1、血小板抗原及其抗体检测,尹国才珠海保亚美投资有限公司技术部TEL 010-84606082, 84605763,Gene-ProbeGTI Diagnostics,内 容,一、珠海保亚美投资有限公司业务简介二、血小板抗原三、血小板抗原抗体分析四、 GTI血小板检测产品的用途,一、珠海保亚美投资有限公司简介,主要专业产品 血液中心、输血科、血库及检验科等输血实验室设备与试剂。中国总代理 GTI Diagnostics： Gene-Probe GTI DiaMed（达亚美）：Bio-Rad（伯乐）,About GTI Diagnostics,GTI Diagnostics is an ISO-Ce
2、rtified in vitro diagnostics manufacturer located in Wisconsin(威斯康星州). GTI Name Changed into GTI Diagnostics(2006)Gen-Probe has acquired GTI Diagnostics for $53 Million in Cash, December 16, 2010, Named it as Gen-Probe GTI.GTI Focus on developing,manufacturing and marketing specialty products for th
3、e coagulation, transplant and blood bank laboratories. The goal is to develop unique diagnostic products to make it easier and faster for clinicians to have accurate diagnoses, blood typing and antibody identification.All the products are identified through FDA, USA.,GTI Products,Blood Bank Products
4、: Mace1 Mace2 PakPlusPakAutoPak12 Pak12G Pak2LE Pak1 GranType ThromboType Coagulation Products:PF4 Enhanced FVIII Antibody Screen,Transplantation Products:QuikScreenB-ScreenQuik-ID Class IQuik-ID Class IIMicroAMS (供者HLA与受者血清相配)HLA EZ Type HLA Typing Trays Complement Titration Trays HLA Control Sera
5、Empty Typing Trays Equipment / Software:EZ Type System WinQID Lot Files,Whole Blood,Red Blood Cells,white Blood Cells,Platelet-Rich Plasma,血液制品,Platelets,FreshFrozen Plasma,血小板？,血液中由巨核细胞产生的小细胞碎片。大小15um不等, 100300x109/L 。正常人每日消耗数百万Plt 。参与血栓、血块形成。,二、血小板抗原,血小板相关抗原:与其他细胞表面或组织共有的抗原 . - 白细胞抗原（HLA系统,HLA-I）.
6、 - 红细胞抗原（血型系统,ABH、Lewis、I及P ）.血小板特异性抗原 (HPA) :血小板特有的抗原决定簇,在血小板和巨核细胞上表达,属于双等位共显性遗传,表现血小板独特的遗传多态性,HPA多态性分布存在种族差异。 - 血小板表面膜糖蛋白Glycoprotein (GP). - 共鉴定出24个抗原，23个已被正式命名.,人类血小板同种异体抗原(Human Platelet Alloantigens, HPA),HPA：血小板特有抗原,与Plt功能密切相关。目前已检测出24个HPA抗原,除HPA-14bw基因是因核苷酸19091911位置上AAG缺失外,其他的HPA基因均为单核苷酸多态性
7、(single nucleotide polymorphism,SNP)。免疫性：SNP导致的单个氨基酸变化引起蛋白多肽的空间结构变化（多态性）,影响抗原表位,产生同种异体抗原，但并不改变分子功能,可诱发异体免疫；部分抗原是药物和病毒作用的靶子,进而诱发免疫应答；自身免疫产生的自身抗体。,主要HPA的载体蛋白与功能GPIIb/IIIa：是纤维蛋白原、纤维连接蛋白、玻连蛋白(vitronectin)，von Willebrand factor（假性血管性血友病因子,vWF）等分子的受体。GPIb/IX：是vWF 受体,参与粘附受损内皮细胞。GPIa/IIa ：参与粘附胶原蛋白。GPIV（ CD3
8、6 ）：是I & IV型胶原、氧化型LDL、长链脂肪酸、疟原虫感染RBC的受体。表达于单核细胞, 毛细血管内皮细胞,红细胞母细胞,脂肪细胞和血小板,Isoantigen Naka 1989。结合ECM，参与血小板粘附。HPA15(CD109):中国人多态性明显。表达于内皮细胞,激活的T细胞和血小板。参与细胞活化、增殖和信号传递。,HPAs与相关的糖蛋白GP,主要的多态性靶HPA：7个系统，HPA-16,15,Frequencies of HPA Polymorphisms,中国人HPA等位基因频率,Primo Roman, Transplant Immunology Volume 10; 20
9、02, Pages 165-181,European Bioinformatics Institute Database,CD36 (GP IV)抗原,Platelets: 亚洲人: 3-11% 北美: 2.5%非洲: 7.8%高加索人: 0.06%I 型: Absent from Platelets and Monocytes 输血或怀孕存在免疫应答风险II 型: Absent from Platelets only,HPA与相关疾病,HPA蛋白多肽表达缺陷致病： Glanzmans Thrombocytopenia（血小板无力症）：1918年由Glanzmann报道，故本病又称“Glanz
10、mann病”(GT)，是一种遗传性出血病，为 Platelet GP IIb/IIIa 和纤维蛋白原受体缺乏。 Bernard Soulier syndrome（伯-苏综合征，巨血小板综合征）：血小板GPIb/IX/V缺乏。,HPA抗体致病：免疫损伤Plt。 新生儿同种异体免疫性血小板减少症（ Neonatal Alloimmune Thrombocytopenia， NAITP） 血小板输注无效（ Platelet Transfusion Refractoriness ，RTP） 输血后紫癜（ Post-Transfusion Purpura，PTP） 自身免疫性血小板减少症（ Autoim
11、mune Thrombocytopenia， AITP） 肝素或药物诱导的血小板减少症（Heparin or Drug-Induced Thrombocytopenia HITP或 DITP) 移植排斥 ,血小板抗原同种免疫的反应机制,血小板糖蛋白被自身或同种异基因效应T细胞和B细胞所识别，产生相应的抗体，结合到相应的血小板抗原上。巨噬细胞表面的Fc受体与抗体分子的Fc片段结合后，在脾脏内血小板被巨噬细胞吞噬，引起血小板减少症。自身免疫的作用靶通常是非多态性的血小板GP和磷脂。同种免疫反应通常是由GPb/a，GPb/，GPa-a，GP和HLA-I类分子上的同种异体特异性抗原引起的，在临床上引发
12、NAITP，PTP，PTR。,新生儿同种免疫性血小板减少症,NAITP是因胎儿与母亲的血小板血型不合，而使母亲产生同种抗体，同种抗体通过胎盘进入胎儿体内，与胎儿的血小板特异性抗原发生反应，导致胎儿和新生儿血小板减少。基于胎儿和母亲之间不同的免疫基因，血小板抗体在怀孕期就产生了。通常这些抗体是抗HLA-类分子以及少数的抗HPA。在15%-30%怀孕的妇女中发现有HLA抗体，但因胎盘的免疫防御机制，而不造成严重情况。 调查显示，大多数NAITP是由HPA-1a抗体引起的；其次是HPA-5b，近来也有报道HPA-15不合也会导致NAITP。治疗措施主要是给患者输入抗体无反应性的血小板，或对患儿进行换
13、血治疗。预防方法主要是对母亲作血浆置换治疗。,NAITP Ethiology,血小板输注无效（PTR）,血小板输注无效是由于患者反复输注血小板而产生了血小板同种抗体，导致再次输入血小板时，发生免疫反应。主要是由未除尽白细胞和血小板HLA抗原以及少数HPA抗原引起的免疫应答反应，产生相应的抗体。产生免疫性抗体的病人中,50%-80%为 HLA抗体，同时，也有17%-25%的HPA抗体出现，其临床效应为缩短输注血小板的寿命。在日本人中HPA-2b是引起血小板输注无效的主要原因之一。 PTR以预防为主: 输注HPA同型Plt可预防产生HPA抗体；输注去白Plt可有效预防HLA抗体的产生，杜绝大部分的
14、PTR；对已经发生PTR的患者，可输注“配合”的浓缩血小板，临床疗效理想。,输血后紫癜（PTP）,输血后紫癜通常是在输全血或血小板后发生的，绝大多数为女性。在输血后的6-10天，血小板数量减少，严重者有内脏和颅内大出血。输血后紫癜主要由HPA-1a引起的（80%-90%）；其次，HPA-1b，HPA-3b，HPA-15也会引起。Taaning等发现，在血小板减少症阶段，特异性抗体（IgG和IgM ）攻击血小板GPb/a，GPb/，GPa/a，这些反应抗体是PTP中血小板破坏的原因。 治疗方法：血浆置换，同时输注配合的浓缩血小板，患者的血小板计数会回升。,Model of Pathogenesi
15、s in HITP,Visentin et al, in Heparin-Induced Thrombocytopenia; 4th ed. New York: Informa Healthcare, 2007,移植排斥,在骨髓移植及器官移植中，HPA抗原是引起相关排斥反应的原因之一。尽管供者与病人的HLA完全相配，仍有近25%的骨髓移植会发生移植物与宿主之间的排斥反应。这些现象是由次要组织相容性抗原（mHA）不合引起的。 HPA分布可能比预想的要广泛，故推测，在移植中，HPA抗原起次要组织相容性抗原的作用。Balduini等在70例临床HLA相配儿童的骨髓移植中，研究了HPA-1，-2，-3
16、和-5的相容性。结果提示：当受者接受HLA相配的供者骨髓时，HPA-3可作为mHA起作用。Kekomaki等对比研究了166对肾脏移植-受体的HPA-1，-2，-3，-5的相容性，结果表明：当HPA-5a/5a病人接受HPA-5b阳性供者的肾时，HPA-5b作为mHA在急性血管排斥反应中起作用。,三、血小板相关实验分析HPA和HLA分型 PLT抗体检测,HPA与HLA等位基因分型特异性血清分型,HPA抗体HLA抗体,1、HPA和HLA抗原基因分型技术,限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP）序列特异性寡核苷酸探针技术（
17、Sequence Specific Oligonucleotide ,SSO）序列特异引物PCR技术（PCR Sequence Specific Primer,PCR-SSP）,GTI 基因分型试剂盒,THROMBOTYPE,a primers,NegativeControlMaster Mix(1+ tubes),1a,2a,3a,4a,6a,15a,5a,empty,1a,2a,3a,4a,6a,15a,5a,empty,b primers,Master Mix (for 14+ PCRs) 2X PCR Reagent Taq polymerase Sample DNA Water (t
18、o volume),1b,2b,3b,4b,5b,6b,15b,empty,Distribute toPrimer-loadedPCR Tubes,1b,2b,3b,4b,5b,Platelet Antigen Genotyping: PCR-SSP,HPA-5b/b(Bra/a),HPA-5a/b(Bra/b),HPA-5a/a(Brb/b),2、HPA抗体检测技术,酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay ，ELISA）:MACE, PAKPLUS.固相红细胞粘附实验（Solid Phase Red Blood Cell Adherence As
19、say，SPRCA）或混合细胞粘附实验（MRCA）免疫荧光法：血小板免疫荧光试验（PIFT）、流式细胞仪分析法（F CA）和抗原包被珠子介导的Plt相关抗体检测法(Luminex screening assay),GTI Diagnostics PLT检测试剂盒,PLT抗体检测试剂盒,MACE I & MACE II： 交叉配型 规格：MACE 1：45个测试/盒； MACE 2：30个测试/盒。 ELISA 方法检测IgG 抗体: MACE 1 : GP IIb/IIIa and HLA-I。 MACE 2 : GP Ia/IIa、 Ib/IX、 IV。,MACE实验操作与原理,1 洗涤PL
20、T,制备50%PLT悬液.2 PLT与患者血清或血浆在管内发生反应,若有 相应抗体,则结合到PLT上形成复合分子.3 洗涤去掉其中未结合的Ig.4 裂解PLT,游离出抗原-抗体复合分子.5 加裂解液到相应的微孔内,孔壁上包被的抗体可 结合(抓获)其中的抗原或抗原-抗体复合分子.6 洗涤,去掉未结合的Ig.7 加酶标二抗(anti-Ig),结合到抗原-抗体复合分子上,形成一条反应链;病人血液中无相应的抗体,则反应链不成立.8 洗涤去掉未结合的二抗.9 加底物显色.10 终止反应,测OD值,判断结果.,ELISA for Platelet Antibody Detection,PAKPLUS 鉴定
21、针对特异表位的抗体：5份样品/盒。 ELISA方法检测针对特异表位的抗体(IgG,A,M):,PAK2-LE 筛查针对常见HPA抗原蛋白的抗体：11份样品/盒。 ELISA方法检测针对特异表位的IgG抗体: GP IIb/IIIa GP Ia/IIa GP Ib/IX HLA-I,固相红细胞粘附实验（SPRCA）,AHG致敏红细胞作为指示细胞Commercial Assay (Capture P) ; Rapid test。敏感性和特异性低。使用完整血小板作为抗原，不能分辨抗体类别主观性比较强，通过红细胞的凝集作为判断标准。试剂有效期短。,Capture-P,Capture-P,A speci
22、fic platelet binding agent is covalently bound to the wells by the manufacturer.孔内包被有血小板特异性结合试剂,Capture-P,Paternal platelets, donor platelets, or the patients platelets are added to the wells.孔内加入父母、供者或病人的PLT,Capture-P,The patients serum or antibody of known specificity is added to the wells.孔内加入病人血
23、清或已知的特异性抗体,Capture-P,Indicator cells consisting of red cells with attached rabbit anti-human are added.添加结合有兔抗人IgG的指示RBC,Capture-P,In the presence of anti-platelet antibodies, the red cells coat the well and a hazy pattern is seen.阳性反应结果,Capture-P,In the absence of anti-platelet antibodies, the red
24、cells form a button on the bottom of the well.阴性反应结果,FCA、Luminex and IFA,包被珠或Plt与血清孵育洗涤标记抗体与致敏珠子或Plt孵育洗涤荧光镜检或流式检测收集数据 Luminex100分析数据,靶抗原包被珠或血小板,Human Antibody From Sera,Anti-Human IgG Conjugate (PE),多态性血小板靶抗原藕联珠Luminex100/200法,检测Plt抗体的上市品种,GTI: PAK-PlusTM, PAK-AutoTM, PAK-LX, MACE-1TM, MACE-2TM, PF4
25、-Enhanced,IMMUCOR: Capture -PTM, Capture-P Ready Screen TM,STAGO: HITTM,DiaMed: ID-HAT HPA-1a Typing,Biotest: Thrombomatch HPA-1a Typing,3、 HLA 同种异体抗体,不同HLA 分子诱导抗体反应的能力不同同种异体免疫的发生和持续不可预测单一 HLA 分子诱导的抗体能与多种HLA反应(CREGs)有输血史、做过移植和怀过孕的人群，抗HLA-I的阳性率超过1/3.,HLA 抗体检测与鉴定方法,补体依赖直接CDCAHG放大的 CDC敏感性不理想仅能检测补体结合抗体,
26、固相ELISA（GTI）Flow PRA and specificity beadsLuminex liquid arrays敏感能检测补体结合和非结合抗体,HLA 抗筛方法,Flow ELISA AHG-Augmented CDC CDC,Relative Sensitivity,流式 PRA,32种珠子：每种包被 class I 或 class II抗原 分子。,Percent (Panel) Reactive AntibodiesAntibody reactivity measured against a panel of HLA-typed cells,What is a PRA?,Q
27、uikScreenB-ScreenQuik-ID Class IQuik-ID Class II,Luminex HLA 抗筛,Pooled,四、GTI血小板产品的应用,建立血小板基因分型库血小板输注前的交叉配型血小板抗体筛查与鉴定临床疾病的诊断,展望,研究血小板HPA同型输注；准确判定胎儿的HPA抗原，对新生儿进行筛查，以预防NAITP的发生；避免因HPA不合而产生移植排斥反应；研究建立已知HPA型供者库等，这些都将是今后研究的热点。 对HPA抗原的研究将有助于避免同种免疫造成的血小板输注无效发生，从而为血液的安全输注提供保障；而逐步建立HPA和HLA型已知型的血小板供者库，则有利于选择匹配型血小板输注，达到快速、有效的急救输血目的。,THANKS,
