1、 寡核苷酸近末端位点的酶切 (Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) 为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求， NEB 采用了一系列含识别序列的短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时），或者当切割位点靠近DNA 末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常需在识别位点两端至少加上 6 个保护碱基，以确保酶切反应的进行。 实验方法：用 -32PATP 在 T4 多聚核苷酸激酶的作用下标记 0.1A260单位的寡核苷酸。取 1 g 已标
2、记了的寡核苷酸与 20 单位的内切酶，在 20C 条件下分别反应 2 小时和 20 小时。反应缓冲液含 70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl2 , 5 mM DTT 及适量的 NaCl 或 KCl（视酶的具体要求而定）。 20%的 PAGE（ 7 M 尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。 本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发夹结构而降低。 DNA 合成，新链的延伸方向是 5 3 因此，需要在 5 端加上酶切位点 ,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个 platform
3、 让它可以结合上去，否则会掉下来 . 引物的结构就是（ 5 3）：保护碱基 +酶切位点 +原来的引物序列 首先要看 目的基因中是否含有该酶切位点，只有没有的才可以选 (小虾米酶切位点分析 )。其次，如果需要做表达，需要考虑起始密码子，防止移码突变 酶 寡核苷酸序列 链长 切割率 % 2 hr 20 hr Acc I GGTCGACC CGGTCGACCG CCGGTCGACCGG 8 10 12 0 0 0 0 0 0 Afl III CACATGTG CCACATGTGG CCCACATGTGGG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 Asc I GGCGCGCC AGGCGCGC
4、CT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 Ava I CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 8 10 12 50 90 90 90 90 90 BamH I CGGATCCG CGGGATCCCG CGCGGATCCGCG 8 10 12 10 90 90 25 90 90 Bgl II CAGATCTG GAAGATCTTC GGAAGATCTTCC 8 10 12 0 75 25 0 90 90 BssH II GGCGCGCC AGGCGCGCCT TTGGCGCGCCAA 8 10 12 0 0 50 0 0 90
5、BstE II GGGT(A/T)ACCC 9 0 10 BstX I AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 22 24 27 0 25 25 0 50 90 Cla I CATCGATG GATCGATC CCATCGATGG CCCATCGATGGG 8 8 10 12 0 0 90 50 0 0 90 50 EcoR I GGAATTCC CGGAATTCCG CCGGAATTCCGG 8 10 12 90 90 90 90 90 90 Hae III GGGGCCCC AGC
6、GGCCGCT TTGCGGCCGCAA 8 10 12 90 90 90 90 90 90 Hind III CAAGCTTG CCAAGCTTGG CCCAAGCTTGGG 8 10 12 0 0 10 0 0 75 Kpn I GGGTACCC GGGGTACCCC CGGGGTACCCCG 8 10 12 0 90 90 0 90 90 Mlu I GACGCGTC CGACGCGTCG 8 10 0 25 0 50 Nco I CCCATGGG CATGCCATGGCATG 8 14 0 50 0 75 Nde I CCATATGG CCCATATGGG CGCCATATGGCG G
7、GGTTTCATATGAAACCC GGAATTCCATATGGAATTCC GGGAATTCCATATGGAATTCCC 8 10 12 18 20 22 0 0 0 0 75 75 0 0 0 0 90 90 Nhe I GGCTAGCC CGGCTAGCCG CTAGCTAGCTAG 8 10 12 0 10 10 0 25 50 Not I TTGCGGCCGCAA ATTTGCGGCCGCTTTA AAATATGCGGCCGCTATAAA ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA 12 16 20 24 28 0 10
8、 10 25 25 0 10 10 90 90 Nsi I TGCATGCATGCA CCAATGCATTGGTTCTGCAGTT 12 22 10 90 90 90 Pac I TTAATTAA GTTAATTAAC CCTTAATTAAGG 8 10 12 0 0 0 0 25 90 Pme I GTTTAAAC GGTTTAAACC GGGTTTAAACCC AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG 8 10 12 24 0 0 0 75 0 25 50 90 Pst I GCTGCAGC TGCACTGCAGTGCA AACTGCAGAACCAATGCATTGG AAAACTG
9、CAGCCAATGCATTGGAA CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT 8 14 22 24 26 0 10 90 90 0 0 10 90 90 0 Pvu I CCGATCGG ATCGATCGAT TCGCGATCGCGA 8 10 12 0 10 0 0 25 10 Sac I CGAGCTCG 8 10 10 Sac II GCCGCGGC TCCCCGCGGGGA 8 12 0 50 0 90 Sal I GTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG ACGCGTCGACGTCGGCCATA
10、GCGGCCGCGGAA 28 30 32 0 10 10 0 50 75 Sca I GAGTACTC AAAAGTACTTTT 8 12 10 75 25 75 Sma I CCCGGG CCCCGGGG CCCCCGGGGG TCCCCCGGGGGA 6 8 10 12 0 0 10 90 10 10 50 90 Spe I GACTAGTC GGACTAGTCC CGGACTAGTCCG CTAGACTAGTCTAG 8 10 12 14 10 10 0 0 90 90 50 50 Sph I GGCATGCC CATGCATGCATG ACATGCATGCATGT 8 12 14 0
11、 0 10 0 25 50 Stu I AAGGCCTT GAAGGCCTTC AAAAGGCCTTTT 8 10 12 90 90 90 90 90 90 Xba I CTCTAGAG GCTCTAGAGC TGCTCTAGAGCA CTAGTCTAGACTAG 8 10 12 14 0 90 75 75 0 90 90 90 Xho I CCTCGAGG CCCTCGAGGG CCGCTCGAGCGG 8 10 12 0 10 10 0 25 75 Xma I CCCCGGGG CCCCCGGGGG CCCCCCGGGGGG TCCCCCCGGGGGGA 8 10 12 14 0 25 50 90 0 75 90 90 DNA 合成，新链的延伸方向是 5 3 因此，需要在 5 端加上酶切位点 ,因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个 platform 让它可以结合上去，否则会掉下来 . 引物的结构就是（ 5 3）：保护碱基 +酶切位点 +原来的引物序列
