1、基金申请,第一部分 如何撰写申请书,一、摘 要（限400字）包括：研究方法、内容、目标、科学意义。,如：采用方法，进行研究， 阐明机制或揭示规律， 为奠定基础提供思路。,作用：画龙点睛效果：引发评议专家的兴趣，使其产生探个究竟的好奇心 “他到底是怎么做的 ？ ”,采用改良的消减杂交技术建立老年性白内障晶状体上皮细胞差异表达基因文库并制备基因芯片，利用此芯片筛选出白内障相关基因。通过基因转染在体和培养的晶状体上皮细胞，观察细胞的形态、增殖和凋亡、骨架蛋白及晶状体蛋白的变化，研究基因的功能。从晶状体上皮细胞的角度阐明老年性白内障发生的分子生物学机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。,二、立论依据
2、 对基础研究，着重结合国际科学发展趋势， 论述科学意义 对应用基础研究，着重结合学科前沿，围 绕国民经济和社会发展中的重要科技问题 论述应用前景,在立论依据的阐述中，对研究领域、研究方向、 具体科学问题的理解 研究领域：白内障的研究：包括发病机制、预防、诊断、 治疗措施等研究 研究方向：白内障发病机制的研究：包括环境因素、致病 靶点、细胞水平、分子水平研究等 科学问题：白内障发病过程中的相关基因研究：包括致病 基因筛选、功能研究、调控机制、信号转导等,在研究领域层面,从研究方向展开,围绕某一具体科学问题（本项目研究目标）进行归纳分析,提出研究设想,从研究领域切入,研究意义,国内外现状分析,1、
3、项目的研究意义 存在问题：对科学意义的阐述不足或夸大 撰写方法： 从领域入手，提出主要问题，引出热点研究方向。 围绕热点研究方向进行简要分析，找出目前尚未解决的具体科学问题，以此为切入点提出假设，阐述如果解决了该问题（研究目标），对该领域甚至相关领域的科学贡献（理论意义或应用前景）。,老年性白内障是与年龄相关的疾病，随着年龄的增 加，其发病比率也不断升高。特别是人类趋向老龄化， 白内障的患病人数还将持续增加。目前，它已是人类 第一位的致盲疾病。迄今为止, 治疗白内障唯一有效的 方法是手术摘除混浊的晶状体并植入人工晶状体。虽然 手术后患者可以恢复良好的视力，但是不可避免的术后 并发症以及手术设备
4、、材料耗资巨大，治疗白内障所花 费的资金已成为世界各国包括富裕的发达国家严重的医 疗负担。最近的调查表明，如果把老年性白内障的发病 时间延缓10年，白内障手术的数量就会减少45%1。 所以，一些学者认为通过预防白内障发生或延缓其发展 的途径征服白内障已成为一项全球性的社会和社会经济 问题2。,但是目前我们对老年性白内障发病机理的认识还不十分清楚。多年以来许多学者的研究结果证实晶状体上皮细胞在老年性白内障发生中起重要的作用，但对其中进一步的基因调控知之甚少。如果从参与老年性白内障晶状体上皮细胞变化的相关基因入手，研究基因的生物学功能，有可能抓住引起白内障发生、发展的主要环节。据此，本研究拟利用改
5、良的消减杂交技术和基因芯片技术准确、全面、快速的特点，以晶状体上皮细胞为研究对象，一次性筛选出老年性白内障全部有差异表达的基因，从中再筛选出与白内障相关基因，并着重对其功能进行研究，从基因水平阐明白内障的发病机制，为防治白内障提供新思路和理论依据。,2、国内外现状分析（与综述的区别） 存在问题： A、低水平重复：不了解最新进展，对国内外现 状缺乏真正了解，提出的问题别人已解决。 B、文献复习不全：检索文献方法不当、选择关键词 不妥，甚至人为缩小检索范围。 C、总结表达不够：对国内外现状缺乏归纳分析， 只是简单罗列，缺乏逻辑性和针对性。 D 、对方法原理理解不够：对研究方法不熟悉，简 单移植或夸
6、大其作用，缺乏实际应用的可行性。,撰写方法：要紧紧围绕本次申请项目的主题。 A、从领域切入，简要论述国内外研究成果，并引 出当前的热点研究方向。(注意与意义呼应) B、从研究方向展开，较详细地分析国内外的研究 进展，阐明在该方向上存在的问题。 C、围绕存在的问题，结合国内外以往的研究结果、 当前的现状及今后的发展趋势，详细论述和分 析这些问题产生的原因，提出该方面的空白点、 未知数、以及研究的难点、焦点，从而为自己 申请项目确立研究目标奠定充分的立论基础。,D、对拟采用的技术方法进行介绍和分析。 成熟的方法重点介绍可以应用于本研究的理论依据和实验依据。 新方法在详细介绍其原理的基础上，阐明可以
7、应用于本研究的理论依据和实验依据。 需特别注意的问题：必须对所运用的技术方法的原理、流程尤其是在实际运用中可能出现的问题要十分清楚，绝不能是一种简单的移植。 例如：抗体 + 功能基团，理论上可以实现融合，但存在“活性、表达载体选择、纯化等问题。 E、提出本项目的研究设想。,防治白内障必须针对其发病的主要环节。多年以来，国内外学者从不同的角度探讨白内障的发生机理。就致病的环境因素讲，氧化因子、紫外线辐射、晶状体周围环境中离子浓度改变及一些生长因子、细胞因子的改变均与老年性白内障的发生有关。就研究的部位分，晶状体中皮质与核的蛋白质改变及晶状体纤维的改变与白内障的形成有关，而位于晶状体前囊膜下单层的
8、晶状体上皮细胞在白内障的形成中的变化更引人关注。,因为晶状体上皮细胞是晶状体中唯一有分裂活性、数量相对稳定的细胞，它们分裂、分化出晶状体纤维细胞、产生晶体蛋白，终生不停息，形成了晶状体均一、对称的结构，对维持晶状体的透明起重要作用。不仅如此，晶状体上皮细胞还是晶状体中受外来刺激影响较早的部位，已有研究证实老年性白内障的晶状体上皮细胞还发生退行性变、细胞膜通透性增加、细胞内酶活性改变、细胞数量减少、凋亡细胞增多等改变，与单纯老化的晶状体之间存在差异3-5 。,体外实验也证实多种因素(H2O2、UV-B、晶状体蛋白的自身抗体)诱发的白内障模型中晶状体上皮的损伤是晶状体混浊的主要环节6-8。因此，从
9、晶状体上皮细胞的变化入手探讨白内障的成因，有可能抓住揭示白内障发病机理的主要环节。而晶状体上皮细胞变化的基因调控机制是问题的关键所在，也是有待我们深入研究的问题。,白内障的形成与晶状体的老化密不可分，是晶状体老化的极端表现。晶状体的老化是多种因素相互作用的结果，包括基因的和非基因的随机变化的不断积累，也有程序性的、非随机性的组织特异性多种基因表达的改变。目前，国内外对白内障相关基因的研究主要以下三方面：,一是对体外培养的晶状体白内障模型及上皮细胞的研究。UV-B辐射作用诱导的白内障中晶状体上皮细胞是主要的靶细胞，其Na-K-ATP酶的活性增加，蛋白质的合成和分泌增加；上皮细胞的凋亡增加，其中有
10、c-fos基因的表达增加；还有组蛋白H4、H3 的低表达和蛋白酶C、-肌动蛋白、-肌动蛋白基因的高表达9-12。Carper等13利用RT-PCR-DD(reverse transcription-polymerase chain reaction differential display)技术研究H2O2诱导的晶体上皮细胞的基因差异性表达结果显示NADH脱氢酶4亚基、细胞色素b、谷氨酰胺转移酶基因表达减少以及细胞因子的核蛋白、替代拼接因子2 （alternative splicing factor）、-三羟基异丁酰辅酶A水解酶基因表达的增加。,二是利用转基因动物的研究。波形纤维蛋白基因（vi
11、mentin）、杂交的型中间纤维蛋白基因的转基因小鼠表现出白内障，而且有随小鼠年龄增加白内障加重的趋势。晶状体改变的共同特点是晶状体纤维细胞分化受抑制14,15。Gong等16报告晶状体的细胞膜蛋白连接蛋白3（3 Connexin）基因敲除小鼠（knockout mouse）在晶状体形成的早期及纤维细胞分化早期不受影响，其后出现与晶状体蛋白溶解有关的核性白内障。 虽然体外实验和白内障转基因小鼠都提示我们一些基因的变化与白内障有关，但是，这些变化的基因是否与老年性白内障形成有关，目前尚缺乏进一步的报告。,三是对人老年性白内障晶体上皮的研究。Lee17利用RT-PCR技术研究显示前极性白内障与核性
12、白内障上皮细胞中纤维连接蛋白、I型胶原纤维、-平滑肌蛋白、TGF-1、TGF-2、TGF-型受体、结缔组织生长因子的基因表达有差异。Kantorow等18利用RT-PCR-DD研究老年性白内障与正常晶状体上皮的基因差异性表达的初步结果是老年性白内障有三个高表达基因和12个低表达的基因。但就DD-PCR技术来讲，在实验中难以解决假阴性、假阳性以及克隆全长cDNA的问题。,上述三方面的研究均取得了不同程度的研究结果，但由于当时技术条件的限制都未能全面阐明与白内障相关的基因及其功能。 寻找白内障时晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因有可能揭示白内障的发病机理。,寻找差异表达基因的经典方
13、法是消减杂交技术（subtractive hybridization, SH），它是，但是实验操作复杂。 经过改进后的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization ,SSH是Diatchenko等1996年建立的方法）简化了实验操作，但仍然问题很多。 我校生化教研室建立了改良消减杂交技术19，20，其特点是：简便易行，能够获得目的细胞特异表达的全长基因，对低丰度基因也能有效分离。,该方法的建立者已利用这一技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5个为新基因。同理，利用此方法也能快速、有效地获得白内障晶
14、状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，并克隆到全长cDNA，为进一步的结构和功能研究打下基础。,基因芯片技术的出现，使检测差异表达基因和未知DNA分子变得更快捷、准确、高效。基因芯片是在1996年被提出并开始研制的，该技术是将成千上万的DNA探针集中到1厘米见方的基片上，利用碱基互补原理，DNA探针中的已知碱基序列与被测定的未知DNA分子杂交后由标记分子标记杂交体，经自动阅读设备分析杂交结果，从而对检测基因进行定性、定量和结构分析，确定未知DNA分子。,由于目前尚没有针对白内障研究的现成基因芯片，根据本研究的需要，我们将筛选到的差异表达的所有基因建立cDNA文库，再利用基因芯片技术
15、制备成基因芯片，以此检测多个样本中白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮细胞间差异表达的基因，从中进一步筛选出白内障特异的基因，它们中可能有已知基因，也可能有未知基因。通过以上两种技术的有机结合，我们能更快捷、有效、准确地得到白内障相关基因。,综上所述，分子生物学技术的发展为研究白内障发生过程中的功能基因及特异调控基因提供了有利武器。本项目从晶状体上皮细胞入手，利用改良的消减杂交技术和基因芯片技术系统研究与白内障相关的基因，并采用对体外培养细胞和在体晶状体上皮细胞的基因转染，探讨它们在晶状体上皮细胞变化和白内障形成中的作用，可望阐明白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，为防治白内障提供新的思
16、路和理论依据。,3、参考文献 A、文献类别要全：以英文文献为主，同时也要引用 中文文献- 国内同行中知名专家的文献。 B、引文信息要全：文章题目、作者姓名、具体出处 （包括期刊名、年份、卷期、页码等）。 C、文献年代要新：主要是近五年的文献，最好能有 07年的最新文献。,三、研究方案,1、研究目标 撰写要求： 有限目标，与研究内容相呼应,如：明确关系，揭示规律， 阐明原理（机制），建立方法等,举例：筛选出与老年性白内障相关的基因，明确部分基因在白内障形成中的作用，从晶状体上皮变化的角度阐明白内障的发生机理，为防治白内障提供线索。,2、研究内容： 存在问题：内容过多，一个研究周期难以完成 内容分
17、散，不能集中阐明研究目标 撰写要求：内容要适当确保研究周期内完成 为目标服务与目标相辅相成 要重点阐述注意与技术路线区别,举例： （1）筛选白内障相关基因：采用改良的消减杂交技术，获得人老年性白内障晶状体上皮细胞和正常晶状体上皮细胞差异表达的基因片段，建立cDNA文库。制备差异表达基因的基因芯片，利用基因芯片技术从多个标本的老年性白内障晶状体上皮细胞中筛选出白内障相关基因。,（2）研究白内障相关基因的结构： （3）研究白内障相关基因在晶状体上皮细胞变化中的作用： 观察指标如下： 存活细胞数；光镜、透射电镜下细胞形态的变化；细胞凋亡检测：用原位末端标记和连接酶介导PCR方法，从形态和DNA水平分
18、析细胞凋亡；细胞增殖的检测：；细胞骨架蛋白的检测：；晶状体蛋白的检测：,3、拟解决的关键问题： 存在问题：抓不住关键问题或抓得不准。 什么是关键问题 ？ -研究过程中对达预期目标有重要影响的某些研究 内容或因素。 -为达预期目标所必须掌握的关键技术或研究手段。 撰写要求：找出关键问题，提出解决办法。,举例： （1）建立差异表达的cDNA文库： 建立差异cDNA文库是筛选老年性白内障相关基因的前提。为使差异cDNA文库具有代表性，我们采取以下解决方案： 选择各种类型老年性白内障晶状体的前囊膜、取足够大量的标本（拟取50例标本）作为建库的mRNA的来源。 利用改良的消减杂交技术可快速、有效地获得差
19、异表达的完整cDNA片段。此技术是本课题组成员主要的研究成果，在应用此项技术中已积累了较丰富的实验经验。,（2）制备基因芯片： 制备用于本研究的芯片是筛选老年性白内障相关基因的关键环节。制备基因芯片的关键是在 1平方厘米的基片上放上成百上千的不同基因探针而不使它们发生任何混淆。在制作基因芯片时做到：严格按操作程序进行；在标本的处理及RNA提取时避免污染，否则即会造成严重的损失。只要严格按操作程序进行操作就可以避免发生差错。,（3）在体基因转染： 在体基因转染是进行白内障相关基因功能研究的关键。在体的晶状体上皮细胞大部分处在静息状态，只有位于赤道前区的少量细胞具有分裂活性，而且晶状体表面有一层胶
20、原性质的囊膜包裹。在体晶状体的基因转染的关键是如何使大量分裂后细胞转染，如何使病毒穿过晶状体的囊膜，针对以上问题我们拟采取下列方法解决：选用反转录病毒的慢病毒载体（ lentiviral vector ），它克服了一般反转录病毒只能转染有分裂能力细胞的局限性，对分裂后细胞也能有效的转染。这对在体晶状体的基因转染有很大的优越性。采用直径1-2m玻璃微管在显微镜下将病毒载体注入晶状体的前囊膜下，既不破坏晶状体的完整性，又可使病毒接触到囊膜下的上皮细胞。,4、研究方法 存在问题： 过于简单：在方案中只有方法名称而无具体步骤。 过于繁杂：大量罗列一些常规的实验方法。 撰写要求：以研究项目的需求为前提，
21、尽量采用最适合的方法和手段，并将其操作步骤和关键环节体现在技术路线当中。,5、技术路线 存在问题： 不清楚，不详细，不可行。 撰写要求： 清晰、详细、注意逻辑性。 撰写方法： 以时间顺序为主线设计技术路线 以研究内容为主线设计技术路线 分大小标题，突出逻辑关系。 详细地写清楚每个具体步骤。,（1）人晶状体上皮细胞的获得：老年性白内障晶状体上皮细胞取自白内障患者手术中取出的前囊膜（晶状体上皮细胞紧贴于前囊膜），直径约5mm。正常晶状体上皮细胞取自角膜移植供体眼的晶状体，在显微镜下撕下前囊膜，直径约8mm。按文献提供的方法去除晶状体纤维细胞，仔细清洗以去除血细胞污染。 （2）建立差异cDNA文库：
22、从50例白内障手术患者的前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为实验组，从25例正常晶状体前囊膜上取下的晶状体上皮细胞作为对照组，利用改良的消减杂交技术19，20，获得差异表达的cDNA，并建立文库。主要的实验流程如下：,正常晶状体上皮细胞 白内障晶状体上皮细胞 Promega PolyATtract System 1000 mRNA分离 mRNA分离oligo-dT18反转录 ntech Cap-finder方法反转录 cDNA Biotin-21-dUTP pending-cDNA 随机引物PCR 杂交 Sephacryl S-400柱,除盐及小片段 链亲和素-生物素磁性分离 除去杂交体及过量正常
23、晶状体上皮细胞cDNA “长距离”PCR 目的cDNA的特异扩增 克隆、鉴定、转化 建立差异基因文库,（3）制备基因芯片筛选白内障相关基因： 基因芯片的制备： 白内障相关基因的筛选： （4）白内障相关基因的结构分析： 序列测定：. . 序列的计算机分析： . . 获得全长基因： . . （5）基因转染： 培养人晶状体上皮细胞的转染： 在体晶状体的转染：,6、可行性分析 对实验方案设计的分析 理论分析 研究手段方法分析 预实验结果分析 对相关条件的分析 所用特殊实验材料（试剂）的分析 对所具备的实验条件进行分析 对项目组成员搭配及其运用技术方法的能力分析,(1)关于建立差异cDNA文库： 老年性
24、白内障晶状体上皮细胞与正常晶状体上皮 细胞是处在不同状态下的细胞，细胞基因表达的改变 是细胞蛋白功能等改变的基础。寻找这些有差异的基 因是探索细胞功能、状态变化原因的突破口。利用的 消减杂交技术是筛选差异表达基因的有效方法。改良 的消减杂交技术是我们研究组成员建立的方法，应用 此方法已经从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表 达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其 中 5个为新基因，这一研究成果进一步证实了该方法 的可操作性，而且我们在运用此方法过程中也积累了 较丰富的经验，因此，本研究利用这一方法从两种状 态的晶状体上皮细胞中筛选差异表达的基因并建立 cDNA文库是可行的。,7、创新性
25、 存在问题： 对创新点提炼不够 把运用新技术、新方法理解为创新 与研究目标、研究内容相混淆 对创新的理解： 原始创新：填补空白或修改传统的理论 发明创造新技术、新方法 跟踪创新：补充、完善现有理论 修改、完善现有技术方法（112） 提炼方法：用逆向思维方法提炼创新点,（1）基因筛选方法上的创新： 首次采用改良的消减杂交技术建立白内障晶状体上皮细胞差异表达基因文库，并制备相应的基因芯片，利用此基因芯片筛选出老年性白内障相关基因。上述两种方法的有机结合使我们能快速、准确、定性、定量地获得多个白内障相关基因。通过分析这些基因的结构、研究它们的功能，揭示老年性白内障晶状体上皮细胞变化的分子生物学机制，
26、为防治白内障提供新的思路。 （2）基因功能研究上的创新：.,8、年度研究计划及预期研究结果 年度研究计划： 按年度列出研究内容及其阶段目标 拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划 预期研究结果： 理论成果：建立/丰富/补充/填补 . 技术方法：建立/完善 . 专 利：可望获得 论 文：国际、国内 人才培养：青年科技骨干、博硕研究生,四、研究基础 1、研究工作积累 存在问题： 内容过简； 与申请项目无关。 撰写要求： 介绍与申请项目直接相关的预实验研究结果； 提供相关的研究论文、成果及专利等材料； 以往应用与申请项目有关的技术方法的经历； 工作积累也要包括项目组成员的所有信息。,（1）有关
27、消减杂交技术和基因芯片技术的工作基础: 本研究所用的基因筛选技术主要是改良的消减杂交技术，此技术是我们研究组成员主要参与建立的，并利用此技术从脂多糖刺激前后的人牙髓细胞的差异表达的基因中克隆到脂多糖刺激后特异表达的基因，其中5个为新基因，有关此技术的研究论文有：. （2）有关基因转染方面的研究工作基础：. （3）有关老年性白内障相关基因的研究基础：.,2、工作条件 实验室整体实力和规模（地位、课题、成果等） 实验室所具备的与申请项目相关的主要仪器设备 实验室所在单位具备的申请项目所需的实验条件 3、项目组人员简历 所有人员均需介绍（重点是项目负责人） 介绍内容根据在项目中的分工有所侧重 列出与
28、申请项目相关的研究论文及成果,第二部分撰写申请书时常见问题解析,1、对立论依据、实验方案、研究基础应阐述的内容 以及三者关系的理解 立论依据：阐述背景和理由，回答“为什么” 实验方案：是申请书的核心，回答“怎么做” 研究基础：展示积累和实力，回答“做了啥”,一、对部分撰写内容及其相互关系的理解,2、对研究目标的确定 国内外现状分析中提出的具体科学问题就是项目的研究目标。 研究目标具体到什么程度，要根据研究周期、资助强度来确定。,3、研究目标、研究内容、研究方法的关系 依据目标确定研究内容 根据内容选择研究方法,4、研究内容与技术路线的区别 研究内容：根据总体目标分若干分题，重点回答 做什么观察
29、指标、阶段目标 技术路线：重点回答怎么做在具体步骤中体现 研究内容和研究方法,5、对拟解决的关键问题与可行性分析撰写时的区别 二者相同之处：拟解决的关键问题在可行性分析时也要提及 二者不同之处： 撰写拟解决关键问题，重点回答如何解决。 解决办法包括：通过研究思路的设计巧妙 运用最新出现的研究方法 通过不同方法各自优点的有机结合 在进行可行性分析时，重点回答能够解决。 分析问题角度：通过对现有理论分析提供理论依据 通过对预研结果分析提供实验依据 通过对他人研究成果描述提供佐证,6、创新点、研究目标和预期研究结果的区别 三者的共同点：都包含一个“新”字。 三者的不同点：概念的外延不同。 创 新 点： 形态学证实在脑下垂体中确有神经纤维存在 进一步实验证实是肽能神经 研究目标：通过各种形态学研究充分证明在脑下垂体中确 有肽能神经支配 预期研究结果：提出脑下垂体肽能神经和体液双重调节 假说，对原有理论提出挑战。,二、尚需注意的几个问题 1、在项目设计过程中要树立整体观念，要 讲述一个完整的故事。 2、文字表达要精雕细琢，每一句话说明什么 要做到心中有数。 3、文献回顾不能回避国内外最新研究进展， 尤其是不同学派的观点。 4、重点内容、观点要用黑体强调。,谢 谢！,
