1、本科毕业论文系列开题报告生物技术虎皮鱼PUNTIUSTETRAZONA暴发性死亡超微病理学研究一、选题的背景与意义虎皮鱼（PUNTIUSTETRAZONA）属鲤科，又名四间鱼、四间鲫鱼。原产地马来西亚，印尼苏门答腊岛、加里曼丹岛等内陆水域。它是一种饲养较普遍的鱼种。鱼长57厘米，呈纺锤形。身体匀称，色彩鲜艳，以金黄色做底色，头部、腹部、尾部前端贯有四条竖向黑条纹，随光线角度不同会闪现出金属般的光芒。成鱼的背鳍、胸鳍、腹鳍及尾部的边缘都呈现出亮丽的红色，很有观赏价值。近年来随着人们生活水平的提高，观赏鱼类越来越多的进入人们的日常生活和视线中。虎皮鱼是较重要的观赏鱼类，它美丽的外表和婀娜的形体给人
2、们带来赏心悦目的感觉与心情。虎皮鱼并不原产与中国，所以自它从马来西亚，印尼苏门答腊岛、加里曼丹岛等内陆水域被引进的那一刻起，不利的环境与条件无时无刻不在威胁着它的生存。随着养殖规模的扩大，养殖技术的不完善，病害侵袭的突发性和不确定性，许多地区及专业户遭受了沉重的打击。饲养用水的水温、酸碱度、化学成分、有害物质和溶氧量等常会发生变化。如果这些因素的变化超出了鱼体所能忍受的范围,则虎皮鱼就会发病,甚至死亡。如水太浑浊,溶氧量不足,鱼类就会出现缺氧的浮头现象,时间一长,会因严重缺氧而窒息死亡。有的因光线不足,也会引起鱼体新陈代谢紊乱,体色异常,体表粘液增多,为真菌、寄生虫的粘附寄生提供条件,久而久之
3、就会很容易发生各种病症。生物因素是引起虎皮鱼发病的主要因素，其病原体是各种微生物和寄生虫,它们体积小,肉眼看不见,需借助光学显微镜或电子显微镜放大几百倍或几万倍时才能看见。这些病原体大多数是单细胞生物,构造简单,种类繁多,繁殖速度快。它们引起的鱼病称为传染性病，这是观赏鱼疾病中最常见的。所以，要开发虎皮鱼的观赏价值，正确的养殖、合理的治疗和预防各类病害成为讨论的焦点，而对其病理的分析是这些工作的理论基础。本实验拟对暴发性死亡的虎皮鱼的超微病理学进行研究分别取健康与患病的虎皮鱼或暴发性死亡的虎皮鱼的各组织固定后，经超薄切片于电镜下观察，运用超微病理学的知识，对患病的虎皮鱼切片组织进行分析与研究，
4、并与正常个体进行比较，探讨引起虎皮鱼暴发性死亡的可能原因，查找文献，提出患病原因的几种可能，结合观察到的超微切片及超微病理学的理论内容，从超微病理学水平深入探讨虎皮鱼发病及死亡机制，为将来更深入的研究虎皮鱼的饲养与繁殖奠定坚实的基础，并且，此类研究也可以对虎皮鱼养殖者提供理论指导，具有重要意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1、健康及暴发性死亡或发病虎皮鱼组织的固定及超薄切片的制作2、超薄切片的电镜观察与拍照3、对病理的切片进行分析拟解决的主要问题1、熟悉主要观赏鱼发病原因及对应病症表现2、了解虎皮鱼生活习性及小量养殖技术3、掌握超微病理学理论知识并掌握超薄切片的制作流程4、掌握
5、并会分析所拍到的超微组织照片5、运用超微病理的知识，结合超微组织照片具体分析虎皮鱼的主要组织超微病理变化，探讨其死亡原因。6、思考如何预防关于虎皮鱼的病害三、研究的方法与技术路线研究方法1、取样取暴发性死亡的虎皮鱼，进行解剖，取组织器官用25的戊二醛PBS固定液固定。2、制作切片制作电镜超薄切片3、观察与拍照利用透射电镜对切片进行观察并拍照。4、分析结果运用超微病理学知识对超微病理图片进行分析，探讨细胞水平的致病机理。技术路线四、研究的总体安排与进度201011201012查阅资料，撰写开题报告和综述201101201102仪器、药品的准备和各种实验材料的准备201103201104虎皮鱼电镜
6、超薄切片标本的制备虎皮鱼超薄切片电镜观察及拍照整理实验结果，挑选图片并分析图片201004201106外文翻译和论文的撰写五、主要参考文献1李融译观赏鱼养殖宝典M北京中国农业出版社,20032李亚彪观赏鱼产业发展五特点J农家参谋,2007,083王玉堂观赏渔业的发展概况J中国水产,2006,60115174郑宝大,李俊杰，姜景田观赏鱼的疾病防治J齐鲁渔业，2008，25（06）545王广军观赏鱼的一般饲养管理技术J北京水产,2000,120618216叶建生观赏鱼常见疾病的发病因素及其预防J河北渔业,2006,161048497张爱良观赏鱼及其养殖中应注意的问题J特种经济动植物,2003,15
7、0718198史成银,王印庚人菱鲜病毒性疾病研究进展J高技术通讯,2003,1809991049孔杰PCR技术在对虾病原检测中的应用J生物工程进样品采集样品解剖样品固定超微病理图片分析超薄切片的制备观察与拍照展,1994,1406434610李向勇,李娟观赏鱼类疾病及其诊断方法J河北渔业，2007，1111HEJG,WENGSP,ZENGK,ETALEXPERIMENTALTRANSMISSIONPATHOGENICITYANDPHYSICALCHEMICALPROPERTIESOFINFECTIONSSPLEENANDKIDNEYNECROSISVIRUSISKNVJJFISHDISEASE
8、S,2002,231412井上洁,池谷文夫,前野幸男等养殖真鲷的虹彩病毒感染症J鱼病研究日本,1992,27192713陈在贤,郑坚川,江育林从患红脖子病甲鱼体分离到虹彩病毒J中国兽医学报,1998,18213513914廖志强福建省主要海水养殖鱼类疾病及其防治J福建水产,2003,1404303415葛慕湘,杨培培,张文香等嗜水气单胞菌对鲤鱼血液指标的影响J河北渔业,2006181016王琳娜嗜水气单胞菌感染导致群体性腹泻的病原学分析J中国卫生检验杂志,2007,17592192217CARLOSR16SRRNAGENESEQUENCEANALYSISOFPHOTOBACTERIUMDAMS
9、ELAEANDMETHEDPCRMETHODFORNESTEDPCRMETHODFORRAPIDDETECTIONOFTHECAUSATIVEANENTOFFISHPASTERUELLOSISJAPPLENVIRONMICROBIOL,1999,65072942294618王雪鹏分子生物学技术在水产动物疾病诊断中的研究进展J水利渔业,2004,24034619LARGODBIMMUNOFLUORESCENTDETECTIONOFICEICEDISEASEPROMOTINGBACTERIALSTRAINVIBRIOSPPIIOFTHEFARMEDMACROALGA,KAPPAPHYCUSALVA
10、REZIIGINARTINALPS,RHODOPHYTAJMARBACTERIAL,2000,182123405341520张玲,丁雷,岳永生生物技术在鱼类种质资源研究中的应用J水利渔业,1999,1906252621SANOTIMMUOPCRVERYSENSITIVEANTINENDETECTIONBYMEANSOFSPECIFICANTIBODYDNACONJUGATESJSCIENCE,1992,258507912012222GRIZZLEJM,ALTINOKI,NOYESADPCRMETHODFORDETECTIONOFLARGEMOUTHBASSVIRUSJDISAQUATORGAN
11、,2003,541293323陈新华,王小文,吴文忠一种简便、快速从病毒感染鱼、虾组织中制备PCR模板的方法J中国生物工程杂志,2003,2386668毕业论文文献综述生物技术观赏鱼常见病害病因及症状研究摘要随着人们生活水平的提高,观赏鱼产业发展很迅猛,走进了千家万户。观赏鱼的体色艳丽,体态婀娜,习性有趣。人们饲养观赏鱼,既可作为消遣,又可作为装饰品来点缀、观赏,寄乐趣于其中,用其美化环境,深受人们喜爱1。但是观赏鱼在饲养过程中,难免会患上各种疾病,引起观赏鱼得病的原因很多。本文主要讨论了观赏鱼饲养过程中常见疾病及其常见疾病和发病因素以及展望。关键词观赏鱼常见疾病发病因素检测观赏鱼产业是以观赏
12、性水生动植物生产为基础，集观赏鱼养殖、观赏鱼饲料、水族器材、观赏鱼销售、观赏鱼文化等要素为一体的新兴产业。它除了观赏鱼养殖业内部高度关联的种苗、饲料及渔药等产业外，还与水族器材、娱乐竞技、文化鉴赏、休闲养身等外部产业密切相关2。广泛的产业关联性，使之较传统的水产养殖业辐射面更广。我国有着悠久的养殖观赏鱼的历史3,是世界闻名的鱼之乡。在养殖规模不断扩大的同时,由于操作不善、自然因素等原因,观赏鱼的病害时有发生,对观赏鱼类养殖业造成了极大的经济损失,制约了观赏鱼类养殖业的发展。对观赏鱼类疾病病原的研究,为此类疾病的防治提供了理论依据。而在疾病的防治工作中,防大于治。因此,急需建立一系列快速有效的观
13、赏鱼疾病诊断方法,以及时的察觉病原,从而防止大规模疾病的发生。故需从观赏鱼的常见病害入手，分析掌握发病原因和常见疾病。1发病因素观赏鱼的发病原因很多，有的是购鱼时所带菌所致，有的是长途运输或机械损伤所致4，少数是因饲养不当引起的，而最多的则是因病毒、细菌、寄生虫感染所致。每年春秋两季，是观赏鱼的2个易发病的季节，这是自然环境引起的，人力难以抗拒。其中温度就是一个重要的影响因素，如金鱼最佳适温范围为22255。如果疾病诱因判断不准确，找不出根源所在，用药治理不当，都会引起观赏鱼大批死亡，造成直接的经济损失。观赏鱼是否发病6,与其自身的健康状况和抗病能力密切相关。鱼体体质强壮,机体对疾病的防御能力
14、较强不易得病。若鱼体质不佳,营养不良或瘦弱,鱼体受外伤或有其他寄生虫、慢性病的感染等,因自身抵抗力较弱,就会出现程度不同的不适。2观赏鱼常见疾病观赏鱼疾病通常分为两大类一类为生物性病原体疾病,由细菌、病毒等引起的传染病和由寄生虫引起的寄生虫病,它的特点大多是发病急,传播快,发病率和死亡率较高,不易防治；另一类是非生物性疾病,其致病原因是水质的理化性质的改变引起饲养用水变质,诱发鱼体生理机能失调,使鱼体出现不适,出现代谢障碍或机能紊乱而发病7。21病毒性疾病对于鱼病毒的研究,得益于鱼病毒诊断技术不断改进和完善8。211神经坏死病病原体是神经坏死病毒。主要症状有病鱼不摄食9,反应迟钝,腹部朝上,漂
15、浮于水面作旋转游动；鳔肿大、肾脏坏死、糜烂,病鱼消瘦,外观脑部发红。212传染性胰坏死症由具RNA的BIRNAVIRIDAE病毒所感染,是致死率非常高的传染病10。1960年由WOOD等人首次分离到本症的病毒。病鱼发病时突然狂奔在水中回游,死亡前体色呈黑变,眼球突出,腹部膨胀,腹鳍基部出血点,解剖时可见肝脾褪色,消化管残留食物及乳糜状液体,幽门垂点状出血,胰细胞的坏死为本病的主要特征,也能看到细胞质内包涵体。213虹彩病毒病病原体是虹彩病毒。虹彩病毒是鱼类的重要病原体,大口黑鲈虹彩病毒、白鲟虹彩病毒、真鲷虹彩病毒、金鱼虹彩病毒、红细胞坏死症虹彩病毒等是世界上主要的鱼类虹彩病毒。在虹彩病毒的自然
16、暴发中,发病大多突然。潜伏期一般为515D,最高死亡率可达10011。这类病毒能引起鳖、龟、牛蛙、蟾蜍、日本鳗鲡、鲈鱼、牙鲆、真鲷、鲶鱼、大菱鲆、石斑鱼和鲍鱼等近百种水生动物发病,使欧洲、亚洲、美洲、澳洲等地的养殖及观赏水生动物死亡率达到30100,危害极大12。感染的病鱼一般体色发黑,鳃部呈贫血状态,体表和鳍出血,病鱼肝脏、脾脏、头肾等处增生肿大13,脾脏组织切片能观察到异常肥大细胞,这些细胞中含有病毒粒子。214传染性造血器坏死症本病的病毒属RHABIDOVIRIDAE的一种。感染鱼变得不活泼,对外界来的声音刺激较迟钝,有时突然不停回游。较长的感染过程之后,腹部鼓胀、眼球突出、鳃呈贫血状、
17、体表暗色、鳍基部出血等外观症状,解剖时腹腔内贮留透明液体,肝淡色,前肾至中肾部色泽成半透明,组织学可见造血组织的前肾部明显坏死,细尿管上皮细胞坏死等病变。22细菌性疾病221弧菌病病原体是溶藻弧菌14、副溶血弧菌、哈维氏弧菌、河流弧菌。幼鱼发病潜伏期35天,致死率高,病鱼运动缓慢,体色变黑。体表和鳍有点状出血,溃疡,逐渐转变成脓疡。口腔部、眼窝也有点状出血。剖检时,急性型病鱼的肝、肾及脾脏多淤血、出血斑及不同程度的变化。脾脏常常肿大或融解。肌肉有时也有出血。肠炎也是症状之一。慢性型病鱼的皮肤患部及内脏患部纤维化。病鱼很快失去食欲,慢游于水面。防治措施是保持饲养环境的清洁,保证饵料的质量；杀灭体
18、表寄生虫,在饵料中适量加入抗菌素投喂。222细菌性肠炎病原体是肠型点状气单胞菌15。此种病菌感染范围广，甚至可引起人类软组织损伤感染、腹泻及食物中毒16。有病鱼的主要症状是在水体上层游动不活跃,体表充血,有的腹部膨胀,肛门红肿,挤压腹部,肛门内有大量的黄色粘液流出。鱼体肠道发红、变薄、透明、弹性差,内容物少或无食物。严重时性腺也发红,腹腔充满黄色积水。预防措施是发病季节严格控制饵料质量。治疗方法有发病后要停止投喂12餐,不用药,病情较轻的一般可治愈；己发现症状的病鱼要在饵料中添加抗生素投喂。23寄生虫性疾病231孢子虫病病原体是一种微孢子虫。主要症状有鱼体体力不支,食欲下降,鳍条、腹部、背部有
19、充血现象,死鱼鳍条、鳃、肌肉腐烂。解剖鱼体发现内脏有许多黑色囊胞,将黑色囊胞压破,内呈乳白色,镜检可看到很多孢子虫。232海水鱼白点病刺激隐核虫病病原体是刺激隐核虫,又称海水小瓜虫。主要症状有寄生处形成一些小白点,病情严重时身体各处布满小点,体表有大量粘液,鱼体体表皮肤褪色,游动异常,常与固体物摩擦。在少数体表可发现有溃疡。233车轮虫病病原体为车轮虫属。主要症状是少量寄生时,无明显症状；严重时,可引起鳃部粘液增多,鱼体游动缓慢、呼吸困难而死,一般无其它特殊症状。234瓣体虫病病原体为石斑瓣体虫。主要症状病原体寄生在鱼体表、鳍条、鳃丝上,鱼体粘液增多。患病鱼离群缓慢游动,体色变浅,鳍条附有污物
20、,病鱼由于呼吸困难而把鳃盖打开,摄食量大大减少。刮取体表粘液或剪下少许鳃丝做成水浸片放在显微镜下观察,可检查出较多虫体。235本尼登虫病病原体是本尼登虫。主要症状有鱼体粘液增多,表皮发白,有摩擦过的痕迹,体表破损。236异沟虫病病原体是异沟虫。主要症状病原体寄生于鳃上,鳃苍白、呈贫血状,分泌大量粘液；病鱼体色变黑,游动无力,厌食,身体消瘦。237线虫病病原体是线虫。主要症状有鱼体寄生部位充血、发炎、溃疡,剥去皮肤组织可见橙红色的虫体盘曲在肌肉组织上,通常寄生在每尾鱼体上的寄生虫数为35条,多者超过10条。有的由于虫体的侵袭使寄生部位缺陷,积蓄一些黄白色的粘稠状液体。238湖蛭病病原体为湖蛭。主
21、要症状有鱼体瘦弱,呈不安游动状。239鲺病病原体为鲺。它寄生于鱼的体表,体表粘液增多,鱼呈不安游动状,常继发细菌性疾病。3结语现阶段，随着科学技术及其医疗卫生事业的不断发展与快速提高，正确并且安全地养殖多种多样的观赏鱼已经进入一个新的阶段，影响观赏鱼的饲养因素，如温度、季节、自身免疫、混养交叉感染等，已越来越多被人们研究，并得出最佳的养殖环境、养殖条件、养殖方式和方法，为观赏鱼的持久饲养与发展做出了很多努力与多方面的科学实验。对于已发现的主要观赏鱼的易引发疾病，采用了多种多样的检测手段和正交试验分析，其中，比较先进而且灵敏度高，检测方便的以CARLS等17大部分检验方法都与分子生物学中的经典技
22、术密不可分，比如免疫学诊断技术18中的荧光抗体技术将免疫化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微镜技术的精确性相结合,在鱼病病原的检测上得到了一定的应用19。始于1971年的酶免疫技术20和SAN等21在1992年首创的可应用鱼的虹彩病毒检测22的免疫PCRIMMUNOPCR技术等。为了弥补各自的不足,进一步提高灵敏度和特异性,可以采用多种方法联合使用的策略,如免疫PCR模板制备的方式23、PCRELISA方法等。可以预料到，随着观赏鱼业的不断进步与各个领域，方面技术的不断完善，一定会带动此项目的蓬勃前进，为使人们观赏到各种各样美丽悦目的鱼类奠定了厚实的基础，使人们的生活变得丰富和精彩。参考文献
23、1李融译观赏鱼养殖宝典M北京中国农业出版社,20032李亚彪观赏鱼产业发展五特点J农家参谋,2007,083王玉堂观赏渔业的发展概况J中国水产,2006,60115174郑宝大,李俊杰，姜景田观赏鱼的疾病防治J齐鲁渔业，2008，25（06）545王广军观赏鱼的一般饲养管理技术J北京水产,2000,120618216叶建生观赏鱼常见疾病的发病因素及其预防J河北渔业,2006,161048497张爱良观赏鱼及其养殖中应注意的问题J特种经济动植物,2003,150718198史成银,王印庚人菱鲜病毒性疾病研究进展J高技术通讯,2003,1809991049孔杰PCR技术在对虾病原检测中的应用J生物
24、工程进展,1994,1406434610李向勇,李娟观赏鱼类疾病及其诊断方法J河北渔业，2007，1111HEJG,WENGSP,ZENGK,ETALEXPERIMENTALTRANSMISSIONPATHOGENICITYANDPHYSICALCHEMICALPROPERTIESOFINFECTIONSSPLEENANDKIDNEYNECROSISVIRUSISKNVJJFISHDISEASES,2002,231412井上洁,池谷文夫,前野幸男等养殖真鲷的虹彩病毒感染症J鱼病研究日本,1992,27192713陈在贤,郑坚川,江育林从患红脖子病甲鱼体分离到虹彩病毒J中国兽医学报,1998,1
25、8213513914廖志强福建省主要海水养殖鱼类疾病及其防治J福建水产,2003,1404303415葛慕湘,杨培培,张文香等嗜水气单胞菌对鲤鱼血液指标的影响J河北渔业,2006181016王琳娜嗜水气单胞菌感染导致群体性腹泻的病原学分析J中国卫生检验杂志,2007,17592192217CARLOSR16SRRNAGENESEQUENCEANALYSISOFPHOTOBACTERIUMDAMSELAEANDMETHEDPCRMETHODFORNESTEDPCRMETHODFORRAPIDDETECTIONOFTHECAUSATIVEANENTOFFISHPASTERUELLOSISJAPPL
26、ENVIRONMICROBIOL,1999,65072942294618王雪鹏分子生物学技术在水产动物疾病诊断中的研究进展J水利渔业,2004,24034619LARGODBIMMUNOFLUORESCENTDETECTIONOFICEICEDISEASEPROMOTINGBACTERIALSTRAINVIBRIOSPPIIOFTHEFARMEDMACROALGA,KAPPAPHYCUSALVAREZIIGINARTINALPS,RHODOPHYTAJMARBACTERIAL,2000,182123405341520张玲,丁雷,岳永生生物技术在鱼类种质资源研究中的应用J水利渔业,1999,19
27、06252621SANOTIMMUOPCRVERYSENSITIVEANTINENDETECTIONBYMEANSOFSPECIFICANTIBODYDNACONJUGATESJSCIENCE,1992,258507912012222GRIZZLEJM,ALTINOKI,NOYESADPCRMETHODFORDETECTIONOFLARGEMOUTHBASSVIRUSJDISAQUATORGAN,2003,541293323陈新华,王小文,吴文忠一种简便、快速从病毒感染鱼、虾组织中制备PCR模板的方法J中国生物工程杂志,2003,2386668本科毕业设计（20_届）虎皮鱼PUNTIUSTET
28、RAZONA暴发性死亡超微病理学研究目录1引言22材料与方法321材料与试剂3211实验材料3212实验试剂3213实验仪器及器皿322实验方法3221取材3222制作超薄切片33试验结果431虎皮鱼病症432虎皮鱼组织病原观察433电镜下的虎皮鱼各组织超微病理5331肠5332肌肉6333肝脏8334生殖细胞9335胃10336心脏11337肾脏134实验分析与讨论14致谢错误未定义书签。参考文献15摘要虎皮鱼是一种主要的观赏鱼类，近年来，虎皮鱼的养殖技术在我国得到了迅速发展，并且已经成为观赏鱼养殖业的主导养殖品种。但是它的病害问题一直是影响虎皮鱼养殖业的一个重要因素，根据近年的病害调查，发
29、现虎皮鱼的发病率及死亡率都呈上升趋势，给养殖户造成了很大的危害，并且这种现象发生后没有良好的控制方法。近期，从某养殖场取得的大量暴发性死亡的虎皮鱼，除鳍部轻微充血，尾鳍部分断裂外，无其他明显症状。解剖后，部分死鱼脏器有明显囊肿，光学显微镜下观察无寄生虫感染。本研究拟通过分析暴发性死亡虎皮鱼的超微病理变化，分析死亡原因，为虎皮鱼病害的防治提供理论依据。取濒死虎皮鱼的肠、肌肉、肝脏、生殖组织、胃、心脏、肾脏制作超薄切片，在透射电镜下观察超微病理变化，发现大量病毒感染，各脏器均有明显病变。关键词虎皮鱼；透射电镜；超微病理ABSTRACTPUNTIUSTETRAZONAISAMAJORORNAMENT
30、ALFISHINRECENTYEARS,FARMINGPUNTIUSTETRAZONADEVELOPEDRAPIDLYINCHINAANDHASBECOMETHELEADINGAQUACULTURESPECIESOFORNAMENTALFISHESBUTTHEMOSTIMPORTANTFACTORTHATAFFECTITFORFARMINGTHEMISTHEPROBLEMSOFDISEASESOFFISHESACCORDINGTOTHEINVESTIGATIONOFTHEDISEASESOFFISHESINRECENTYEARS,WEFOUNDTHATTHEREISATRENDTHATTHER
31、ATEOFILLANDDEATHOCCURSINMOREANDMOREFISHESITBRINGSTHEFARMERSLOTSOFLOSSES，ANDTHEYHAVENOGOODMETHODSTOCONTROLTHISPHENOMENONSOMETIMESAGO,WEOBTAINEDALARGENUMBEROFPUNTIUSTETRAZONATHATTHEYOCCURREDTHESPREADDEATHFROMAFARMWEFOUNDTHATTHEREARENOOTHERCHARACTERISTICSEXCEPTTHATTHEREISCONGESTIONINTHEIRFINSANDPARTSOF
32、FINSWEREFRACTUREDAFTERDISSECTINGTHEM,THEREISNODIFFERENTPHENOMENONFROMTHEHEALTHFISHESEXCEPTFROMSOMEFISHES,ORGANSWERECYSTWITHTHEOPTICALMICROSCOPE,WEDIDNOTFINDTHEORGANSOFTHESEFISHESWEREINFECTEDBYVIRUSINORDERTOFINDOUTTHENOSOGENESIS,THETEMWASUSEDTOOBSERVETHEPUNTIUSTETRAZONA,STISSUESWECANFINDTHATTHEFISHES
33、WEREINFECTEDBYVIRUSANDTHEORGANSWERECHANGEDOBVIOUSLYBYOBSERVINGSOMEPARTSOFTHEPUNTIUSTETRAZONA,STISSUESINTESTINE,MUSCLE,LIVER,REPRODUCTIVETISSUES,STOMACH,HEART,KIDNEY,WECANANALYSISTHEULTRASTRUCTURALPATHOLOGYOFPUNTIUSTETRAZONA,INORDERTOOFFERBASISONTHEDETERMINATIONOFTHECAUSEOFDEATH,ANDGIVEMORETHEORETICG
34、UIDANCEOFDISEASETOCONTROLTHEMINTHEFUTUREKEYWORDSPUNTIUSTETRAZONTEMULTRASTRUCTURAL1引言我国有着悠久的养殖观赏鱼的历史1。虎皮鱼（PUNTIUSTETRAZONA）属鲤科，又名四间鱼、四间鲫鱼。原产地马来西亚，印尼苏门答腊岛、加里曼丹岛等内陆水域。它是一种饲养较普遍的鱼种。鱼长57厘米，呈纺锤形。身体匀称，色彩鲜艳，以金黄色做底色，头部、腹部、尾部前端贯有四条竖向黑条纹，随光线角度不同会闪现出金属般的光芒。成鱼的背鳍、胸鳍、腹鳍及尾部的边缘都呈现出亮丽的红色，很有观赏价值。作为一种重要的观赏鱼，虎皮鱼的商业价值非常
35、高。随着养殖规模的扩大，虎皮鱼在养殖过程中出现病害的频率也越来越高。目前，对虎皮鱼的病理研究还鲜有报道。近几十年来，有关于鱼类暴发性死亡的研究有黄琪琰等2，3在对鱼类流行病学方面进行了深入透彻的分析；徐伯亥等46在鱼类病原及防治方法上进行了深入的探索；李凯彬,石存斌,李新辉,黄志斌,余德光7对眼斑拟石首鱼暴发性传染病病原进行了初步的研究，列举了流行的鱼类病病毒，如鲑鳟鱼类经IPNV感染后,导致鱼苗、鱼种有较高的死亡率。据研究,IPNV能感染37种硬骨鱼类包括海水鱼和淡水鱼及3种虾类8,引起近乎世界范围的流行,给鱼病的防治带来困难。并且，通过这项研究，初步认定虹彩病毒是眼斑拟石首鱼暴发性传染病的
36、主要致病原；梅广海，王羽，刘加成，刘厚军，王立峰等9总结了对鲫鱼暴发性斜管虫病的诊治技术；2010年第一期的科学养鱼对2009年东平湖网箱养殖鳜鱼暴发性死亡流行情况进行了分析，分析内容包括病鱼的主要症状、可能诱发的病因、以及防治措施。由此可见，鱼类的暴发性疾病及死亡在近些年来时有发生，所以，对其病症的总结，发病原因的探究及预防这些鱼类发病及死亡所采取的措施已成为当今生物科学研究的重要课题之一。但是，在已有的报道中，对发病鱼的超微病理方面的分析与讨论相对而言较少，现已有的相关方面的报道有袁莉民，李恕，丛宁等运用电子显微的技术,对患暴发性流行病鲫鱼的肝、心组织进行超薄切片的观察,发现发病鲫鱼的肝、
37、心组织结构发生了明显的变化,其变化与一些高等动物的相应组织在急性致病因子作用下的病理变化相似；2007年，卓玉琛在其硕士毕业论文中，对欧洲鳗鲡的败血症病理学和组织化学进行研究，探讨了败血症的发生过程和发生原因。患有败血症的欧洲鳗鲡的一些重要器官的超微病理变化表现为心肌纤维呈扭曲状态、部分溶解、局部出现空泡现象，细胞核肿胀、胞质较疏松，出现空隙，肌节结构模糊，线粒体呈空泡化；鳃中大量细胞呈崩解状态，细胞的界线已经消失，仅见崩解后的膜质结构；肝细胞，细胞核的染色质、核膜模糊、膜间隙增大、断裂，胞质疏松，核糖体增多，脂肪滴多且大；脾脏中，淋巴细胞核的异染色质边集化，核膜破裂，红髓区红细胞核固缩、胞质
38、稀疏，肠粘膜的微绒毛排列缺失，不整齐；肾小球毛细血管内皮细胞增厚、破裂，上皮细胞足突融合且微绒毛化现象严重，胞浆内的线粒体呈严重空泡化现象，肾小管胞质中的线粒体空泡化，溶酶体、次级溶酶体、残余小体增多等。在虎皮鱼的养殖过程中，时常发生各种各样的病变甚至死亡。本实验分析了从养殖场中取得的暴发性死亡虎皮鱼样本的超微病理变化，从而为确定发病或死亡虎皮鱼原因奠定基础，也为病害的防治提供理论依据。2材料与方法21材料与试剂211实验材料取发生暴发性死亡虎皮鱼为实验用材料，另取健康虎皮鱼做对照观察。212实验试剂01MPBS、各种不同浓度的酒精、25戊二醛溶液、1锇酸、醋酸铀、柠檬酸铅、EPON812包埋
39、剂等。01MPBS8GNACL、02GKCL、144GNA2HPO4、024GKH2PO4，溶于1000ML蒸馏水中，PH74。25戊二醛取25戊二醛溶液用01MPBS稀释。213实验仪器及器皿解剖刀、镊子、剪刀、解剖针、解剖镜、单面刀片、酒精灯、染色缸、冰箱、电炉、洗净的青霉素空瓶、载玻片、盖玻片、玻璃器皿、SARTORIUS电子天平、切片刀、KDBM电脑生物组织包埋机、KD型轮链式切片机、KDT电脑生物组织摊片机、NIKONECLIPSE80I光学显微镜、RMCPOWERTOMEXL超薄切片机、日立S3400N扫描电子显微镜等。22实验方法221取材观察病鱼的外在病症，后解剖，并在光学显微
40、镜下观察各脏器。取肠、肌肉、肝脏、生殖组织、胃、心脏、肾脏为样本组织。用新的锋利刀片切小，修成1MM1MM1MM的组织块。222制作超薄切片将修好的肠、肌肉、肝脏、生殖组织、胃、心脏、肾脏组织块移至戊二醛锇酸固定液中，4下，于25戊二醛中固定2H，后用1锇酸固定液黑暗下固定1H，冷PBS缓冲液漂洗20MIN，PH74。乙醇梯度脱水15乙醇15MIN，30乙醇15MIN，50乙醇15MIN，70乙醇15MIN，85乙醇15MIN，95乙醇15MIN，100乙醇10MIN（二次）。脱水后的组织块用EPON812环氧树脂包埋，烘箱内烘干，制成包埋块。用超薄切片机将包埋块进行切片，用醋酸铀柠檬酸铅对其
41、进行双染色，于室温下1520MIN透射电镜观察，进行拍照并保存结果。3试验结果31虎皮鱼病症从某养殖场取得的大量暴发性死亡的虎皮鱼，除鳍部轻微充血，尾鳍部分断裂外，无其他明显症状。解剖后，部分死鱼脏器有明显囊肿，光学显微镜下观察无寄生虫感染。（如下图1、图2所示）图1图232虎皮鱼组织病原观察对发病虎皮鱼进行组织病原观察，发现无寄生虫，无细菌感染，但可看到大量病毒。（如图3所示）图333电镜下的虎皮鱼各组织超微病理331肠肠是下消化道重要的组成部分，也是食物消化和吸收的主要部位，是消化吸收系统中重要的器官之一。肠细胞的结构不完整会直接影响虎皮鱼正常的生理活动。透射电镜下可观察到暴发性死亡虎皮鱼
42、肠细胞线粒体肿胀，嵴断裂，减少，线粒体不同程度的空化；内质网变性，粗面内质网核糖体脱落；细胞核，核大，不规则，偏向一侧；核质固缩趋边化，核仁模糊不确定，或有消失迹象。核被膜凹陷、不规则；线粒体发生变性，形成髓鞘样结构，线粒体固缩，体积缩小，周围形成空隙。这些不同于正常虎皮鱼超微结构的病变会严重影响虎皮鱼各细胞器的生理生化作用及其所参加的整个生命活动。戴瑜来、吕永林、李凯、陶震、王国良10等对正常大黄鱼的体肠内壁细胞进行了研究，即正常大黄鱼的肠内壁细胞，游离面有较为明显的微绒毛,它们排列整齐呈纹状,即纹状缘。他们还对发病大黄鱼的鱼肠内壁吸收细胞特点进行了比较研究，研究表明发病鱼的肠内壁吸收细胞已
43、经破裂消解,几乎没有完整的细胞结构，肌层也失去了原有结构,经研究还发现，病鱼肌纤维散乱,呈现溃疡状态。细菌通过内壁感染组织,此结果与本实验中分析暴发性死亡虎皮鱼的肠细胞超微结构结果相似。图11图12图13图14图11透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肠细胞，线粒体肿胀，嵴断裂，减少，线粒体不同程度的空化（黑色箭头），无法维持线粒体的基本生命活动，以此影响虎皮鱼的正常的代谢活动。图12透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肠细胞，内质网变性，粗面内质网核糖体脱落。线粒体肿胀，趋于空化（黑色箭头）。图13透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肠细胞，核大，不规则，偏向一侧。核质固缩趋边化（长黑色箭头），核仁模糊不确定
44、，或有消失迹象。核被膜凹陷、不规则（短黑色箭头）。图14透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肠细胞，线粒体发生变性，形成髓鞘样结构（长黑色箭头），线粒体固缩，体积缩小，周围形成空隙（短黑色箭头）。332肌肉健康虎皮鱼的肌肉细胞,排列紧密而规则,有较多的线粒体，内质网排列整齐，胞浆分布均匀。作为一种重要的细胞器，线粒体不仅是细胞的呼吸代谢中心，更是重要的能源中心，它对各种细胞损伤极其敏感，与细胞各种生命活动有着紧密的关系；内质网（ER）是普遍存在于真核细胞中的一种细胞器，细胞处于功能活跃期时，可观察到较丰富的内质网。上述细胞器在虎皮鱼的生命活动中有着重要的作用，但患病或死亡的虎皮鱼细胞中，这些细胞器都
45、或多或少受到损坏，使细胞中各项生命活动都无法进行。透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼的肌肉细胞，可见患病虎皮鱼肌肉细胞肌纤维断裂，局部肌肉纤维溶解为不规则状；线粒体肿大，嵴不规则断裂，细胞结构破坏，其线粒体结构无法维持正常的生命活动；还可见，肌肉细胞肿大，内质网扩张，内质网核糖体脱落，分布不均匀，部分细胞溶解成空泡状结构；还可观察到有电子致密颗粒存在的现象。这些细胞器对生物的生理活动有着决定性的作用，丛宁，袁莉民11在研究罗氏沼虾“白体病”肌肉组织超微病理时得出肌肉细胞线粒体代谢失调会导致生物体能量代谢障碍。因此，线粒体形态结构的改变，直接影响到细胞正常的生命活动。肌肉细胞其他结构的破坏和不完整也
46、直接或间接导致其功能不能维持正常，影响生物的健康。图21图22图23图24图21透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肌肉细胞，可见患病虎皮鱼肌肉细胞肌纤维断裂，局部肌肉纤维溶解为不规则状。图22透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肌肉细胞，可见患病虎皮鱼肌肉细胞中线粒体肿大，嵴不规则断裂，细胞结构破坏，其线粒体结构无法维持正常的生命活动。图23透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肌肉细胞，可见患病虎皮鱼肌肉细胞肿大，内质网扩张，内质网核糖体脱落，分布不均匀，部分细胞溶解成空泡状结构。图24透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肌肉细胞，可见患病虎皮鱼肌肉细胞中线粒体增多、肿胀，排列紊乱，嵴不规则断裂。还可观察到电子致密
47、颗粒（黑色箭头）。333肝脏肝脏是机体重要器官之一，它具有代谢、合成、分泌、解毒等多种功能，行使这些功能的基本结构单位为肝小叶。对于肝脏超微病理的研究已近四十年，肝脏是电镜技术应用于医学生物学中研究最早的生物器官之一。机体多种疾病，无论是原发性或继发性的，也无论是化学因素、生物因素还是创伤性因素，都会直接或间接地影响到肝脏细胞的亚微结构，所以对肝脏的研究具有重要意义。正常鱼的肝脏细胞,边界清楚，呈多边形。细胞质中含有丰富的细胞器及其它内含物,有数量较多的呈圆形或椭圆形的线粒体,嵴的排列规则且清晰。细胞核位于细胞中央,呈正常圆形。此外，还富含粗面内质网和滑面内质网,它们绕细胞核质排列成环状。经观
48、察发现暴发性死亡虎皮鱼的肝细胞结构被严重破坏,如滑面内质网聚集，肿胀，排列无序；细胞核肿大，核内物质外溢，核仁凸出，核质趋边化，细胞核位于细胞一侧，而不是位于中央；细胞结构不完整，细胞膜破裂，细胞裂解，胞内物质外溢，个别细胞内线粒体肿胀；有明显纤维化现象。图31图32图33图34图31透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肝脏细胞，滑面内质网聚集，肿胀，排列无序；细胞核肿大，核内物质外溢，核仁凸出（黑色箭头）。图32透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肝脏细胞，可见细胞结构不完整，细胞膜破裂，细胞裂解，胞内物质外溢，个别细胞内线粒体肿胀，嵴增多（黑色箭头）。图33透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肝脏细胞，肝细
49、胞细胞核肿胀变大，核质趋边化，核仁不明显或消失，核周围线粒体肿胀，嵴明显增多，内质网受到损害。图34透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼肝脏细胞，可见细胞核增大，位于细胞一侧，不是位于中央；核质分布不均，向边缘富集，有明显纤维化现象。334生殖细胞透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼生殖系统细胞，细胞核变形，核仁不明显或消失，核周围有大量初级溶酶体和次级溶酶体，胞内细胞器溶解成小泡，细胞结构不完整；胞内纤维化现象严重。此前尚无有关虎皮鱼生殖细胞超微病理的报道，相关鱼类的报道也很少。对此唯一的了解是MMANJUSHA等12报道了对虾卵巢组织被病毒侵染后结缔组织坏死，细胞核肿大，而卵母细胞中无肿大细胞核，说明病毒侵染细胞是来自于卵巢结缔组织和卵母细胞病毒释放13。而在本实验中，生殖细胞本身的结构发生了变化，与正常的虎皮鱼生殖细胞超微结构相比，在暴发性死亡虎皮鱼的生殖细胞超微结构中，核质、细胞器都有不同程度的异常，这使生殖细胞的基本功能不能保证完成，最终导致生殖组织或生殖系统不能完成自生的生理功能，从而影响虎皮鱼正常的生命活动。图41图42图41透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼生殖系统细胞，细胞核变形，核仁不明显或消失，核周围有大量初级溶酶体和次级溶酶体，胞内细胞器溶解成小泡，细胞结构不完整。图42透射电镜下观察暴发性死亡虎皮鱼生殖系统细胞，胞内纤维化现象严重，细胞器溶解成小泡，细胞结构严重不
