1、 质粒载体 pBR322 浅探 02 生物技术： 林泽斌 023321042 翁桁游 023321053 林兴华 023321041 许镇群 023321020 摘要 ： 分子克隆载体广泛地应用于基因工程中，能将外源基因携带入宿主细胞，使其在宿主细胞中进行 DNA 扩增以及高效表达。pBR322 质粒载体是应用最广泛的一种分子克隆载体， 本文 比较科普地 对 pBR322 质粒载体 的结构特点、构建过程、主要应用及其改良 进行了 全面介绍， 最后提出我们通过这一段时间的学习后对 pBR322 的应用拓广的一些看法。 关 键词 ： 结构、构建、应用拓广 Summary: Molecular cl
2、oning vector, being widely used in gene engineering, is able to carry the exogenous gene into the host cell, in which it can amplify the DNA molecules and express them efficiently. The plasmid pBR322 is the one of cloning vectors that has been universally used up to now. This article will make an ov
3、erall introduction about the pBR322 on its structural features, building processes, main applications and improvements in a tone of the popular science. These will be followed by our own ideas about the more expansive applications of the pBR322 through the knowledge we have gained in the course of l
4、earning. Keywords: structure building 引言 ：基因工程所用的克隆载体常称之为分子克隆载体（ molecular cloning vector），它是一类可供外源 DNA 插入并携带重组 DNA 分子进入适当宿主细胞的 DNA 分子。如果打一个十分浅显的比喻，分子克隆载体犹如航天技术中的运载火箭，外源 DNA 分子就如火箭上搭载的卫星，宿主细胞则如外部深邃的空间。分子克隆载体的主要功能就是将外源基因携带入宿主细胞，并在宿主细胞中进行 DNA 扩增和使外源基因得以高效表达。在这一点上又与火箭不一样，因为火箭在运载卫星的过程中分级脱落和烧毁。分子克隆载体有多种，
5、如质粒载体、 噬菌体载体、柯斯载体等。本文仅就大肠杆菌质粒载体中的一种 pBR322 质粒载体进行阐述。 pBR322 质粒载体的结构 pBR322 质粒载体的基因组图谱如下： pBR322 质粒 DNA 分子的长度为 4363bp， 此载体中有两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（ Apr），另一个是四环素抗性基因（ Tetr）。 现在已知 pBR322DNA 分子共有 24 种核酸内切限制酶的单 一识别位点。其中 7 种限制酶 （从 12： 00 位置按顺时针方向） 即 EcoRV、 NheI、 BamHI、SphI、 SalI、 XmaIII 和 NruI 的识别 位 点位于四环素抗性
6、基因内部，另外有 2 种限制酶即 ClaI 和 HindIII 的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这 9 个限制位点上插入外源 DNA 都会导致 tetr 的失活。 3种限制酶即 ScaI、 PvuI和 PstI的识别位点位于 氨苄青霉素抗性基因 内，在这 些 位点插入外源 DNA 则会导致 ampr 基因的失活。 由 pBR322 质粒载体的结构可知其具有如下优点：（ 1）具有较小的分子量。经验表明，为了避免在 DNA 的纯化过程中发生链的 断裂 ，克隆载体的分子大小最好不要超过 10Kb。 pBR322 质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身 DNA 的纯化，而且可容纳较大的外源 DN
7、A 片段；（ 2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能 指示载体或 重组 DNA 分子是否进入宿主细胞 以及外源 DNA 分子是否插入载体分子形成了重组子 。 标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞 。 当我们把一个 DNA 片段插入到某一个标记基因内时，该基因就失去了相应的功能。当把这种重组 DNA 分子转到宿主细胞后，该基因原来赋予的表型也就消失了。要是仍保留了原来表型的转化细胞，细胞内含有的 DNA 分子一定不是重组子。很显然，既要指示外源 DNA是否进 入了宿主细胞，又要指示载体 DNA 分子中是否插入了外源 DNA片段，那么这种载体
8、必须至少具有两个标记基因 。另外， pBR322 质粒载体还 具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累10003000 个拷贝，这就为重组体 DNA 的制备提供了极大的方便。 pBR322 质粒载体 的构建 pBR322 质粒载体的构建过程可简单地概括如下： 1、 由于 pBR322 质粒的亲本之一是 pMB1 质粒，故 首先以 pMB1 为基础，引入 Rldrd19 质粒的 Tn3 易位子，得到 13.3kb 的 pMB3质粒； 2、 pMB3 的分子量显然使得它不适合作 为载体，所以要通过在 EcoRI 活性条件下的消化让它大部分的无用片段失去，留下来的小片段的 DNA的黏
9、性末端连接起来后就形成了 pMB8 质粒（ 2.6kb） ； 3、 此时，另外一种 pSC101 质粒在 EcoRI 活性条件下消化产生了含有tetr抗性的 DNA 片断，这个片断和 pMB8 整合在一起就形成了 pMB9质粒（ 5.3kb）。此时 pMB9 为 ampstetr表型 ； 4、 pMB9 已经初步具备载体的功能，为了让它更加完善，我们要 让 它具备 amprtetr性能，即在 pMB9 上引入 pSF2124 的 Tn3 易位子，但 Tn3可以来也可以走，为了留住它，我们切去了 Tn3 中表达转位酶的基因， 形成了 pBR313 质粒。 此后我们兵分两路：一路把 pBR313
10、的 PstI 位点除去，使之成为 ampstetr表型的 pBR318 质粒 ； 5、 ；另一路把 pBR313 的EcoRII 的位点切除，使之成为 amprtets 表形的pBR320 质粒。 由此我们的到了两种功能互补的质粒，这样我们只要将他们杂交就可以得到一种接近全能的载体质粒了，这就是 pBR322 。 pBR322 的应用 了解了 pBR322 的结构和它的构建过程之后，我们来看 pBR322 在基因工程中的应用。 pBR322 质粒 作为一种常用的基因克隆载体，在实际应用中有着非常重要的地位， 其中一个突出的例子就是应用 pBR322 作为克隆载体对水稻的叶绿体光诱导基因 psb
11、A 进行结构分析。 将水稻叶绿体的 DNA，用 EcoRI 核酸限制性内切酶消化之后，放入含有溴化乙锭的低熔点（ LMP）的 1%琼脂糖凝胶中作电泳分离。从 LMP中分离出分子大小为 1.8 2.5kb 之间的 DNA 片段，再与同样经过了EcoRI 核酸限制性内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理的pBR322 质粒连接。然后，将混合物转化到大肠杆菌 5346 菌株，培养在氨苄青霉素选择平板上，形成 Ampr 转化子菌落群体。这样就构成了由EcoRI 核酸限制性内切酶切割的水稻叶绿体 DNA 基因组库。用 Ampr转化子菌落与 32P 放射性标记的玉米 psbA DNA 探针作菌落杂交，可以
12、分离出其中的阳性克隆体。从这些阳性克隆体中分离出来的重组体质粒DNA，经过进一步的分析，就能测出水稻叶绿体基因 psbA 的序列。 利用 pBR322 作为载体重组人体的抑生长激素也是一个经常提到的应用例子。 其过程和水稻叶绿体基因重组大同小异， 只是除了在质粒载体上插入抑生长激素基因外，还将含有 lac 操纵子起始部分的片段（包括启动子、操纵区、核糖体结合位点和 半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生长激素基因的旁边。 由于有了 lac 操纵子的控制，重组基因产生的蛋白质的调节就变得比较容易了。 pBR322 的 改进 虽然 pBR322 具体很多作为质粒载体的优点，也曾经是最广泛使用的质粒之一，但
13、它还是有着自身的不足之处。 首先， pBR322 的 EcoRI 限制酶切位点克隆外源 DNA 时，不会发生所谓的“插入失活”现象。插入失活现象是检测形成重组质粒分子的一种常用而有效 的手段。由于 pBR322 的这一缺陷，不能用于 EcoRI 位点的克隆。针对这个缺陷，人们对 pBR322 进行了一些改良，构建了两种在选择记号上具有 EcoRI 限制性酶单一识别位点的 pBR322 的 派生质粒，即 pBR324 和 pBR325。 其次，从安全方面考虑， pBR322 质粒虽然失去了 mob（迁移蛋白质）基因，但是却仍然保留着这种蛋白质的作用位点，如果有第三种质粒例如 ColK 质粒的参与
14、， pBR322 质粒还是能够被迁移。这样就有可能发生克隆载体通过接合作用从一个细菌寄主转移到另一个细菌寄主。万一 这另一个寄主细菌从实验 室泄露出去，有害基因就有可能随质粒的转移而传播，造成不可估量的后果。 因此，现在已经构建了几种缺失了 bom 位点的 pBR322 的 派生质粒。而其中最值得一提的，就是从 pBR322 上移去了 HaeII 片段的 pAT153。由于缺失了 HaeII 片段， pAT153 的拷贝数比起 pBR322 增加了 1.53 倍。同时，由于包含在 HaeII 中的 bom 位点也随着 HaeII 缺失， pAT153 是不能被迁移的，从而提供了具备生物防护保障
15、的安全载体。 我们对 pBR322 的一些 想法 ： 1、 引入能表达出荧光物质的基因或者荧 火虫 的 发光 基因 ，作为pBR322 上的基因表达的示踪反应。 2、 引入嗜磁细菌的磁载体基因，这样含有我们需要的 pBR322 的细菌就可以被很快的识别并且分离出来。 3、 我们可以用 pBR322 引入一些基因，表达某种氨基酸合成酶的阻遏剂，从而建立起一个 对 某种特殊氨基酸 具有 依赖 性 的菌群，就如同这些细菌染了毒瘾 一样，离开该种氨基酸就会死亡，这样的细菌将在实验室里面大有作为。 我们可以毫无顾忌地用它们来做实验 而不用担心它们会从实验室逃逸出去 ，因为他们离开实验室之后就不能生存了 ，而在实验室里我们可以提供这种氨基酸给它们，让它们为我们服务， SARS 从实验室归来 的悲剧不会再出现了！ 主要参考资料： Prescott,Harley,Klein. MICROBIOLOGY. fifth edition. New York: McGraw-Hill Highter Education ， 2003 吴乃虎 . 基因工程原理 (上册 ) . 第二版 . 北京：科学出版社， 2000 杨金水 . 基因组学 . 北京 . 高等教育出版社 , 2002
