1、反相高效液相色谱法测定果品中有机酸 WWW.SFNCC.ORG.CN 2008-7-18 国家食物与营养咨询委员会 庞新安 1， 2，万 英 1， 2 （ 1 新疆生产建设兵团塔里木盆地生物资源保护利用重点实验室，阿拉尔 843300; 2 塔里木大学生物技术研究开发中心，阿拉尔 843300） 摘 要：采用反相高效液相色谱法同时测定 5 种有机酸，有机酸浓度在 5 500g L 时，其峰面积和有机酸浓度的线性相关系数均在 0.999 以上，用此法测定了新疆地产四种特色果品中有机酸的含量，取得了满意的结果。 关键词：反相高效液相色谱法；有机酸；果品 有机酸是果品中主要风味物质之一，直接影响果品
2、风味、口感及色泽，是果品成熟度、耐储藏性以及加工性的重要依据，其种类和含量与果品品质有密切关系，因此在果品品质鉴定中占有重要地位 1。目前，果品中主要以总有机酸含量即可滴定酸度作为有机酸评价指标，不能具体反映出有机酸的种类及其含量；薄层色谱法虽可测定多种有机酸，但测量精度差，不适 合定量；气相色谱法需要衍生化，步骤繁琐，并影响分析结果 2；高效液相色谱法是近几年来发展较快的方法，广泛用于各种食品和天然产物中有机酸的测定 3-11。 本文采用反相高效液相色谱法直接测定巴旦杏、无花果、沙枣、石榴中有机酸种类及其含量，同时分析 4 种地产干鲜果品中各有机酸含量之间的关系，以期建立适合于新疆地产果品中
3、有机酸的检测方法，并对新疆地产巴旦杏、无花果、沙枣、石榴中有机酸营养进行综合评价，从而为深层次地开发利用 4 种地产干鲜果品提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 Waters-2695 高效液相色谱仪，配 2487 紫外检测器，配 Empower 色谱工作站（美国 Waters公司）； FW-100 型高速万能粉碎机（北京市永光明医疗仪器厂）； VIC-412 型 Sartorius电子天平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司）； DHG-9101 2SA 型电热恒温鼓风干燥箱（扬州鸿都电子有限公司）； SK5200H 型超声波洗涤器（上海科导超声仪器有限公司）； T18型匀浆分散器
4、 （ IKA -WORKS 公司）；旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）； pH211型酸度计（意大利 HANNA 公司）。 酒石酸、苹果酸、乙酸、柠 檬酸、丁二酸（均为色谱纯）；磷酸氢二铵、磷酸、无水乙醇（均为 AR）；巴旦杏、无花果、沙枣、石榴样品采自新疆特色果品种植基地。 1.2 色谱条件 色谱柱： SinoChrom ODS-BP 分析柱（ 4.6mm250mm ， 5m ，大连依利特科学仪器有限公司）；流速： 1.0ml min；柱温： 37 ；检测波长： 210nm；进样量： 20l ；流动相：磷酸氢二铵缓冲溶液，浓度为 0.01mol L， pH=2.88。 1.3 样品处理 精确
5、称取预先处理好的巴旦杏、无花果、沙枣、石榴样品，其中巴旦杏、无花果、沙枣为干样， 石榴为鲜样；按照样品制备程序将其放入干燥洁净的烧杯中，加入 80乙醇溶液 50ml 于常温下匀浆提取 5min；取出匀浆液过滤并多次用 80乙醇溶液冲洗沉淀，合并滤液混匀定容至 100ml 容量瓶中，于旋转蒸发仪 75 蒸干后，用流动相溶解稀释后定容到一定体积，过 0.22m 滤膜后进行 HPLC 测定。 2 结果与分析 2.1 有机酸标样工作曲线 将有机酸标准液配制成浓度分别为 5、 10、 50、 100、 300、 500g L 的溶液，每一标准液取 201 依上法进行测定，以有机酸溶液浓度（ C， g L
6、）为横坐标（ x）、峰面 积内标面积（ A， v.s ）为纵坐标（ Y）绘制有机酸的标准工作曲线，并利用峰面积与浓度进行线性回归。同时，按照上述色谱操作条件对浓度为 300g L 有机酸标准溶液平行测定 5 次以进行精密度试验，计算相对标准偏差，并以 3 倍噪声（ S N=3）计算检出限。 5种有机酸标准品的保留时间、回归方程、相关系数、相对标准偏差、最小检测限见表 1。 结果表明，在一定浓度范围内，各种有机酸的出峰时间较为稳定而且互不干扰，内标峰面积与有机酸浓度线性关系良好，其相关系数为 0.9998 9999，可以作为定量分析依据。同时， 5 种有机酸标 准品的相对标准偏差均小于 2，表明
7、分析仪器具有较好的精密度，紫外检测器的最小检测限为 0.13 10.967g L，符合国家标准要求。 表 1 有机酸标准工作曲线 序 有机 保留时 回归 相关 相对标准 检出限 序 有机 保留时间 回归 相关 相对标准 检出限 号 酸 间（ min） 方程 系数 偏差（ %） （ g/L ） 号 酸 （ min） 方程 系数 偏差（ %） （ g/L ） 1 酒石酸 3.359 A=2140C+4690 0.999803 1.318 4.383 4 柠檬酸 8.820 A=1430C-2280 0.999989 0.272 3.189 2 苹果酸 4.565 A=1080C 0.999996
8、0.152 0.131 5 丁二酸 1.211 A=724C-3970 0.999991 0.347 10.967 3 乙酸 5.986 A=676C-650 0.999996 0.174 1.923 2.2 样品有机酸分析结果 新疆地产巴旦杏、无花果、沙枣、石榴等 4 种干鲜果品中各种有机酸含量见表 2。由表 2可知， 4 种干鲜果品样品中含 5 种有机酸，有机酸总量为 0.8829 2.3321，其中 无花果、沙枣、石榴富含柠檬酸，而巴旦杏富含酒石酸，因此具有较高的营养价值。 表 2 四种果品中有机酸组成分析结果 序 有机 保留时间 含量（ %） 序 有机 保留时间 含量（ %） 号 酸
9、（ min） 巴旦杏 无花果 沙枣 石榴 号 酸 （ min） 巴旦杏 无花果 沙枣 石榴 1 酒石酸 3.355 3.368 1.1843 未检出 0.0264 未检出 4 柠檬酸 8.8108.827 0.3023 0.5004 1.5050 2.2843 2 苹果酸 4.561 4.569 0.1475 0.2478 0.5604 0.0478 5 丁二酸 11.104 11.456 0.0932 0.0364 0.0200 未检出 3 乙酸 5.959 6.320 0.0533 0.0983 0.0124 未检出 有机酸总量（ %） 1.7806 0.8829 2.1242 2.332
10、1 3 结论 本文利用 Waters 公司的反相高效液相色谱方法测定了新疆地产巴旦杏、无花果、沙枣、石榴中有机酸的种类及其含量。结果表明， 4 种干鲜果品富含 5 种有机酸，其有机酸配比合理，适宜人体 吸收利用。同时，该测定方法线性范围较宽，相关系数在 0.9998 0.9999之间，相对标准偏差均小于 2，其检出限符合国家标准要求，并在 15min 内完成待测样品中 5 种有机酸的测定。本研究所建立的方法简便、快速、经济，具有良好的灵敏度、精密度和准确度，可以满足新疆地产巴旦杏、无花果、沙枣、石榴样品中有机酸分析要求，同时对其他果品中有机酸分析具有一定的参考价值。 参考文献 1王常糯 .天然
11、果汁的分析现状 .云南大学学报， 1999， 21（ 2）： 110-111. 2朱晓兰，高芸，苏庆德 .毛细管气相色谱法测定 番茄中的非挥发性有机酸、高级脂肪酸和低分子量糖类 .食品科学， 2004， 25（ 9）： 152-157. 3郭根和，等 .反相高效液相色谱法同时测定枇杷中的某些有机酸 .福建农业学报， 2005，20（ 3）： 198-201. 4丁玲，屠幼英，陈晓敏 .高效液相色谱测定紧压茶中有机酸条件研究 .茶叶， 2005，31（ 4）： 224-227. 5郭瑛，肖朝萍，王红，黄天宝 .高效液相色谱法测定乌梅有机酸 .分析化学， 2004，32（ 12）： 1624-16
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14、动相 pH值，可使几种有机酸依次分离。紫外 214nm适于检测。 试剂 酒石酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸：均为分析纯。水：重蒸并经 0， 45m滤膜过滤；磷酸：优级纯。 仪器 HPLC 色谱条件： 柱： Novapak C10(0 4cm15cm)， 流动相： 0.1 H3P04 流速： 0 8ml min 检测器： UV214nm0 1AUFS 样品制备 标准溶液配制：精密称取六种有机酸标样各 20mg 于 10m1 容量瓶中，用流动相溶解并定容，摇匀备用。 样品溶液配制： 液体样品：取液体样品 l 0ml 于 100ml 容量瓶中，用流动相稀释并定容，据匀后经 0 45m滤膜过滤
15、，清液待测定。 固体样品：精密称取固体样品 10g 粉碎匀浆后转至 100ml 容量瓶中，加 50ml 0 0lmol L 氢氧化钠溶液在水浴上煮 沸 30min，冷却后过滤至 100ml 容量瓶中，用水定容格匀后经 0 46m滤膜过滤，清液待测定。 测定 标准曲线绘制：取混合标样 0 5ml， 1ml， 1 5ml， 2ml， 2 5ml 于五个 10ml 容量瓶中，用流动相稀释并定容。在上述色谱条件下，取五种浓度溶液各 10l进行色谱分析，得到标样图 2-11。作各组分峰面积对含量图，得到标准曲线。 样品溶液测定：在同一色谱条件下，取 10l待测溶液进行色谱分析，得到色谱图 2-12。以各相应蜂面积在标准曲线上查出各组分含量。 计算 外标法定量： C=式中 C-1008(m1)样品中各有机酸含虽 (g)； C1-样品进样体积中各有机酸含量 (g)； C2-样品称样量（ g 或 ml） V1-样品进样体积（ l）； V2-样品定容体积（ ml）
