1、分光光度计 一 分光光度计基本结构简介 能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。分光光度计因使用的波长范围不同而分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。无论哪一类分光光度计都由下列五部分组成，即光源、单色器、狭缝、样品池，检测器系统。 （ 1） 光源 要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用的有白炽灯（钨比灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等多种。钨灯和卤钨灯发射 320 2000nm 连续光谱，最适宜工作范围为 360 1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源。氢灯
2、和氘灯能发射 150 400nm 的紫外结，可用作紫外光区分光光度计的光源。红外线光源则由纳恩斯特（ Nernst）棒产生，此棒由 r 2: 2 3=17:3（ r 为锆，为钇）或 2 3， e 2（ e为铈）及 h 2 （ h 为钍）之混合 物制成。汞灯发射的不是连续光谱， 能量绝大部分集中在 253.6nm 波长外，一般作波长校正用。钨灯在出现灯管发黑时应及更换，如换用的灯型号不同，还需要调节灯座的位置的焦距。氢粘及氘灯的灯管或窗口是石英的，且有固定的发射方向，安装时必须仔细校正接触灯管时应戴手套以防留下污迹 。 （ 2） 分光系统（单色器） 单色器是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光
3、的装置，由棱镜或光栅构成。用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作，石棱镜工作波长范围为 185 4000nm，在紫外区有较好的分辩力而且也适用于可见光区和近红外区。 棱镜的特点是波长越短，色散程度越好，越向长波一侧越差。所以用棱镜的分光光度计，其波长刻度在紫外区可达到 0.2nm，而在长波段只能达到 5nm。有的分光光系统是衍射光栅，即在石英或玻璃的表面上刻划许多平行线，刻线处不透光，于是通过光的干涉和衍射现象，较长的光波偏折的角度大，较短的光波偏折的角度小， 因而形成光谱。 （ 3） 狭缝 狭缝是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力。狭缝
4、可在 0 2mm 宽度内调节，由于棱镜色散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节。 （ 4） 比色环 比争环也叫样品池，吸收器或比色皿，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差。玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光学面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以至铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过 15 分钟），表 面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净。 （ 5） 检测器系统 有许多金属能在光的照射下产生电流，光愈强电流愈大，此即光电效应。因光照射而产生的电流叫做光电流。受光器有两种，一是光电池，二是光电管。
5、光电池的组成种类繁多，最常见的是硒光电池。光电池受光照射产生的电流颇大，可直接用微电流计量出。但是，当连续照射一段时间会产生疲劳现象而使光电流下降，要在暗中放置一些时候才能恢复。因此使用时不宜长期照射，随用随关，以防止光电池因疲劳而产生误差。光电管装有一个阴极和一个阳极，阴极是用对光敏感的金属（多为碱土金属的氧化物）做成，当 光射到阴极且达到一定能量时，金属原子中电子发射出来。光愈强，光波的振幅愈大，电子放出愈多。电子是带负电的，被吸引到阳极上而产生电流。光电管产生电流很小，需要放大。分光光度计中常用电子倍增光电管，在光照射下所产生的电流比其他光电管要大得多，这就提高了测定的灵敏度。检测器产生
6、的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟数字转换装置如数字式电压表 二 分光光度计的分类 （ 1） 按工作光谱原理的不同， 分光光度计可分为研究物质分子吸收光谱的分 光光度计、研究物质中原子吸收的原子吸收分光光度计、研究物质分子荧光发射的荧光分光光度计和研究物质原子荧光发射的原子荧光分光光度汁、研究分子喇曼散射光谱的喇曼光谱仪等。 （ 2） 按色散元件可分棱镜分光光度计和光栅分光光度计 。 （ 3） 按仪器光路可分单光束分光光度计和双光束分光光度计； （ 4） 按光学区域可分为可见分光光度计、紫外分光光度计和
7、紫外 -可见分光光度计； （ 5） 按检测方式可分为光电管或光电倍增管的可变波长分光光度计和二极管阵列的同时检测分光光度计； （ 6） 按检测波长可分为单波长和双波长分光光度计 ; （ 7） 按操作方式可分为手动和采用计算机控制的自动分 光光度计等 。 备注 ： 1 单波长单光束分光光度计 具有结构简单、价格低廉、操作方便、维修也比较容易，适用于常规分析 ； 双波长分光光度计的优点：是可以在有背景干忧或共存组分吸收干忧的情况下对某组分进行定量测定。 2 双波长分光光度法和单波长分光光度法在光度测量方法上 的 主要差别这两种方法在光度测量时主要的差别有定物质的干扰，可在 。 混浊溶液中进行被测物
8、质的吸两点：光度测定，也可对背景吸收较大的溶液进行测定，也 (1)双波长法采用两个单色器。从同一光源强度相同的光束分别经过两个单色器得到两束不同波长的光和 z，交替地通过盛有被测溶液的同一个吸收池 (或称吸收皿 )。和 z 的波长数是事前选定的。所测量的是被测溶液在和 z 波长处的吸光度的差(AA)。此 A 与被测物质的浓度，在一定的范围内同样遵守比耳定律。 (2)双波长法测定时只用一个吸收皿，不需要参比溶液。正由于这两项特点，双波长法能解决共存非测消除了常规单波长法中采用两个吸收皿所造成的误差。从而对很小的吸光度值也能准确测定。双波长法需要用专门的分光光度计，即双波长分光光度计。有人用一 般
9、的单波长分光光度计，仍采用两个吸收皿，先后在两个选定的波长处测得吸光度 A 和 A 后，两值相减而算得 A。按双波长法的原理，这样的操作是不符合要求的，但是从结果看，还能使测定的选择性或灵敏度有所改善 。 3 双波长分光光度计与单波长分光光度计的主要差别在于采用双单色器 。 从光源出发点光分成两束，分别经过两个单色器，得到两束强度相同、波长分别为 1 和 2 的单色光。以切光器（旋转镜）调制使 1、2 两单色光交替地照射到同一吸收池上，其透过光被检测器所接收，经信号处理系统可直接获得对 1 及 2 两单色光的吸光度之差值。 4 分光光度计样品室中的光束为 1 条时叫单光束， 2条时叫双光束。如
10、图所示，单光束装置中，出自分光器的单色光直接入射检测器。在双光束装置中出自分光器的单色光被分割为样品光和参比光后，入射检测器。采用单光束方式的装置，配置简单、廉价。 分光光度计的光源强度、检测器的灵敏度随时间发生变化。当只是测定样品光时，在基线测定和样品测定之间，光源强度、检测器的灵敏度会发生变动，从而将造成测定值的误差。参比光起到了随时监测这种变动并对变动的影响进行校正的作用。因此，双光束的装置即使光源强度、检测器的灵敏度会变动，也可稳定地进行测定。另一方面，单光束的装置直接受到光源强度、检测器的灵敏度变动的影响。在使用单光束的装置时必须注意在打开电源后要等待光源、检测器的稳定，还要频繁地实
11、施基线校正、自动零点校正等来抑制变动的影响。 三 分光光度计波长的校正 校正波长读数的方法多样，在可见光区校正波长最简便的方法是采用镨钕滤光片，测出 529nm 和 808nm 处的 2 个吸收峰最大吸收波长。如果测出的最大吸收波长与仪器标示值相差 3nm 以上 ,则需要细微调节波长刻度校正螺钉（不同型号的仪器波长读数的校正方法有所不同，应按仪器说明书进行波 长调节）。如果测出的最大吸收波长与仪器波长标示值差大于 10nm，则需要重新调整钨灯泡位置，或检修单色器的光学系统。（应请计量部门或送生产厂检修，不可自己打开单色器）。 四 分光光度计的原理 1.吸收光谱原理 物质中分子内部的运动可分为电
12、子的运动、分子内原子的振动和分子自身的转动，因此具有电子能级、振动能级和转动能级。 当分子被光照射时，将吸收能量引起能级跃迁，即从基态能级跃迁到激发态能级。而三种能级跃迁所需能量是不同的，需用不同波长的电磁波去激发。电子能级跃迁所需的能量较大，一般在 1eV 20eV，吸收光谱主要处于紫外及可见光区，这种光谱称为紫外及可见光谱。如果用红外线 (能量为 1eV 0.025eV)照射分子，此能量不足以引起电子能级的跃迁，而只能引发振动能级和转动能级的跃迁，得到的光谱为红外光谱。若以能量更低的远红外线 (0.025eV 0.003eV)照射分子，只能引起转动能级的跃迁，这种光谱称为远红外光谱。由于物
13、质结构不同对上述各能级跃迁所需能量都不一样，因此对光的吸收也就不一样，各种物质都有各自的吸收光带，因而就可以对不同物质进行鉴定分析，这是光度法进行定性分析的基础。 2 根据朗伯 比耳定 律 :当入射光波长、溶质、溶剂以及溶液的温度一定时，溶液的光密度和溶液层厚度及溶液的浓度成正比，若液层的厚度一定，则溶液的光密度只与溶液的浓度有关， 式中， c 为溶液浓度， E 为某一单色波长下的光密度 (又称吸光度 )， I0 为入射光强度， I 为 透射光强度， T 为透光率， 为摩尔消光系数， l 为液层厚度。 在待测物质的厚度 l一定时，吸光度与被测物质的浓度成正比，这就是光度法定量分析的依据。 备注
14、： 1.朗伯定律 一束单色光通过溶液后，由于溶液吸收了一部分光能，光的强度就要减弱：若溶液浓度不变，则溶液的厚度愈大（即光在溶液中所经过的途径愈长），光的强度减低也愈显著。 2.朗伯比尔定律 如果同时考虑吸收层的厚度和溶液浓度对光吸收的影响，则必然将朗伯定律和比尔定律合并起来，吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比，这就是朗伯比尔定律。 五 分光光度计的使用方法及注意事项 （一） 使用方法 1.开机 安装好仪器后，检查样池位置，使其处在光路中（拉动拉手应感应到每档的定位），关好样品室门，打开仪器电源开关，预热 10 分钟，即可进行测量。 2 打开样品室门，将方式定于透过率档，按 0%T 进
15、行机械调零。 3 从蒸馏水中取出比色皿，擦干。注意拿比色皿的时候拿毛玻璃面。向比色皿内注入少量试液，润洗三次，然后注入 3/4 至 4/5 的试液，用滤纸片擦干外壁所挂水珠。 将比色皿按顺序放入样品池。注意光面对光源。 4 在样品池中放置空白液与样品 5 按需要调节波长旋钮，使显示窗显示所需波长。 6 使空白溶液位于光路中，按方式选择键使吸光度指示灯亮，按 100%T 键调100%，至窗口显示 100%。 7 打开样品室门，将功能调于透射比档，观察显示是否为 0.0，若否则按 0%T键调零。调零后再放回吸光度档。 8 重复上两步，直至仪器稳定。 9 将样品置入光路，从显示屏上读取吸光度。 (二
16、 )注意事项 1.必须正确使用比色皿。 （ 1）不可用手、滤纸、毛刷等摩擦透光面，只能用绸布和擦镜纸擦。 （ 2）必须彻底洗净，塑料杯染了色，必须及时用乙醇荡洗，绝不可用乙醇、丙铜浸泡。 （ 3）杯内溶液不可盛的过满过少。 （ 4）拖动池架要轻，要到位。 （ 5）杯内废液要倒入废液瓶，绝不允许洒在地上。 （ 6）要区分参比杯和样品杯，不可随意互换。 （ 7）石英杯不准放在台面上。只准放在仪器内或盒内，以防打破。 2.光源的反光镜拨杆要放置正确、到位。 3.仪器用完毕必须及时关闭全部电源，要节约氘灯的使用。 4 每台仪器所配套的比色皿不能与其它仪器上的比色皿单个调换。 5 如果大幅度改变测试波长
17、时，需等数分钟后才能正常工作。（因波长由长波向短波或短波向长波移动时，光能量变化急剧，光电管受光后响应较慢，需一段光响应平衡时间。 6. 如果显示数值有异常很可能为坞灯已坏，请尽早更换。 7 测定波长在 360nm以上时，可用玻璃比色皿 ;波长在 360nm以下时，要用石英比色皿。比色皿外部要用吸水纸吸干，不能用手触摸光面的表面。 8 不测量时，应使样品室盖处于开启状态，否则会使光电管疲劳，数字显示不稳定。 9 连续使用仪器的时间不应超过 2 小时，最好是间歇 0.5 小时后，再继续使用。 10. 仪器不能受潮。在日常使用中，应经常注意单色器上的防潮硅胶 (在仪器的底部 )是否变色，如硅胶的颜
18、色已变红，应立即取出烘干或更换。 11为了避免仪器积灰和玷污，在停止工作时用塑料套子罩住整个仪器，在套子内应放置防潮硅胶，以保持仪器的干燥。 12取吸收池时，手指应拿毛玻璃面的两侧，装盛样品以池体的 4/5 为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无溶剂残留。吸收池放入样品室时应注意方向相同。用后用溶剂或水冲洗干净，晾干防 尘保存。 （三） 分光光度计常见问题 1 无单色光或光斑不完整 有钨灯光进入单色器，无出射单色光或光斑不均匀、不完整。把钨灯光源调到最亮，波长转盘放在 580nm 处，在出光孔处放一纸卡片以便观察，重新调整光源灯灯丝位置，同时在纸卡片处观察光斑
19、形状，使其为黄色且光斑最完整。如不好，可松开光源灯与底板紧固螺丝，使 其前后左右移动，观察使光斑最好。 2 钨灯亮但总无出射光 钨灯亮，无论如何调整光源灯的位置，总无出射光。打开单色器光路，首先检查单色器进口狭缝处应有光亮进入，如果无，可调节光源灯位置使光亮进入，再用白纸卡片随着光斑向准直镜方向移动，使光斑落在准直镜的中央稍下处，如太偏左或太偏右，可通过调节反射镜的位置纠正再检查出口狭缝处是否有光谱带，太高太低或太左太右，都不能从出口狭缝处射出单色光，调节准直镜的三个螺钉，使光斑在 580nm 处为黄色且光斑最完整。 3 光斑大小不均匀且模糊散光 拆开 单色器，拆下四个长螺钉分开入射及出射调节
20、部件，发现狭缝上下不平衡，而且小圆保护玻璃开裂，一般狭缝部件宽 0.3mm 且要求上下平衡。通过调节狭缝位置、更换保护玻璃，仪器恢复正常。 4仪器的杂散光偏高 国家标准对分光光度计的杂散光明确规定， 721 棱镜型分光光度计的杂散光 4% 。杂散光是可见分光光度计的重要指标，产生杂散光的主要原因有：灰尘站污光学元件或光学元件上有水珠。例如光源灯、棱镜、透镜以及反射镜等光学元件损坏或有其他缺陷（如棱镜中有气泡），光路内存在漏光现象等等。 对于光学元件的灰 尘和水珠可用镜头纸蘸无水酒精擦拭，并用净风吹干。而光学元件损坏只有更换对于漏光，可用黑布遮住仪器，测试光电管、暗盒等部分，找到漏光处加以排除。
21、 5 光度计不能调满度。若 721 型分光光度计不能调满度（ 100%T）。开机后调 100%旋钮，从仪器的背面可见光亮度可调，表头指针在灵敏度打到最大位时仍不能调满度，打开比色皿暗盒盖，用手轻按一下光门顶杆，使光门微微打开，可见表头指针迅速向 100%方向偏转。由此可见光电管及放大器正常，将比色皿架取出，在比色皿暗盒靠近光门处放一张白纸，白纸上无光斑。造成这种现象有以下几种原因：光源类由于灯架松动产生移位，灯丝未对准光路；校正波长过程中由于经验不足，将校正螺丝旋转过度，光斑偏移不能落到出光狭缝上；分光系统脱落移位。 为了排除此种故障，首先应从仪器的底部将分光系统的外壳打开，检查分光系统各部门
22、。有松动及脱落的部件将其固定。打开电源调整灯泡位置，将入射光斑调到入射狭缝上，并在光源灯亮度不变的情况下，将光斑调到最亮且边缘整齐的长方形。调整准直镜上、下、左、右位置使光斑落到出射狭缝上，此时从比色皿暗盒观察可见到一矩型光斑，出射光调好后进行波长校正，仪器即可恢复正常。 6透光度 T 不稳。若 721 型分光光度计在测量过程中，透光度 T 不稳。此故障由光路系统漏光所致。检查聚光透镜的接口部，此处有一橡皮圈，由于橡皮圈移位可造成漏光。 比色皿暗盒盖不将顶杆全部压下也可造成漏光。机箱变形，使光门顶杆的长度不够，而不能使光门全部开启。比色皿的定位槽松动而引起每次定位不一致。可重复校正固定定位槽。光电管老化，需更换光电管。 7调零旋钮不能归零。此故障在光路部分多由光门顶杆不能弹出造成。有两种原因：顶杆弯曲卡死；光口生锈，或位移不能正常落下。将机械部分故障修复，仪器即可正常调零。在检修光路系统以后，需进行波长校正，否则仪器测量出的结果准确性会下降，只能将波长较正后，仪器方可完全恢复正常。
