1、动物骨髓细胞染色体标本的制备,实验目的,掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备技术观察染色体的数目以及形态特征,实验原理,在正常动物细胞中，骨髓是处于不断分裂的组织之一，骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂活性并且数量非常多。处于分裂期的细胞经秋水仙素或秋水酰胺处理后，由于阻断了纺锤丝微管的组装，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，此时染色体达到最大收缩，具有典型的形态，再经离心、低渗处理及固定、滴片、染色等步骤，便可制作较好的骨髓细胞的染色体标本。,低渗,蒸发,实验用品,1器材：解剖器具、注射器（2ml） 、离心机、刻度离心管、玻璃吸管、载玻片、盖玻片、显微镜、恒温水浴锅等；
2、2试剂 0.01%秋水仙素溶液、固定液（甲醇：冰醋酸3：1）、0.4%KCl低渗溶液、Giemsa染液、0.01M磷酸缓冲液(PH6.8)、0.85%生理盐水、2%柠檬酸钠等。 3材料：小鼠、蟾蜍,实验步骤,1、双毁髓法处死蟾蜍，取胸骨剑突最薄处的一部分，用中性红染色5-10min后，镜检，观察高尔基体。2、分别取出蟾蜍前后肢的尺骨和肱骨、胫骨和股骨，用剪刀和纱布剥去全部肌肉，剪去两端的股骨头。3、用2ml注射器吸取1%柠檬酸钠溶液1 ml ，将针头插入骨髓腔，将红骨髓细胞冲入表面皿内，反复几次，直至骨头变白，吸打骨髓细胞，使细胞团块分散。4、将细胞悬液转入尖底离心管中，配平后，以1000rm
3、p离心8min，弃去上清液，留沉淀。5、加入8ml 0.4%KCL溶液，吸打混合均匀，随即将离心管置于26（小鼠为37）水浴中低渗45分钟。（细胞膨胀，使滴片时细胞膜破碎，染色体分散）,6、预固定：加入2mL新鲜固定液，混匀，以1000rpm离心8min。7、去掉上清液，沿离心管壁缓慢、轻轻加入新鲜配置的甲醇：冰醋酸（3：1）固定液10ml，加固定液时注意不要冲动细胞团快。立即用吸管将细胞轻轻吸打均匀，静置固定30min后，1000rpm离心8min。8、吸去上层固定液，视管底细胞多少加入少量新配制的固定液，将细胞团快轻轻吸打成悬液。（0.2-0.5mL）9、在净、冷、湿的载玻片上，滴加3滴上
4、层细胞悬液，在烘箱中烘干。10、将玻片平放于支架上，细胞面向下，每片滴加Giemsa染液数滴，染色15min。 11、在自来水管下冲洗数秒，去掉染液，在烘箱中烘干，显微镜观察。,方法与步骤,取材前34 h，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异。秋水仙素的主要作用是使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，增加中期分裂相的比例。,腹腔内注射秋水仙素34小时后，颈椎脱臼法处死小鼠。,取出小鼠的后肢骨，注意不要将股骨剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失。,滴加适量生理盐水进行冲洗，并仔细地将皮肤、肌肉等组织清除干净，剪去股骨头，将骨髓细胞冲出。,将获得的液体转移到离心管中，加低渗液至8ml左右，37下静
5、置45分钟，进行低渗。低渗结束后，加入2ml左右的固定液进行预固定，轻轻混匀后，离心。,1200转/分，离心8分钟，弃上清，加入固定液，混匀后，室温放置30分钟，离心后，向沉淀中加入0.5 ml预冷的固定液，将细胞重悬。,预冷的玻片,滴片后，将片子晾干，滴加适量Giemsa染液染色15分钟，弃去染液，水洗，镜检。,结果显示,注意事项 1、低渗与离心等步骤的操作要轻。2、骨髓细胞滴片时高度的掌握很重要，可在11.5m间进行预实验，用1.5m较好。,实验报告,记录所观察蟾蜍骨髓细胞染色体的数目和形态。说明在骨髓细胞染色体的制备过程中的关键步骤，秋水仙素对染色体制备的影响？你制备的蟾蜍染色体标本，分裂相是否多，染色体分散程度如何？有什么不足处，原因何在？,
