1、酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。 （一） 菌源 1 土样 用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下 110cm 土壤 10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能 立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2 面肥
2、 （ 1）面粉 500 克，白酒 100 克，水 250，和好静置发酵就可以了。冬季 10 个小时。 （ 2） 在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处， 6 小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3 水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二） 酵母菌的分离 1 制备菌悬液 称取菌源 1g，加入盛有 99ml 无菌水 或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成 10-2 的菌源悬液。再一次稀释成 10-4、 10-5、 10
3、-6 三个稀释度。 2 涂布法分离 取 融化 并 冷却至 4550 度左右的 豆芽汁 葡萄糖培养基，每皿分别倾注约 12ml 培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于 45 度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液 10-4、 10-5、 10-6 三个稀释度菌悬液各 0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做 23 个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将
4、培养 基 划破。 3 培养 接种后，平版倒置于 30 度恒温箱中，培养 23 天，观察结果。 4 纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一 )麦芽汁培养基的配制 1培养基成分 新鲜麦芽汁一般为 10-15 波林。 2配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净 ，用水浸泡 6-12h，置于 15阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在 65水浴锅中保温 3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全 (检查方法是取 0.5m
5、l 的糖化液，加 2 滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全 )。 (3) 糖化液用 4-6 层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清 (用一个鸡蛋清，加水 20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤 )。 (4)用 波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到 10-15 波林，调pH 至 6 4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到 10-15 波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入 2琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌 100 Pa 灭菌 20 min。 （二 )马铃薯葡萄糖培养基的配制 1、培养基成
6、分 马铃薯 20g 葡萄糖 2 g 琼脂 1.5-2g 水 100ml 自然 pH 2配制方法 (1)配制 20马铃 薯浸汁 取去皮马铃薯 200g，切成小块，加水 1000m1。 80浸泡 lh，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。 100 Pa 灭菌 20 min。即成 20马铃薯浸汁，贮存备用。 （ 2)配制时，按每 100 m1 马铃薯浸汁加入 2g 葡萄糖，加热煮沸后加入 2g 琼脂，继续加热融化并补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌 100 Pa 灭菌 20 min。 (三 )豆芽汁葡萄糟培养基的配制 1培养基成分 黄豆芽 10g 葡萄糖 5g 琼脂 1.5-2
7、g 水 100ml 自然 pH 2配 制方法 (1)称新鲜黄豆芽 10g，置于烧杯中，再加入 100 m1 水，小火煮沸 30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成 10豆芽汁。 （ 2)配制时，按每 100 m1 10豆芽汁加入 5g 葡萄糖，煮沸后加入 2 g 琼脂，继续加热融化，补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌 100 Pa 灭菌 20 min。 (四 )察氏 (czapck)培养基的配制 1培养基成分 蔗糖 3g NaN03 0.3g K2HP04 0.1g KCl 0.05g MgSO4 7H2O 0.05 g FeS04 0.001 g 琼脂 1.5-2g
8、蒸馏水 100ml 自然 pH 2配制方法 (1)称量及溶化 量取所需水量约 2 3 左右加入到烧杯中，分别称取蔗糖、NaNO3 、 K2HP04 、 KCl、 MgSO4。依次逐一加入水中溶解。按每 100 ml 培养基加入 1ml 0.1的 FeS04 溶液。 （ 2）定容 候药品全部溶解后，将溶液倒入量 筒中，加水至所需体积。 （ 3）加琼脂 加入所需量琼脂，加热融化，补足失水。 (4)分装、加塞、包扎。 (5)高压蒸汽灭菌 100 Pa 灭菌 20 min。 YPD 培养基 YPD 或 YPED，： Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)，又
9、叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（ YPD）琼脂培养基 用于酵母菌的培养 配方： 1% Yeast Extract（酵母膏） ， 2% Peptone（蛋白胨） ， 2% Dextrose (glucose)（葡萄糖），若制固体培养基，加入 2%琼脂粉 配制方法： 1 溶解 10gYeast Extract（酵母膏） , 20gPeptone（蛋白胨）于 900ml 水中，如制平板加入 20g 琼脂粉 2 高压 121 度 20min 3 加入 100ml 10 Dextrose (glucose)（葡萄糖）， (葡糖糖溶液灭菌后加入 ) 注：葡萄糖， yeast ex
10、tract ,peptone 溶液混合后在高温下可能会发生化学反应，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。 YPEG： 除了用 3%乙醇和 3%甘油代替葡萄糖作为碳源外，其他成分同 YPD 二、接种操作 【器具】：酒精灯、酒精棉、剪刀、接种针、镊子、定量移液器或吸管等。 【仪器】：超净工作台等。 【方法】 无菌室使用前，使用紫外线灯照射 2030 分钟进行杀菌；进入无菌室换无菌工作服；所有操作采用无菌操作。 活化 操作前将冷冻管菌种置于室温下，使之内部培养基达到室温后，振荡均匀；无菌操作，将冷冻管内的培养液全部转入盛有 5mL 培养基的试管中，于 25 1培养 72 2 小时。 将试管中
11、的培养液轻轻振荡均匀，用接种环接取三环加 入另一支盛有 5mL 培养基的试管中，于 25 1培养 2436 小时。 将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀，用无菌吸管接 0.1mL 加入盛有 10mL培养基的试管，振荡均匀后于 25 1培养 2436 小时。 扩大 将培养结束的试管培养液轻轻振荡均匀后，全部接入小巴氏瓶（三角瓶），每个小巴氏瓶（三角瓶）接入一支试管的培养液；然后于 23 1培养 2436 小时。 将培养结束的小巴氏瓶（三角瓶）轻轻振荡均匀后，全部接入大巴氏瓶（大三角瓶），每个大巴氏瓶（大三角瓶）接入一只小巴氏瓶（三角瓶）的培养液；然后于 21 1培养 2436 小时。 将培养结束的大巴氏瓶（大三角瓶）轻轻振荡均匀后，全部接入卡氏罐，每个卡氏罐接入两只大巴氏瓶（大三角瓶）的培养液；然后于 18 1培养 2436 小时。 注：除卡氏罐外，其它液体培养基在接种后每 12 小时应振摇一次，以去除二氧化碳，保证酵母耗氧需求。 三、菌种保藏 固体斜面 保藏：酵母菌种以固体斜面形式 04冷藏保藏，定期活化； 活化：每三个月活化一次。接一环斜面菌种于 5mL 麦汁液体培养基中，于 25 1培养 2436 小时；待酵母起发后，将培养液振荡均匀，用接种环涂划 固体斜面，于 25 1培养 6072 小时；然后于 04冷藏保藏。 固体斜面菌种每年更换一次。
