1、高效液相色谱的日常使用和维护 高新科技与现代产业的迅猛发展，促进了以高效液相色谱（ HPLC）为代表的复杂样品的分离分析和分离纯化仪器的飞速发展。 HPLC 以它 定量分析结果准确 、分析 周期 短、分析范围广、分析检测限低等优势 ，在食品添加剂、药物成分分析等多领域得到了广泛的应用。 高效液相色谱仪 是一种高端检测仪器 ， 它 精密快速，有效准确检测的同时就要求我们一定要严格 正确 使用仪器，定期科学有效地维护仪器，只有这样仪器才能长久持续有效使用。 但是从目前实际使用情况看，与高效液相色谱仪的应用及产品技术升级的发展速度相比，其使用 和维护则相对比较滞后，从而造成对仪器的滥用和对耗材不必要
2、的浪费。主要原因是由于对于仪器使用操作者的培训侧重于仪器的初步使用，忽略了仪器的后续培训及维护操作学习；其实很多 高效液相色谱 都是国外进口仪器，英文版本软件对于大多数理工科毕业的仪器操作者也是一个障碍。笔者根据自己的工作经验， 以岛津 LC-20AT 液相色谱仪为例， 阐述液相色谱仪在使用时应注意的几个问题 及 日常使用后的仪器维护基本事项 ，并对仪器使用过程中容易遇到的问题进行分析，提出解决方法。 1、高效液相色谱仪的组成 高效液相色谱仪主要是由输液系统、进样器、色 谱柱、检测器和色谱软件数据处理系统组成。 1.1 输液系统 输液 系统主要包括溶液贮器、在线脱 气 装置、 高压输液泵、梯度
3、洗脱装置。 溶液贮器 用于存放符合 HPLC 要求的流动相。在线脱气装置主要功能是流动相在进入柱子前排除气泡。 高效液相色谱柱的填料颗粒较小，通过 2 5mm 的色谱柱受到的流动阻力很大，因此需要 通过 高压输液泵抽取流动相输送至色谱柱。 高压泵按输液性能可分为恒压泵和恒流泵两种。按机械结构又可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和 往复柱塞泵四种，前两种为恒压泵，后两种为恒流泵。恒压泵可以输出稳定不变的压力。 在一般的分析仪器中，由于系统阻力不变，恒压亦可达到恒流的效果。但是当系统阻力发生变化时，输入压力即使不变，流量却可随阻力而变化。恒流泵则无论系统阻力如何变化都可保证其流量基本不变。在
4、色谱实际操作中， 系统阻力可能随着运行时间的增加产生微小的改变，因此恒流泵比恒压泵更优越。然而在泵和柱系统所允许的最大压力下操作时，恒压泵较为安全方便。 梯度洗脱装置是采用两种及以上 不谈性质的溶剂，在分离过程中按照一定的程序设定改变流动相组成的一种洗脱模式。通过流动相极性的变化来调整被分离样品的选择因子和保留时间，可以使柱系统具有 最佳的选择性和最大的峰容量。梯度洗脱能够提高分析成分之间的分离度，缩短分析周期，降低最小检测限，提高分析精度 。对于复杂混合物，特别是保留值相差较大的样品的分离，梯度洗脱是一种极为有效的分析方法。 1.2 进样器 进样系统是将分析样品送入色谱柱的装置 ，分为手动、
5、自动进样器两种。 手动进样器配有 20 100 L 的定量环。 1.3 色谱柱 色谱柱 以液体为流动相，以广义的固相为固定相来进行分析样品的分离工作，它是高效液相色谱仪的心脏，柱效能高、选择性好是对色谱柱的基本要求。 色谱柱按照分离模式大致可以分为：正相色谱柱和反相 色谱柱。 正相 色谱柱通常以 硅胶 (Silica)、 胺基团 (NH2,APS)和氰基团 (CN,CPS)等 极性官能团的 )非极性化合物 的分离，样品一般能溶于有机溶剂。 反相色谱柱通常 以硅胶为基础 ,表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相 为填料 ；使用极性较强的流动相 ， 通常为水缓冲液与甲醇 、 已腈等混合物 ； 适用
6、于大多数有机化合物，生物大 、 小分子，样品一般能溶于水。以 C8、 C18 反相色谱柱为代表。 1.4 检测器 检测器 、泵与色谱柱是组成 HPLC 的三大关键部件。检测器是将色谱柱分离出的样品的物理或者化学特性 转换为可以测量的电信号，通过色谱图记录下来，由 色谱图中的峰形状判断分离效果， 依据 标物物质 、 分析样品的色谱图 中的出峰时间、峰面积分别对样品进行定性、定量分析。 常用的检测器主要有 紫外吸收检测器（ UVD）、示差折光检测器（ RID）、 荧光检测器（ FD）。 2、高效液相色谱仪的 日常维护 2.1 高效液相色谱仪器的 开机 、关机 注意事项 。 一切分析准备工作做好后
7、，依次按顺序打开稳压电源、高压输液泵、柱温箱、检测器，待以上各部件自检结束后，打开连接仪器的电脑，启动工作软件。 仪器分析工作 结束后，关闭工作软件，再依次按顺序关闭 检测器、柱温箱、高压输液泵。 2.2 对流动相的要求 液相 色谱所用的流动相一般为 低沸点有机溶剂与水或者缓冲溶液的混合物 。 为保证液相色谱仪器的 正常使用，所有流动相必须是色谱级的，且经过过滤杂质、排除气泡后 装入干净的流动相贮存瓶中 待用 。 2.2.1 流动相的物理性能要求 对分析物要有足够的溶解能力，以利于提高检验的灵敏度；流动相的黏度要小，以保证合适的柱降压；流动相的沸点要低，以利于制备分离时样品的回收； 2.2.2
8、 流动相的温度 一般以硅胶为基质的色谱柱最高使用温度不超过 60，以低于 40为宜。温度过高会加速键合 相水解和硅胶的溶解，从而使填料性质改变，柱塌陷，降低柱效。最低 使用 温度 不超过 0。 2.2.3 流动相的过滤 所有流动相在使用前都必须经过 0.45 m（或 0.22 m）的有机相 /脂溶性和水相（水溶性）滤膜过滤，以除去杂质微粒。 2.2.4 流动相的脱气 液相色谱所用到的流动相必须预先脱气，否则容易在系统内 产生气泡，影响泵的工作 ， 影响基线的稳定性。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相反应。溶解氧能与某些有机溶剂（如甲醛、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，提高背景吸收，
9、会在梯度洗脱时造成基线漂移或形成鬼峰 。 常有的脱气方法有以下四种： （ 1） 在线真空脱气法 把真空脱气装置串联到储液系统中，并结合膜过滤器，使流动相在进入输液泵前脱气 ，此法效果较好，尤其适用于多元溶剂体系。 （ 2） 超声波脱气法 此法是实验室较常用的一种方法，将配置好的流动相连同容器一起放入超声波水浴中超声 15 至 30 分钟。 （ 3） 抽真空脱气法 使用微型真空泵，降压至 0.05 0.07MPa 即可出去溶解的气体。 由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故对于多元溶剂体系应该先预先 脱气后再进行混合，以保证混合后的组分不变。 2.3 泵的维护 含有缓冲 盐的流动相不能保留在泵内，尤其是停泵过夜或更长时间。 分析结束后 一定要先用纯水冲洗泵，然后再换合适溶剂冲洗（一般反相键合固定相，可以是甲醇或者甲醇和水溶液）。
