1、实验室常用检测技术简要介绍,主要内容,概述 疾病鉴别诊断过程临床症状和大体病变检 病料的采集及处理 实验室检验病料中细菌的检测病料中病毒的检测,一 、疾病鉴别诊断过程,临床标本的采集及处理 原则合理的采样时机正确的采样方法适宜的采样部位,一 、标本采集 尽量在病程的早期采集；标本应放置无菌容器中；标本应做适当的标记，如动物、地点、时间、暂定的诊断等。1 唾液在生理理盐水中常加0.5%明胶或BSA，以保护不稳定病毒。 2 鼻、咽及肛门拭子 3 粪便标本4 脑脊髓液、心包液、尿液等 5 尸体材料 死后应尽早获取，无菌采取，不使用防腐剂。 不同病毒所取材料不同，如NDV，取脑、气管，FMV取肺、PR
2、RS取肺、SFV取淋巴结等。,二 标本的保存和运送 尽量活体送检，大部分病毒不稳定，必须尽快送实验室；如有延误，则标本必须冷藏，到实验室立即处理和接种，延误时间短的，可置4；时间延误较长，置-70。 如邮寄标本则需放置有干冰的保温箱内。三 标本处理1 体液 可以直接接种、检测2血标本 凝固血离心后的血清即可用于检测3各种拭子 4粪便标本 5 组织材料,病原学检测常用的实验室技术,分离培养 （“金标准”）形态学检查 （病毒 电镜镜检）细菌的生化试验动物实验免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化分子生物学诊断技术 PCR 荧光定量PCR,二、病料中细菌的检测方法,细菌的形态学检查细菌的分离培
3、养细菌的生化试验动物试验血清学试验分子生物学方法,光学显微镜下细菌的形态,细菌的形态观察,光镜和电镜的比较,大肠杆菌,葡萄球菌,电镜镜检,光学显微镜镜检,培养结果,初次分离,纯培养,鉴别培养,不乳糖,发酵乳糖,麦康凯平板,不发酵乳糖的细菌,大肠杆菌，呈现黑色金属光泽,EMB平板,SS平板,大肠杆菌或者别的发酵乳糖的肠杆菌,有黑色中心的是沙门氏菌。如果没有黑色中心，就很可能是志贺氏菌了。,不发酵乳糖的肠道菌，可能就是志贺氏菌。,不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生硫化氢，可能是沙门氏菌,发酵乳糖的某种肠杆菌。,HE（苏木素伊红)琼脂平板,本培养基倾注平皿待冷却后呈草绿色，质控菌株接种后。361培养1
4、824h，观察结果 。大肠杆菌部分被抑制，橙黄色-橙红色。葡萄球菌生长被抑制。,革兰氏染色,革兰氏阳性,革兰氏阴性,染色原理及过程：初染（结晶紫）媒染（碘液）脱色（ 95酒精）复染（复红）,细菌的生化试验,硫化氢试验,糖发酵试验,MR试验,VP试验,靛基质试验,药敏试验示意图,涂布细菌,贴上药敏纸片,1,2,温箱培养,3,4,以大肠杆菌为例：,剖检（采集病料）纤维素渗出物的涂片染色分离培养（普通营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板）培养物涂片G染色生化试验动物试验血清学实验 玻板凝集鉴定血清型,三、病料中病毒的检测,病毒分离和鉴定的一般程序,常用检测方法,分离培养血清学 中和试验 补
5、体结合试验 血凝及血凝抑制试验 免疫扩散试验 免疫学诊断技术 ELISA IFA 免疫组化分子生物学检测 PCR 分子杂交技术,病毒分离,1动物接种,病毒的分离与鉴定,2鸡胚培养,3组织培养,病毒中和试验,本实验极为特异和敏感，是病毒学中重要的血清学实验。主要用于病毒感染的血清学诊断、病毒分离株的鉴定、不同病毒株的抗原关系研究、疫苗免疫原性的评价、免疫血清质量的评价以及实验动物中是否存在相应的抗体等。,virus,补体结合反应,溶血 （-）,不溶血 （+）,免疫扩散,电镜技术,鸡痘病毒（超薄切片）,狂犬病毒包涵体（Negri body）,ELISA分类,ELISA Procedures,分子生
6、物学方法,PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应) 荧光实时定量PCR （real time PCR）NASBA （依赖核酸序列的扩增）,PCR原理:实质就是体外基因复制技术,加热变性95 C,靶序列引物退火55 C,引物延伸72 C,原理图示,一,二,三 完成一个循环,30次循环后靶序列扩增的数量,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle
7、 = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,荧光定量PCR Taqman 技术,特异性荧光双标记探针Taq酶 53外切酶活性,染料法的优点：成本低不需要探针；适合初步筛查先用SYBR筛查，再用TaqMan精确定量部分关键样品；融解曲线鉴定PCR有无杂带、引物二聚体；染料法的缺点：无模板特异性 不能分辨主带与杂带，给出的是总信号；不能做多重检测 每孔只能检测一个目标基因；灵敏度低适合于5000 拷贝以上的基因定量。,与DNA结合时发光,游离时不发光,SYBR Green I染料法,举例：基于结核分枝杆菌插入序列IS1081，建立SYBR Green荧光定量PCR方法。实验结果：,图2.3：标准曲线,市场上常见的实时荧光PCR仪,谢谢！,
