其他一些杂蛋白抗原成份，如胰岛素原、精氨酸胰岛素、胰多肽等。因此要对结晶胰岛素进一步纯化，胰岛素原的含量显著降低。2
18、712人胰岛素的制备（1）酶促半合成法猪与人的胰岛素差别仅是 B30位上的一个氨基酸，猪的是丙氨酸，人的则是苏氨酸。利用胰蛋白酶的转酰胺作用，将猪胰岛素转化为人胰岛素 B30苏氨酸(丁酰基)丁酸，通过硅胶柱层析，然后用三氟乙酸处理，断裂保护基团，再用离子交换层析纯化，得到高纯度人胰岛素。（2）利用基因工程技术制备目前，国际上生产医用重组人胰岛素( recombinant human insulin, rhI)的方法主要有 3种:1)用基因工程大肠杆菌( Escherichia coli, E.coli)分别发酵生产人胰岛素( human insulin, hI)的 A、B 链。然后经化学再氧化
19、法,使两条链在一定条件下重新形成二硫键,得到 hI。这一方法缺点较多,目前已较少使用。2)用基因工程 E. coli 发酵生产人胰岛素原( human proinsulin, hP I) ,后经加工形成 h I。这种方法，E. coli 系统表达量高,但缺点是不利于表达 hI 这样的小蛋白,产物易降解,故常采用融和蛋白形式将 hPI 连接在一个较大的蛋白质后 ,表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的 hI。3)通过基因工程酵母菌发酵生产 hP I,经后加工形成 hI。酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单,但缺点是生产慢,生产周期长,且重组蛋白分泌量少(150 mg/L) ,产量低。工
20、艺生产过程见图 11-4。 菌种RRhP I/pQE-40 E.coli M15 菌株 培养基培养基组成为：5g/L 胰蛋白胨 ,2g/L 谷氨酸,7g/L 酵母浸膏,0.5 g/L 硫酸铵, 2.5 g/L 葡萄272糖, 2.7 g/L 甘油,100mg/L 氨苄青霉素, 50mg/L 卡那霉素, pH 7.2。 一次发酵将 10 ml 经过活化的 RRhP I/ pQE-40 E.coliM15 转移至 100 ml 培养基中进行培养, 活化菌种。 发酵罐培养将一次发酵液转移至含有 1.5 L 培养基的发酵罐中进行发酵罐培养(转速为 300 r/min,通气量为 11. 511.8) ,
21、一段时间后加入一定量新鲜的培养基并用 NaOH 调节 pH。在对数生长中期加入 0.5mmol /L IPTG 并升温诱导 RRhPI 表达 4 h,转速随即调为 400500 r /min,增大通气量至 11.812.0,继续培养一段时间后,收集菌体。 包涵体的收集和洗涤将收集的湿菌体冻存于-20,然后悬浮于缓冲液 A(50 mmol/L Tris-HCl, 0. 5 mmol/L EDTA,50 mmol/L NaCl, 5%甘油, 0.10.5 mmol/LDTT,pH7.9) ( 56 ml/g 湿菌)中,加入溶菌酶( 5 mg/g 湿菌体 ) ,室温或 37振荡 2 h。冰浴超声 1
22、0 s30 次,其间每次间隔 20 s,功率为200W。10 条件下 1000 g 离心 5 min 去除细胞碎片。上清液中的包涵体( Inclusion body, IB)在 4 条件下 27000 g 离心 15 min 收集,然后用含 2 mol/L 尿素的缓冲液 A 充分悬浮,室温静置 30 min 后 4 条件下 17000 g 离心 15 min,收集沉淀。沉淀再用含 2%脱氧胆酸钠的缓冲液 A 充分悬浮, 4 条件下 17000 g 离心 15min,收集沉淀。最后沉淀用 10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.3 洗涤两次(4,17000 g 离心 15 min ) 。
23、 RRhPI 的初步纯化将收集的 IB 用含有 0.1%0.3%-巯基乙醇的缓冲液 B( 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L尿素, pH 8.0)溶解,上于已用缓冲液 B 平衡的 DEAE-Sepharose FF 柱,用合适的氯化钠梯度洗脱,收集含 RRhPI 的洗脱液。 RRhPI 的重组复性273将初步纯化后的 RRhPI 通过 Sephadex G-25 脱尿素,转换缓冲液为不同 pH 的 50 mmol/L Gly-NaOH 重组液,或含有适量 GSSG 的 Gly-NaOH 缓冲液中,使蛋白终浓度为0.10.6 mg/ml,收集趋于正确折叠的 RRhPI 单体组
24、分,加入适量 GSH 和 GSSG,4放置 24 h。 酶切转化向 RRhPI 复性液中加入一定量的胰蛋白酶和羧肽酶, 37酶切一段时间,然后用 0.1 mol/L ZnCl2 终止反应并沉淀生成的 hI。 hI 的纯化将 0.6g IB 分别用含 0.1%, 0.2%, 0.3%-巯基乙醇的 30 mmol/L Tris-HCl, 8 mol/L 尿素, pH8.0 溶解,进行 DEAE-Sepharose FF 离子交换层析,然后将收集得到的 RRhPI 组分通过Sephadex G-25 脱尿素以使 RRhPI 复性。二、离心酶切解离A、 B 链离子交换发酵 细胞破碎离心构建工程菌胰岛素
25、粗品 胰岛素原纯化的人胰岛素 离子交换、分子筛色谱、反相色谱、结晶图 11-4 利用基因工程菌生产人胰岛素的工艺路线（仿自李晓红，2007）取上清夜胰岛素复性收集菌体 收集沉淀蛋白质类细胞生长调节因子蛋白质类细胞生长调节因子包括干扰素（IF）、， 、白细胞介素 1-18 (IL)，神经生长因子（NGF ） 、肝细胞生长因子(HGF)，血小板衍生的生长因子(PDGF)，肿瘤坏死因子(TNF) ，集落刺激因子(CSF)，组织纤溶酶原激活因子 (t-PA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白(BMP) 等。(一) 干扰素（ Interferon ,IFN）干扰素指由干扰素诱生剂诱导有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能的诱生蛋白质。这类诱生蛋白质从细胞中产生和释放之后，作用于相应的其它同种生物细胞，并使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的“免疫力” ，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性
