1、作者简介：闵建 (1984 ),男，在读硕士，粮食油脂及植物蛋白工程专业。 E-mail:。 微生物产生的抗菌肽研究 状况 闵建，李理 (华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640) 摘要： 抗菌多肽是 微 生物、植物、动物 中 由基因编码，核糖体合成的具有抗菌活性 的 多肽、蛋白质、不同蛋白的复合物或者蛋白与糖、脂的复合物。动物和植物产生的抗菌多肽的研究比较成熟，大多都已经知道其抗菌机理，而微生物研究较多的抗菌多肽是放线菌产生的抗菌多肽，对于细菌、酵母、霉菌和藻类的研究较少，本文综述主要综述了国内外细菌、真菌、霉菌和藻类产抗菌多肽以及它们的抗菌机理。 关键字： 抗菌多肽，细菌， 抗菌
2、机理 Current Research on Antibacterial Polypeptides Produced by Microorganism Min jian Li Li (College of Light Industry and Food Science, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China) Abstract: Antibacterial polypeptides are complexes conjugated with carbohydrate or lipids. These comp
3、lexes are encoded by Gene and synthesized by Ribosome. Antibacterial polypeptides isolated from animals and plants were well-known and the principles were studied. However, less antibacterial polypeptides were isolated from microorganism such as bacterium, yeast, mould and algae. The antibacterial p
4、olypeptides isolated from microorganism and the principles were reviewed in this paper. Keywords: antibacterial polypeptide, bacterial, principle 前言 抗菌多肽是生物产生的一类抵御原微生物的防御反应的多肽，它 的分子量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广等特定，有可能成为 一种高效、低毒并且无残留危害的抗菌、抗病毒、抗癌新药，甚至可以通过基因工程的方法将抗菌肽基因导入到植物、动物和微生物内，用于大批量生产或进行动植物的抗病育种。 抗菌多肽研究
5、的兴起是在 20 世纪 80年代， 1980 年 Boman 等从美国天蚕蛹中分离得到的天蚕素是第一个被发现的抗菌肽，后来很多从昆虫、动物、植物等生物中不断的分离得到各种不同的抗菌多肽，其抗菌机理也不断被研究发现。 微生物产生的抗菌多肽近年来也在不断的深入，本文综述了除放线菌以外的细菌 、酵母、霉菌、藻类产抗菌多肽，介绍了这些抗菌多肽的特性 及其抗菌机理。 1 细菌产生的抗菌肽 1.1 杆菌肽 (bacitracin) 杆菌肽是 由地衣芽孢杆菌 (Bacillus lichnifarimis)和枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)产生的 一种短肽类的新型广谱抗菌素，它能够有效控
6、 G+和 G-细菌 ，如金黄色葡萄球菌（ Staphylococcus） 、链球菌 （ Streptococcus）、艰难梭菌 (Clostridium difficile)和一些古细菌(Archaebacteria)、甲烷 杆菌 (Methanobacterium)、盐球菌 (Halococcus) 1-2。 杆菌肽极易溶于水、甲醇、二甲 基亚砜，易溶于乙醇，微溶于丙酮、苯、醚类，不溶于氯仿 ,它有许多异构体，分别为杆菌肽 A、 A1、 B、 C、 D、 E、 F1、 F2、 F3 和 G，这些异构体的结构示意图如图 1， 杆菌肽 A 的结构是由 12 个氨基酸组成含有噻唑环的多肽复合体 3
7、。 它 在酸性到中性的溶液中很稳定，然而在 PH9 的溶液中时 室温下就会很快降解 2。 图 1 杆菌肽的结构示意图 Fig.1 Schematic structure of bacitracin congeners 杆菌肽必需与二价金属离子以 1:1 的比例结合形成络合物才有生物活性，与金属离子的亲和力顺序为 Cu2+Ni2+Co2+ Zn2+Mn2+4。 杆菌肽的抗菌作用与它抑制细胞壁的合成有关，革 兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖组成，而抗菌肽却正好阻止了肽聚糖的合成，也有研究表明抗菌肽影响了细胞壁中氨基酸合成蛋白质再进一步形成细胞壁 5-6。 由于杆菌肽易吸潮，所以在生产发酵达到杆菌肽效
8、价最高时，直接在培养液中加锌盐，生成较稳定的杆菌肽锌络合物。这种络合物在饲养业中应用很广 ，常用于抗生素饲料添加剂。这种抗生素饲料添加剂有许多优点 7：理化性质较稳定，易保存；毒副作用小；适量添加无残留；无配伍禁忌，不产生抗药性，可长期使用。 1.2 短杆菌肽 S(Gramicidin S, GS) GS 是 Bacillus brevis 分泌的由 10 个氨基酸组成的环状肽类抗生素，它是 1944 年从前苏联的一个农场的土壤中分离发现的，其结构表示为Cyclo-(L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Phe-L-Pro)28-9。 GS 有很高的生物活性，对 G+和一些病原菌都有显著的杀
9、伤作用 ，但是它作用的专一性小，具有溶血细胞毒性和肝、肾的细胞毒性，所以限制了其应用范围 10。 CS 的三维结构模型如图 2， D-Phe-Pro 构成了其两侧的 -转角 ，两个三肽序列-Val-Orn-Leu-形成牢固的方式平行的 -片层结构， Leu 和 Val 的氨基质子和羧基之间氢键的形成稳定了其分子的构象 11。 GS 是同时具有极性和非极性表面的双亲结构 :两个极性的、带正电荷的 Orin 的 -(CH2)2-NH3+侧链和两个 D-Phe 的苯环突出在分子的一个面； 4 个 Leu 和Val 的疏水侧链 (-CH2-CH-(CH3)2和 -CH-(CH3)2)伸出于分子的另一面
10、，这种双亲结构对它的生物活性是非常必要的 12。许多研究还显示，在各种极性的有机溶剂、洗涤剂胶团和磷脂双层的环境中，甚至在一些能使蛋白质发生变性的高温条件下， GS 的构象都能够保持稳定，这同时说明它的这种双亲结构是非常稳定的。 图 2 GS 分子结构及三维空间构象模型 Fig.2 the molecular structure and the three dimensional model of GS 在用较低浓度的 GS 处理敏感菌株后，发现氮和磷等细胞内含物首先从细胞中释 放出来，其释放的量与药物的浓度呈正相关， 从 而推断 GS 可能与苯酚和一些表面活性剂具有相同的作用机理， 即是通过
11、与磷脂双层形成聚合物而破坏膜的结构，导致细胞内含物的释放而最终引起细胞的死亡 12-13。一些关于 GS 与人工脂质体、生物膜作用的生物物理学研究表明， GS能强烈地分配进入到液晶态脂双层膜中，其精细的作用位点位于脂质双层磷脂分子的极性基头的表面区域，并与之发生静电相互作用，可以认为，疏水和静电相互作用对此抗生素的活性有重要意义 14。 对于不同的磷脂膜可能有不同的作用机理，同时对于某一种特定的磷脂双层，肽 的浓度或者膜的状态都会对其相互作用产生影响，所以很难构建出一个详细的关于GS 与膜作用的模型 15。 1.3 多粘菌素 E(polymyxin E) 多粘菌 E 是由多 粘类芽孢杆菌 (P
12、aenibacillus polymyxa)产生的一种碱性多肽类抗生素，对革兰氏阴性杆菌有强烈的杀菌作用 16。它可以治疗由志 贺氏痢疾杆菌 (Shigella dysenteriae)、大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)、铜绿假单脆菌 (Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌属 (Salmonlla)和普 通变形杆菌 (Proteus vulgaris)引起的感染，并对霍乱弧菌、鼠疫杆菌等也有良好的作用 17。 由于多粘菌素 E 具有良好的抗菌活力和高效、低毒、残留少的特性，所以可以用于饲料添加剂，促进禽畜生长和提高饲料的利用率，并且可以防止饲料大规模生产中
13、产出现的由大肠埃希氏菌和沙门氏菌污染引起的疾病 18。 多粘菌素 E 能吸附在细胞的细胞壁上，与脂蛋白游离磷酸基结合，破坏膜的通透性，使细胞内主要成分特别是嘌呤、嘧啶等从细胞浆中流出，细菌生长发生抑制或引起细胞死亡19。 用多粘菌素抑制禽分支杆菌导出 Mg2+外流 实验更加证明了其独特的作用机制，与其它抗生素或抗药不会产生交叉耐药性，本类药间会产生交叉耐药性，但其耐药性不会通过 R因子传播，因此扩散蔓延速度较慢。由于 G-菌胞壁中含有较多量的磷脂，而 G+菌中的磷脂含量较低，因此对 G-菌的效果比 G+菌强 10 103 倍 20。其抗菌谱也仅限于 G-菌，对 G+菌不敏感。多粘菌素与 TMP
14、、庆大、红霉素、杆菌肽锌等合用，有协同及增效作用，弥补其抗菌谱的不足，降低多粘菌素的用量及毒性。与 (E)-2-hexenal 及吲哚合用，具有增效作用。与二价阴离子、季胺盐化合物、不饱和脂肪酸、碱性 药物、肌肉神经阻断药物等合用，会降低疗效或增大副作用。 1.4 乳链菌肽 (Nisin) Nisin 是 1 个有 34 个氨基酸组成的五环多肽 ， 其修饰氨基酸包括羊毛硫氨酸 (Ala-S-Ala)、 -甲基羊毛硫氨酸 (Ala-S-Abu)、硫氢丙氨酸 (Dha)和 -甲基脱氢丙氨酸 (Dhb)， 如图 3。 其分子由两个结构域组成： N-端结构域 (1 19 位残基 )，含有 A、 B、
15、C 3 个硫醚环； C-端结构域 (23 34 位残基 )，含有 D 和 E 两个相互缠绕的环及靠近 C-端的 6 个氨基酸残基。这两个结构域通过 1 个柔性铰链区 (20 22 位残基 )连 接并且都具有疏水面和亲水面的双亲结构。Nisin 的 C-端结构域 带有大量的正电荷，含有更多的亲水性氨基酸表现出亲水性，而其 N-端结构域 大部分是疏水基因 ，表现疏水性，可以与靶细胞的磷脂头端相互作用 21。 图 3 乳链菌肽 Z 的分子结构 Fig.3 Molecular Structure of Nisin Z 乳链菌肽可以广泛抑制多种革兰氏阳性菌，其作用的起始靶位点在敏感菌的细胞膜上，通过分散
16、质子动力形成不连续的孔道，从而去除细胞膜的基本能量来源。孔道形成使维持生命必须的离子梯度、质子动力耗散。质子动力的耗散 会终止一系列能量依赖反应，从而导致细胞死亡。 Nisin 可通过两种方式形成孔道，一种是 Nisin 在微摩尔级浓度下形成无靶目标介导孔道；另一种是 Nisin 在纳摩尔浓度下通过细菌细胞膜上的 lipid 的介导形成孔道，同时 Nisin 与 lipid 的结合抑制肽聚糖的生物合成 22。 1.5 枯草杆菌素 (Subtilin) 枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素有 表面活性素 (Surfactin)、 伊枯草菌素 (Iturin)和Fengycin A、 B 三大类，结构为
17、 -氨基或羟基脂肪酸 (10 多个碳 )与 7 个或 10 个氨基酸以酰胺键连 接的两部分，分子量从 900 到 1500 不等，脂肪烃及氨基酸种类、顺序随菌株、培养条件等改变而变化，从而引起活性特别是抗真菌活性的改变。它表现的抗真菌和一定 程度 的抗细菌活性，以及抗病毒、抗肿瘤、抗支原体活性 23。 枯草芽孢杆菌素对人体肠道中的 产毒性大肠埃希菌、侵袭性大肠埃希菌、致病性大肠埃希菌、鼠伤寒沙门菌和福氏志贺菌、宋内志贺菌 有较强的抑制作用 24。 Surfaction 表现出抗病毒、抗肿瘤和抗支原体活性，作用机理是破坏病毒的脂膜。 Iturin和 Fengycin 具有强抗真菌活性，机理是影响
18、真菌细胞膜的表 明张力，导致微孔的形成、 K+及其他重要离子的渗漏，最后引起细胞死亡。脂肽类化合物可用于防治水稻稻瘟病、水稻纹枯病、小麦白粉病、小麦赤霉病、辣椒炭疽病、辣椒病毒病、番茄早疫病、番茄青枯病、黄瓜灰霉病、黄瓜霜霉病等植物病害以及蚜虫等虫害 25。 2 酵母菌产生的抗菌多肽 酵母菌作为食品微生物用于发酵食品、饮料、肉的保藏，其机理是利用酵母菌的代谢物具有抑菌活性的特性，一般认为酵母菌的抑菌活性是通过代谢物乙醇、亚硫酸盐、乳酸等具有杀菌作用的小分子物质，肽类、 吡嗪 衍生物类及未知组成成分的抗菌素，杀菌素糖蛋白而产生的 。有关酵母产抗菌素的报道很少，但是仍然有人尝试从酵母中提取抗菌素，
19、内蒙古农业大学的李丽杰 26就尝试了在酸马牛奶酵母属中寻找到了 5 株 有抑菌活性并分析了抑菌物质，证明这种抑菌物质不属于标准六大类抗生素，是中性物质，并且是一种混合物，含有四种成分，推测其中三种是蛋白质，分子量分别在 16300、 22100 和 25900 左右 ，但是就其杀菌机理还不清楚 。也有报道 27自然界中存在这嗜杀酵母，在其生长繁殖过程中能向菌体上分泌一种毒蛋白，这种毒蛋白能杀死同族或亲缘酵母，但自身具有免疫力。 这种嗜杀酵母产生的毒素蛋白对敏感 菌株致死作用的机理是它能在敏感酵母细胞的细胞膜中形成离子通道，使 K+、 ATP 等物质外泄，促使蛋白质、核酸等大分子物质在细胞内的合
20、成停止，导致细胞死亡 28。 3 霉菌产生的抗菌多肽 1991 年， Sin-ya Kobaysi 等 29从少孢根霉 (Rhizopus oligosporus IFO8631)的培养液中提取到一种相对分子量约 5500 的肽类抗生素物质，它对枯草芽孢杆菌和革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)有较强的抑制作用。 1992 年，王昌禄等 30从中国小 甜酒药中分离出一株根霉 (Rhizopus chinesis NO12),该菌可产生具有抑制枯草芽孢杆菌的抗生物质， 对其它革兰氏阳性菌，如金黄色葡萄球菌 (S ta.aureus)、乳脂链球菌 (S tr
21、.crem oris)等也有抑制作用，并且 初步推断其为多肽物质。 有关霉菌产抗菌多肽的报道很少，从现在所有的文献来看就只查到这两株根霉具有产抗菌多肽的能力，而且这两株根霉都是从能食用的发酵物中分离得到的，所以对人体无毒害的作用，开发出这种抗菌多肽很有前景。 4 藻类产抗菌多肽 海洋资源是待开发的一个潜在的资 源地，在广阔的海洋中，分布着 3 万余种含有丰富生理活性物质的海藻，海藻生物活性物质已成为海洋科学研究的热点之一，由于海洋的特殊性，使海洋中存在这陆生植物所没有的特殊成分及药理成分。研究海藻抗菌活性化合物主要是脂类、脂肪酸、多糖及萜类等，而对于海藻多肽海藻蛋白提取物抗菌的研究很少。福建农
22、林大学的刘振宇等人 31报道测定 8 中海藻的硫酸铵分级盐析蛋白对其菌丝生长和分生孢子萌发的作用效果，发现 8 种海藻的不同蛋白组分对香蕉炭疽杆菌菌丝生长和分生孢子萌发的作用效果不同，其中蛋白质组分能抑制菌丝生长，有些能抑制其分生孢子 的萌发，使其萌发率降低，并对孢子萌发的芽管长度、着生位置、芽管数产生影响，所以海藻中的一些蛋白对香蕉炭疽杆菌具有抑制作用。 陈国强等人 32也报道检测了三种海藻粗蛋白对 6 种植物病原真菌菌丝生长及孢子萌发的抑制效果，结果表明 3 种海藻的粗蛋白对 6 种真菌的菌丝生长及孢子萌发的作用效果不同，其中冈村凹顶藻粗蛋白对红色链孢霉菌丝的生长，羊栖菜粗蛋白对稻温菌孢子
23、的抑制作用用最明显，而羊栖菜和铁钉菜粗蛋白对红色链孢霉的菌丝生长，冈村凹顶藻粗蛋白对绿色木霉及黄曲霉的孢子萌发均无抑制效果。 对于海藻蛋白的抗菌机理还不清楚，还需 要有更多的实验研究证明了解其作用机理。 5 结语及展望 抗菌多肽因其独特的抗菌机制在工业、农业畜牧业及医药等方面具有广泛的应用前景，因为这些很多产抗菌肽的微生物都是从发酵食品中分离出来的或者是对人体无害的甚至是有益的，所以这些抗菌多肽作为添加剂添加到医药、食品中是安全的比很多防腐剂有效，而且其用量也很少 ，而且微生物抗菌多肽不容易使生物产生耐药性。 对于抗菌多肽的研究还是需要进一步的深入，因为还有不少抗菌多肽的抗菌机理还不清楚，有待
24、于科学研究的深入。相对于动物和植物抗菌多肽而言，微生物抗菌多肽的研究还比较落后 。但是随着科学的发展，基因技术和细胞融合技术的成熟，必将为微生物抗菌多肽打开一个无限广阔的空间。 参考文献： 1 Marek Radyowski, Syawomir Bartkowiak, Krystyna Winiarczyk, Andrzej Kalinowski. Differential influence of bacitracin on plant proteolytic enzyme activities J. Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1722:1-5
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