1、蛋白酶产生菌的筛选及活力的测定 作者 刘艳芝 指导教师 张玲秀 （忻州师范学院生物系 1201班 034000） 摘要 ： 采用忻州师范学院校园附近土壤、农田土壤及体育场土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度 15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度 20g/L 的尿素，最适初始 pH 值为 6.5，最适发酵温度为 35 。 关键词 ：菌种筛选；鉴定；蛋 白酶；条件优化 蛋白酶 蛋 白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产
2、销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的 60，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。目前，蛋白酶的研究仍注重于新品种的发掘，并通过分离筛选、发酵条件优化和诱变育种或构建基因工程菌等综合手段获得高产蛋白酶的优良菌株。我国的蛋白酶研究还存在如微生物资源开发不足，蛋白酶种类较少，酶制剂品种单一 等问题。 本论文从以下几方面对蛋白酶产生菌株进行较为系统的研究：从土壤中筛选出产蛋白酶能力较高菌株。对筛选出的菌株进行形态学的鉴定，将菌株初步确定到属。研究产蛋白酶菌株发酵产酶条件，对培养基成分和发酵条件进行优化，确定最佳培养基配方
3、和发酵条件，进一步提高菌株的 产酶活力。 一、 材料及方法： 1.1 实验材料与仪器 实验仪器： 高压灭菌锅，恒温培养箱，超净工作台，电子分析天平， pH测量仪，水浴锅，微波炉，紫外光可见分光光度计，摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏 斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。 1.2 实验材料 ： 样品：取自忻州师范学院附近的土壤。 试剂：无菌水（带玻璃珠）、 100ug/ml 酪氨酸溶液、 PH8.0 硼酸缓冲液、0.4mol/L三氯乙酸、牛肉膏蛋白胨培养基、酪蛋白培养基、产蛋白酶发酵培养基 二、操作步骤 （一） 配制所需培养基 按照以下配方配制所需的培养
4、基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g， NaCl 0.5g，琼脂 1.5 2.0g，水 100ml， pH 7.2，配制 200mL 酪蛋白培养基：牛肉膏 0.3g，酪素 1g， NaCl 0.5g，琼脂 2g ，定容于 100ml 产蛋白酶发酵培养基：玉米粉 6g，豆粉 4g，磷酸二氢钾 0.03g，碳酸钠 0.1g，磷酸氢二钠 0.4g，定容于 100ml （二） 分离 1.洗涤培养皿、试管等实验器具，与 121高压灭菌 20min 2.采集土壤样品，用无菌水植被 1:10土壤悬液。 3.取 1:10土壤悬液 5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入 75恒温水浴中热
5、处理 10min，以杀死非芽孢细菌及其他微生物。 4.取加 热处理过的土壤悬液 100 200 L，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于 30 32下培养 24 48h. （三） 筛选 1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，接种于酪蛋白培养基， 3032下倒置培养 24 48h。 2、选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌，接入产蛋白酶发酵培养基 30-32振荡培养 48小时，将发酵液过滤或离心，取清夜检测蛋白酶活力进行复筛。 （四）蛋白酶活力的测定 1. 原理：蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯 键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物
6、作为底物来测定蛋白酶的活力。本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。在 275nm 波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。 2. 绘制标准曲线 取 7支试管，按下表加入试剂： 将各管溶液混匀， 40预热 2min，用滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定 275nm的吸光值，用 Excel软件求回归方程，并计算出 1ug/ml酪 氨酸的吸光值。 3.
7、实验步骤 （ 1）取 5ml 用 PH8.0 硼酸缓冲液制备的 0.6%酪蛋白溶液于试管中， 40保温20min后加入 1： 20以 PH8.0硼酸缓冲液稀释的酶液 1ml， 40反应 10min后，加入 5ml0.4mol/ml 三氯乙酸以终止反应，并沉淀残余底物， 40保温 20min 使沉淀完全，用漏斗加滤纸过滤，滤液用紫外分光光度计测定 275nm的吸光值。 （ 2）空白组先加三氯乙酸使酶失活，后加酪蛋白，按上述同样步骤测定吸光值。 4.计算酶活力 以 1min内有酪蛋白释放的三氯乙酸可溶物在 275nm的吸光值于 1ug 酪氨酸相当时，其所需要的酶量为 1个单位。 项目 0 1 2
8、3 4 5 6 100ug/ml酪氨酸溶液（ ml） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 酪氨酸浓度（ ug/ml） 0 10 20 30 40 50 60 PH8.0 硼酸缓冲液 6.0 5.9 5.8 5.7 5.6 5.5 5.4 0.4mol/l 三氯乙酸（ ml） 5 5 5 5 5 5 5 酶活（ U/ml） =nA10 A-A201 nA10 A-A 201 式中， 10 反应时间 10min A1 酶反应可溶物的吸光值， A0 空白对照可溶物的吸光值， A2 1ug/ml酪氨酸的吸光值 实验结果及数据分析： 实验所测标准曲线数据如下： 试管号 0 1 2 3 4 5 6 酪氨酸的浓度（ ug/ml） 0 10 20 30 40 50 60 A275 下的吸光值 0 0.021 0.028 0.036 0.046 0.057 0.073 标准曲线绘制如下： 由图中可知，线性关系为 y=0.0011x+0.0042 在实验过程中，测得的 A1=0.005， A0=0 由以上数据知，酶活（ U/ml） =0.9 实验结果：失败 原因：液体培养基在灭菌时，因喷溅而使液体培养基凝固，接入产蛋白酶菌后 ，培养基因凝固而使菌生长分布不均匀，甚至不生长，所以测蛋白酶活力时，菌太少使测得数据太小。
