1、 ICS： 65.020.30 备案号： 四 川 省 地 方 标 准 DB51/T 676 2007 牛奶中氯霉素残留检测方法 高效液相色谱 -串联质谱 （ LC-MS-MS）法 Determination of chloramphenicol residues in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2007-03-17 发布 2007-05-01 实施 四川省质量技术监督局 发布 DB DB51/T 676 2007 I 目 次 前 言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文
2、件 . 1 3 制样 . 1 3.1 样品的制备 . 1 3.2 样品的保存 . 1 4 测定方法 . 1 4.1 方法提要或原理 . 1 4.2 试剂和材料 . 1 4.3 仪器和设备 . 2 4.4 测定步骤 . 2 4.5 结果计算和表述 . 3 5 检 测方法灵敏度、准确度、精密度 . 4 5.1 灵敏度 . 4 5.2 准确度 . 4 5.3 精密度 . 4 附 录 A （资料性附录） 氯霉素特征离子质量色谱图、特征离子质谱图 . 5 DB51/T 676 2007 II 前 言 本标准按 GB/T1.1 2000 标准的结构和编写规则进行编制 本标准附录是资料性附录 本标准由 四川
3、省畜牧食品局提出 并归口 本标准由 四川省质量技术监督局批准 本标准起草单位： 四川省兽药残留监控中心、四川省兽药监察所 本标准主要起草人： 彭莉、岳秀英、 高岚、熊浩山 、官艳丽、王海波、吴晓岚 DB51/T 676 2007 1 牛奶中氯霉素残留检测方法 高效液相色谱 -串联质谱（ LC-MS-MS）法 1 范围 本标准规定了牛奶中氯霉素残留量检测的制样和高效液相色谱 -串联质谱（ LC-MS-MS）测定方法。 本标准适用于牛奶中氯霉素的残留量测定。检出限为 0.05g/L。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（
4、不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期 的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 1.1-2000 标准化工作导则 第 1部分：标准的结构和编写规则 (ISO/IEC Directives, Part 3, 1997, Rules for the structure and drafting of International Standards, NEQ) GB/T 6682-1992 分析实验室用水规则和试验方法 农牧发 20031号 兽药残留试验技术规范（试行） 3 制样 3.1 样品的制备 取适量
5、新鲜的空白或供试牛奶，涡旋混合使之均匀、密封 。 3.2 样品的保存 -20以下 冰箱中贮存备用。 4 测定方法 4.1 方法提要或原理 牛奶中的氯霉素用乙酸乙酯提取，正己烷脱脂， C18固相萃取柱净化， 氮气吹干。 用 高效液相色谱 -串联质谱仪测定 ，外标法定 量。 4.2 试剂和材料 以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂；水为符合 GB/T 6682规定的一级水。 4.2.1 氯霉素标准品 （ CAP） 含氯霉素 (C11H12Q5N2Cl2)不得少于 97% 4.2.2 乙酸乙酯 4.2.3 乙腈 色谱纯 4.2.4 甲醇 色谱纯 4.2.5 正己烷 4.2.6 氯化钠 4.2
6、.7 氯霉素标准贮备溶液 取氯霉素标准品约 10mg， 精密称定， 用 甲醇 溶解并 稀释 成浓度为100g/mL 的标准 贮 备液，置 -20 保存，保存期不超过 一年 。 4.2.8 氯霉素标准溶液 准确量 取 氯霉素标准贮备溶液适量 ，用 50%乙腈 稀释成浓度为 5g/L 的标准溶液， 置 4 冰箱中保存，保存期不超过 一个月。 4.2.9 4%的氯化钠溶液 称取 40.0g 氯化钠，加水稀释成 1000mL,摇匀即得。 DB51/T 676 2007 2 4.2.10 Waters Sep-Pak Vac C18 固相萃取柱或相当者 500mg， 3 mL。临用前分别 用 5mL甲醇
7、 和 5mL水 预处理，保持柱体湿润。 4.3 仪器和设备 4.3.1 液相色谱 -串联质谱仪 （配电喷雾离子源） 或相当者 4.3.2 实验室常规仪器设备 4.3.3 天平 感量 0.01g 4.3.4 分析天平 感量 0.00001g 4.3.5 漩涡混合仪 4.3.6 振荡器 4.3.7 组织匀浆机 4.3.8 冷冻离心机 4.3.9 固相萃取装置 4.3.10 旋转蒸发仪 4.3.11 氮吹仪 4.3.12 离心管 50mL、 20mL 4.3.13 微孔滤膜 0.22m 4.4 测定步骤 4.4.1 试料的制备 试料的制备包括： 取冷冻样品于室温解冻，将解冻后的样品于 -8 ， 60
8、00r/min 离心 20min，作为供试样品。 取冷冻空白样品于室温解冻，将解冻后的空白样品于 -8 ， 6000r/min 离心 20min，作为空白样品。 取空白样品，添加适宜浓度的标准溶液作为空白添加样品。 4.4.2 提取 取 10.0mL供试样品 ，置 50mL离心管中，加 入 20mL乙酸乙酯 提取 ， 震荡 15min， 以 6000r/min离心 10min，将乙酸乙酯层移 至 鸡心瓶中。再 加 20mL乙酸乙酯 同法操作， 合并 两次 乙酸乙酯提取液 至 鸡心瓶中，于 45水浴中减压旋转蒸发至干。 4.4.3 净化 加 10mL 4%氯化钠溶液于鸡心瓶中，充分 旋涡溶解残留
9、物，加 5mL 正己烷振荡混合 1min， 静置分层 ， 弃 去正己烷。再加 5mL 正己烷 ，同法操作。水层为样品备用液。 用 5mL甲醇、 5mL水淋洗活化 C18柱，弃掉洗涤液。 取上述水层备用液，以每 3 4秒 1滴的流速通过 预处理后的 C18柱， 用 5mL水洗柱，弃去洗液，抽干。用 5mL甲醇 洗脱并收集洗脱液，氮气吹干，用 1mL50%乙腈溶解残余物，充分涡旋，用 0.22m滤膜过滤，滤液供高效液相色谱 -串联质谱仪测定。 4.4.4 标准曲线的制备 准确量 取 适宜浓度的氯霉素标准容液，添加到通过提取、净化后的空白样品洗脱液中， 用氮气吹干 ，用 1mL50%乙腈溶解残余物，
10、充分涡旋，用 0.22um滤膜过滤，制得浓度为 0.20g/L、 0.50g/L 、 1.0g/L、2.0g/L、 5.0g/L、 10.0g/L的系列标准工作溶液，供高效液相色谱 -串联质谱仪测定。 4.4.5 测定 4.4.5.1 液相色谱条件 色谱仪： Waters_2695 高效液相色谱仪 或相当者 色谱柱： AtlantisTM C18 (2.1mm 150mm， 5m) 或相当者 柱温： 30 流速： 0.2mL/min 进样量： 20L DB51/T 676 2007 3 运行时间： 15min 流动相： A：乙腈， B，水 GradienTable Time(min) Flow
11、 Rate(mL/min) A(%) B(%) Curve Initial 0.2 20 80 1 6 0.2 90 10 6 8 0.2 90 10 6 15 0.2 20 80 1 4.4.5.2 质谱条件 质谱仪： Waters Quattro Premier XE 或相当者 电离模式： ESI- 扫描方式：负离子扫描 检测方式：多反应检测 电离电压： 2.8KV 源温： 120 雾化温度： 350。 锥孔气流速： 50L/h； 雾化气流速： 450L/h； 数据采集窗口： 15min 驻留时间： 0.2sec 定性、定量离子及对应的锥孔电压和碰撞电压见表 1 表 1 氯霉素定性、定量离
12、子对和锥孔电压及碰撞电压 药物 定性离子对 (m/z) 定量离子对 (m/z) 锥孔电压 (V) 碰撞电压 (V) 氯霉素（ CAP） 321/152 321/152 30 15 321/257 13 4.4.5.3 测定法 取试样溶液和相应的 标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以峰面积计算，即得。对照溶液及试样溶液中氯霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。标准溶液的总离子流和选择离子流图分别见附录 A 中图 A.1。 4.4.6 空白试验 除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。 4.5 结果计算和表述 按下式计算试样中 氯霉素的残留量： 式中 : X 试样中氯霉素的残留量
13、(ng/mL)； A 试样溶液中氯霉素的峰面积； AS 标准溶液中氯霉素的峰面积； ACsV X= As V0 DB51/T 676 2007 4 cs 标准溶液中氯霉素的浓度 (ng/mL)； V 溶解残余物的体积 (mL)； V0 供试牛奶试样的体积 (mL)。 注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留 3位有效数字。 5 检测方法灵敏度、准确度、精密度 5.1 灵敏度 本方法在牛奶中的检测限为 0.02g/L，最低检出限为 0.05g/L。 5.2 准确度 本方法在牛奶中 0.05g/L 0.2g/L添加浓度的回收率为 50% 120%。 5.3 精密度 本方法
14、的批内变异系数 CV 14.8%； 批间变异系数 CV 23.9%。 DB51/T 676 2007 5 附 录 A （资料性附录） 氯霉素特征离子质量色谱图、特征离子质谱图 0. 5n g / ml 0228T i m e2 .0 0 4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0%12 .0 0 4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0%12 .0 0 4 .0 0 6 .0 0 8 .0 0 1 0 .0 0 1 2 .0 0 1 4 .0 0%2s td -CAP-28 -2 M RM o f 2 Ch a n n e l s ES- 3 2 1 2 5 73 .1 1 e 38 .1 06 .8 16 .5 7s td -CAP-28 -2 M RM o f 2 Ch a n n e l s ES- 3 2 1 1 5 2 .13 .9 4 e 38 .1 31 0 .6 6s td -CAP-28 -2 M RM o f 2 Ch a n n e l s ES- T IC6 .9 8 e 38 .1 06 .8 16 .5 78 .3 6图 A.1 氯霉素标准溶液特 征离子质量色谱图 图 A.2 氯霉素特征离子质谱图
