1、本科毕业论文系列开题报告生物技术几种吸管虫原生动物的生物学研究一、选题的背景与意义纤毛虫CILIATES隶属于原生动物界，是最原始、最低等的动物之一，也是原生动物中种类数量最多，单位个体最大，特化程度最高的一大类群，经历了十分久远的进化和演化史，是地球上最古老的真核生物之一。日前已知的近万种纤毛虫在形态结构、生活方式、环境分布及其他生物学特征方面均表现出较大的多样性。其主要特征有1其生活史中至少在某一时期存在纤毛或由其进一步特化而成的纤毛器作为运动、摄食胞器；2具有功能不同的大小核型，大核MACRONUCLEUS为多倍体，司营养，小核MICRONUCLEUS为二倍体，司遗传和生殖；3具有高度特
2、化的细胞器如纤毛CILIA、伸缩泡CONTRACTILEVACUOLE、胞口CYTOSOME、胞咽CYTOPHARYNX、胞肛CYTOPYGE等；4无性生殖通常为横二分裂，少数种类有出芽生殖及复分裂；5有性生殖为特殊的接合生殖CONJUGATION，极少数有自配AUTOGAMY或质配CYTOGAMY；6生活方式有自由生、共生、共栖及寄生等各种类型，全为异养。吸管类纤毛虫是纤毛门中高度特化的类群，大部分阶元尤其是海洋类群近半个世纪以来一直无人问津。在CORLISS的分类系统中，吸管类纤毛虫隶属于纤毛门，动基片纲，吸管亚纲、吸管目。几乎全部为固附或外栖性生活，无性生殖主要通过出芽方式进行，因此生活
3、史中可以明确分为成体和幼体阶段。成体时体表纤毛完全退化，无胞口；营摄食的管状或针状触手成簇或周身分布，触手上通常生有突出小体，称系缚式刺丝泡，借以捕食其它纤毛虫或它类原生动物。多数种类具有无收缩性的柄。幼体游泳体可自由游泳，全身或部分被有纤毛，无柄和吸管。无性生殖根据出芽的三种不同方式，分为外生、内生和外翻3个亚目。吸管虫是周丛生纤毛虫的主要组成类群，大部分种类可附生于其他生物体表，如原生动物、藻类、软体动物、轮虫、环节动物、甲壳动物、昆虫、鱼、海龟等，一些种类也可寄生于马、犀牛、豚鼠、大象的肠内。一般情况，吸管虫对其宿主影响不大，但当其大量滋生时，对养殖动物则有相当大的危害。周丛纤毛虫的群落
4、结构具有良好的自我维持和修复能力；集约化海水养殖水体中周丛纤毛虫的物种多样性显著高于开放的近海岸水体；其优势种群丰度、群落结构参数和多个环境因子具有显著的相关性；不同时空群落结构间相似性及其参数能较好反映周丛纤毛虫的群落结构演替，并能较好的响应集约化海水养殖水体环境的变化。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题（一）基本内容本实验对几种吸管类纤毛虫的生物学进行详细研究，包括形态学，分类学，生活史等。采集于自然水体的吸管虫在实验室条件下培养，通过体式显微镜和光学显微镜观察该类生物的生活史、活体形态学等特征。用现代银染方法揭示其游泳体的纤毛图式，核器结构等结构。通过对该类生物的研究，揭示其在自然界中
5、所扮演的重要角色。（二）拟解决的问题通过样品采集、种类分离与鉴定，活体形态学与生活史的观察，结合现代银染方法，对几种吸管类纤毛虫原生动物的生物学做初步的分析与研究。掌握该类群的采集、培养、光学显微镜观察及现代银染方法，完成23种吸管类纤毛虫的形态学描述和生活史观察。三、研究的方法与技术路线吸管虫原生动物几乎全部为固附或外栖性生活，无性生殖主要通过出芽方式进行，因此生活史中可以明确分为成体和幼体阶段。成体时体表纤毛完全退化，无胞口；幼体游泳体可自由游泳，全身或部分被有纤毛，无柄和吸管。其自身形态学特征决定研究方法相对复杂，如对成体主要进行活体观察，而游泳体需银染方能得到其纤毛图式等结构。1标本采
6、集11采集工具准备准备500和1000ML广口瓶各一，用于盛放载玻片的染色缸数量视采集点设置而定，装PFU海绵块约7X7X7CM的密闭塑料袋或具盖水桶等，同时还应准备若干个由培养皿改制成的潮湿房以备用分离培养用。12采集地点的选择在过分清洁或污染各类生活污染或工业污染极端严重的水体内或含大量硫化氢并有恶臭等强烈气味的场所，通常除特有种外，一般不易采到大量丰富的标本。水体较清,但底层有较多的有机质腐积层枯枝败叶或水中植物等通常是良好的纤毛虫栖息场所。背阳、潮湿而又富含植物根叶的表层土应视作理想的土样采集点而不应选择主要为砂砾结构、过分干硬而又缺少植物根叶等有机质的土壤。水色浓重，而这种颜色是由于
7、自养性鞭毛虫藻造成的，通常不易采获丰富的纤毛虫标本。个体丰度及种类数通常近岸海淡水处多于离岸的水体。13标本采集选定采集地点进行标本采集，采集的同时均应认真记录下采集的时间、地点及主要生境条件水温、盐度、环境特征等。2分离与培养在解剖镜下进行，根据虫体的大小而选用不同口径的微吸管将所需虫体挑选至已备好的培养皿或多孔凹玻片内。一经分离后即刻对分离标本进行编号，以备查收。3活体观察方法活体观察方法主要用以获取吸管虫细胞大小、外形、触手数目、柄长、外鞘形状、伸缩泡、食物泡、内质颗粒及射出体等分类学特征。观察所用光学显微镜以微分干涉显微镜为最好，如以相差显微镜，推荐正低相差为佳PLPOSITIVELO
8、W，若仅有明视野观察则可通过改变数值光栏以详细观察表膜结构。在记录用纸上对所观察标本予以编号（如199912501）（同时尽可能给出一日后可辨别的名称）采集人，地点，日期，生境特征（盐度、水温、PH等）。4蛋白银法蛋白银染色技术对大部分纤毛虫的染色效果极佳，但对于咽膜类、肾形类及篮环目等类群则常常不够理想。其主要用以显示虫体的皮层及内部结构，如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维系统等，而银线系统则不被染色。WILBERT之蛋白银法的具体步骤1虫体于胚胎皿中用BOUIN液或饱和升汞HGCL2固定510MIN；2蒸馏水洗34次BOUIN液以水洗至无色为准；3以最细微吸管小心将虫体“吹”至胚胎皿
9、中心；4用0102的次氯酸钠NACLO或次氯酸钾（KCLO）微量直接供至虫体处以漂白至“透明”约12MIN用HGCL2固定时，标本往往漂白效果略差；5蒸馏水洗两次以清洗完全为度；6将胚胎皿中蛋白银浓度控制在约05，加盖后于5060的恒温箱底板上保持3050MIN视不同种类的嗜染状况及虫体大小而调整时间；7室温下用0102的显影液显影15MIN或更短；8镜检后用5的硫代硫酸钠NA2S2O3定影约5MIN；9蒸馏水洗一次此时应清洁虫体，将虫体转入载玻片上并与等量的蛋白胶混匀，用眉毛笔调体位在必要时,如需腹面朝上等，除去余液，至温箱烘片约10MIN；10常规脱水封片70酒精起809095100100
10、无水酒精和二甲苯混合液11二甲苯二甲苯,以上过程每步约25MIN，其中在无水酒精中每步应不少于5MIN，以确保彻底脱水。采样点周丛类群PFU法、载玻片框法样品采集纤毛虫分离、富集样品室内处理观察生活史培养成体、游泳体形态学活体观察游泳体的纤毛图式蛋白银染色生物学描述数据总体技术路线示意图四、研究的总体安排与进度2010年11月2010年12月1实验前准备工作查找资料，对实验内容做初步了解2取样工具、实验仪器和药品的准备3学习银染方法4完成开题报告、任务书及文献综述的撰写2011年1月2011年2月1实验2翻译英文文献2011年2月2011年3月1实验2数据整理3撰写初稿2011年4月2011年
11、5月1初稿经指导老师指正后进行修改和完善2毕业论文定稿，准备答辩五、主要参考文献1宋微波,徐奎栋,施心路,等原生动物学专论M青岛青岛海洋大学出版社,1999125,211268,3253622宋微波,赵元莙,徐奎栋,等海水养殖中的危害性原生动物M北京科学出版社,200312623宋微波,沃伦,胡钟晓,等中国黄渤海的自由生纤毛虫M北京科学出版社,20091351694XUK,CHENJK,YANGEJ,ETA1BIOMONITOFINGOFCOASTALPOLLUTIONSTATUSUSINGPROTOZOANCOMMUNITIESWITHAMODIFIEDPFUMETHODJMARINEPOL
12、LUTIONBULLETIN,2002,448778865宋微波,徐奎栋纤毛虫原生动物形态学研究的常用方法J海洋科学,1994,6696陈相瑞,宋微波,胡晓钟青岛沿海吸管虫原生动物,纤毛门一新属、新种及九新纪录种记述J动物分类学报,2005,3034935007李琦路,宁应之土壤生态环境中纤毛虫的研究与应用J西北师范大学学报自然科学版,2008,44382878龚骏,宋微波青岛沿海的管口类纤毛虫（原生动物,纤毛门,管口目）J动物分类学报,2009,49499539吴利,冯伟松,陈相瑞,等五种淡水吸管虫原生动物中国新纪录种的描述J动物分类学报,2006,31231131610李继秋,林晓凤,许恒
13、龙,宋微波海水养殖水体周丛纤毛虫的群落结构及其对环境因子的响应J水生生物学报,2008,32449350011GONGJ,SONGWBANDWARRENAPERIPHYTICCILIATECOLONIZATIONANNUALCYCLEANDRESPONSESTOENVIRONMENTALCONDITIONSJAQUATMICROBECO1,2005,39159170毕业论文文献综述生物技术纤毛虫原生动物的研究进展摘要原生动物是环境监测中理想的指示生物。纤毛虫是原生动物各门中特化程度最高也是最复杂的一大类群，在形态结构、生活方式、环境分布及其他生物学特征方面均表现出较大的多样性，现阶段研究的内容
14、仅限于形态分类学、系统学、细胞发生学、病害学和生态学等几个方面，很多方向尚未得到开发。吸管类纤毛虫隶属于纤毛门，由于种种原因，国内迄今十分缺乏有关吸管虫的资料，对该类群的研究几乎完全空白。关键词原生动物；纤毛虫；吸管虫原生动物是环境监测中理想的指示生物1,2,3，有关其群落结构与环境关系的研究表明，原生动物的种群动态、群落结构与功能变化可以直接或间接地反映水质状况及发展趋势4。国内迄今利用原生动物群落对淡水环境开展监测与评价已有许多富有成果的研究1,3,5。1、纤毛虫原生动物11纤毛虫原生动物的特点纤毛虫CILIATES在分类学上隶属于原生动物亚界之纤毛门CILIOPHORA，是原生动物各门中
15、特化程度最高也是最复杂的一大类群6。迄今已知者11000余种，命名者则超过15000种，其中至少有约1/3生活在海洋中7。日前已知的近万种纤毛虫在形态结构、生活方式、环境分布及其他生物学特征方面均表现出较大的多样性。其主要特征有以下几点1其生活史中至少在某一时期存在纤毛或由其进一步特化而成的纤毛器作为运动、摄食胞器；2具有功能不同的大小核型，大核MACRONUCLEUS为多倍体，司营养，小核MICRONUCLEUS为二倍体，司遗传和生殖；3具有高度特化的细胞器如纤毛CILIA、伸缩泡CONTRACTILEVACUOLE、胞口CYTOSOME、胞咽CYTOPHARYNX、胞肛CYTOPYGE等；
16、4无性生殖通常为横二分裂，少数种类有出芽生殖及复分裂；5有性生殖为特殊的接合生殖CONJUGATION，极少数有自配AUTOGAMY或质配CYTOGAMY；6生活方式有自由生、共生、共栖及寄生等各种类型，全为异养2。12纤毛虫原生动物形态学研究的基本方法由于纤毛虫个体微小，且生物多样性极高，其分类学研究除了需利用光学显微镜对其活体形态学进行详细观察，还要借助各种现代银染方法、微分干涉技术、电镜技术、免疫荧光技术以及分子生物技术等2,7,8。纤毛虫原生动物形态学研究的基本方法有活体观察方法、甲基绿派洛宁临时核器染色方法、蛋白银法、银浸法、黑色素FEULGEN复染法、干银法和氨银法，运用这些方法可
17、成功地进行分类鉴定工作2,9。但这些方法的显示效果也各有侧重，没有一种单一的方法能显示各种必需的分类学性状。同样地，没有一种染色法能不加变更地适用于各种纤毛虫。一般来说，一个纤毛虫形态学全面的描述至少应包括活体观察，银浸法染色，蛋白银或氮银法染色。通过染色可获得纤毛虫的细微结构，但并不能因此而忽视活体观察的重要性。相反，准确完整的活体观察在很大程度上弥补了单纯染色的不足，从而完善了纤毛虫的形态学研究。二者缺一不可，相辅相成。13国内对纤毛虫原生动物的研究进展在我国，由于技术、研究资料与背景等方面的限制，对纤毛虫原生动物的研究相对滞后，仍处于初级阶段，所涉及的内容仅限于形态分类学、系统学、细胞发
18、生学、病害学和生态学等几个方面，很多方向尚未得到开发10,11。其实，纤毛虫与我们的日常生活有着密不可分的关系，在环保、工业、农业、畜牧业、渔业、药业等诸多方面都发挥着不可忽视的作用，并有着重要的经济意义10。如土壤纤毛虫在土壤生态环境评价中具有较好的应用前景它具有大的现存量和生产力，与周围环境相接触的细胞膜较薄，可迅速地感知外部环境的微小变化；与细菌等原核生物相比，其对环境变化的反应与后生动物更为相似；不同分布区的土壤纤毛虫的形态、生态和遗传分化较低，可以在世界范围内广泛应用；在一些高等生物无法生存的极端环境中，土壤纤毛类原生动物往往可以生存并大量繁殖12。近20年来，以宋微波教授为首的研究
19、团队对我国海洋，尤其是青岛近岸的各类水体中纤毛虫的区系结构及其生物多样性的研究逐步开展起来，对腹毛类、寡毛类、缘毛类、管口类及侧口类等若干重要类群做了系统的描述和厘定9,11,13。而动基片纲中的刺钩类、合膜类及吸管类，多膜纲的异毛类等有关描述和报道相对缺乏。2、吸管类纤毛虫21吸管类纤毛虫的特点吸管类纤毛虫是纤毛门中高度特化的类群，大部分阶元尤其是海洋类群近半个世纪以来一直无人问津8。在CORLISS的分类系统中，吸管类纤毛虫隶属于纤毛门，动基片纲，吸管亚纲、吸管目14。吸管虫喜食草履虫，在草履虫的培养液中若混入吸管虫，轻者会影响草履虫的培养，重则导致“全军覆没”15。现代研究支持该类群为一
20、单源发生系，具有与管口类较接近的关系系统。吸管虫几乎全部为固附或外栖性生活，无性生殖主要通过出芽方式进行，因此生活史中可以明确分为成体和幼体阶段。成体时体表纤毛完全退化，无胞口；营摄食的管状或针状触手成簇或周身分布，触手上通常生有突出小体，称系缚式刺丝泡，借以捕食其它纤毛虫或它类原生动物。多数种类具有无收缩性的柄。幼体游泳体可自由游泳，全身或部分被有纤毛，无柄和吸管16。无性生殖根据出芽的三种不同方式，分为外生、内生和外翻3个亚目。由于该类纤毛虫对环境要求的苛刻性，海洋中该类群相对稀少，从EHRENBERG于1833年描述第一种吸管虫结节壳吸管虫至今约两个世纪所报道和描述的约400种吸管虫中大
21、部分为淡水种类17。22吸管类纤毛虫的生物监测作用吸管虫大部分种类可附生于其他生物体表，如原生动物、藻类、软体动物、轮虫、环节动物、甲壳动物、昆虫、鱼、海龟等18，一些种类也可寄生于马、犀牛、豚鼠、大象的肠内19。一般情况，吸管虫对其宿主影响不大，但当其大量滋生时，对养殖动物则有相当大的危害20。另外，吸管虫是周丛生纤毛虫的主要组成类群，周丛纤毛虫的群落结构具有良好的自我维持和修复能力；集约化海水养殖水体中周丛纤毛虫的物种多样性显著高于开放的近海岸水体；其优势种群丰度、群落结构参数和多个环境因子具有显著的相关性；不同时空群落结构间相似性及其参数能较好反映周丛纤毛虫的群落结构演替，并能较好的响应
22、集约化海水养殖水体环境的变化2,17,21,22。23吸管类纤毛虫的研究状况由于种种原因，国内迄今十分缺乏有关吸管虫的资料，对该类群的研究几乎完全空白。另外，吸管虫成体因体表纤毛完全退化而结构相对简单，不同种间特征又有很大的重叠性，而蛋白银等现代银染技术难以广泛应用于该类群的分类学中，使其研究工作一直滞留于传统方法活体或固定样品进行观察。上世纪80年代后，电镜技术开始应用于纤毛虫分类学研究，尤其是进入21世纪后，分子生物学手段的广泛运用，有助于清理该类纤毛虫研究多年来遗留下来的大量混乱和错误积。早期分类学只是依据吸管虫的形态学触手位置，是否具外壳，是否有柄等将其分为七个科，近年来吸管虫的分类达
23、成了近乎一致的方案，即根据吸管虫无性生殖的芽体形成方式分成三类，一类为外出芽方式的外生亚目，一类为内出芽方式的内生亚目，一类为外翻亚目。目前，国外对吸管虫的研究主要集中在着生类吸管虫，而国内的研究甚少。3、展望纤毛虫原生动物作为重要的生物模型，在细胞生物学、真核生物遗传学研究以及核质关系探讨上具有重要的研究价值。此外，作为水生微食物网中的调节枢纽，该类生物在环境生物学、能量动物学、水产养殖病害学、污水处理等领域中也同样是重要的研究对象。所以，在科学家的共同努力下，我国在该领域的研究水平会不断提高，必将促进其繁荣与发展。参考文献1沈韫芬,章宗涉,龚循矩,等微型生物监测新技术M北京中国建筑工业出版
24、社,199015242宋微波,徐奎栋,施心路,等原生动物学专论M青岛青岛海洋大学出版社,1999125,211268,3253623许木启,朱江,曹宏白洋淀原生动物群落多样性变化与水质关系研究生态学报J2001,2171114111204许木启,曹宏PFU原生动物群落生物监测的生态学原理与应用J生态学报,2004,247154015485XUK,CHENJK,YANGEJ,ETA1BIOMONITOFINGOFCOASTALPOLLUTIONSTATUSUSINGPROTOZOANCOMMUNITIESWITHAMODIFIEDPFUMETHODJMARINEPOLLUTIONBULLETIN
25、,2002,448778866宋微波,马洪钢我国海洋纤毛虫原生动物的研究进展J生物学通报,2000,35510L17苗苗纤毛虫原生动物若干重要类群的分子系统发育研究D青岛中国海洋大学,20098陈相瑞海洋纤毛虫的多样性研究裸口类、下口类、吸管类、旋唇类D青岛中国海洋大学,20099宋微波,徐奎栋纤毛虫原生动物形态学研究的常用方法J海洋科学,1994,66910王娅宁,施心路,刘桂杰,等纤毛原生动物研究的经济意义J2009,266727511陈相瑞,宋微波,胡晓钟青岛沿海吸管虫原生动物,纤毛门一新属、新种及九新纪录种记述J动物分类学报,2005,30349350012李琦路,宁应之土壤生态环境中
26、纤毛虫的研究与应用J西北师范大学学报自然科学版,2008,443828713龚骏,宋微波青岛沿海的管口类纤毛虫（原生动物,纤毛门,管口目）J动物分类学报,2009,494995314CORLISSJOTHECILIATEDPROTOZOACHARACTERIZATIONCLASSIFICATIONANDGUIDETOTHELITERATURE2NDEDMOXFORDPERGAMONPRESS,OXFORD,NEWYORK,TORONTO,SYDNEY,PARIS,FRANKFURT,197915许友勤草履虫的天敌固着足吸管虫J生物学通报,1988,74416宋微波,沃伦,胡钟晓,等中国黄渤海的
27、自由生纤毛虫M北京科学出版社,200913516917吴利,冯伟松,陈相瑞,等五种淡水吸管虫原生动物中国新纪录种的描述J动物分类学报,2006,31231131618宋微波,赵元莙,徐奎栋,等海水养殖中的危害性原生动物M北京科学出版社,2003126219DOVGA1IVEVOLUTION,PHYLOGENYANDCLASSIFICATIONOFSUCTOREACILIOPHORAJPROTISTOLOGY,2002,2419427020陈琳纤毛虫的生物学基础与危害鱼类的常见种属J福建畜牧兽医,1999,212455121李继秋,林晓凤,许恒龙,宋微波海水养殖水体周丛纤毛虫的群落结构及其对环境
28、因子的响应J水生生物学报,2008,32449350022GONGJ,SONGWBANDWARRENAPERIPHYTICCILIATECOLONIZATIONANNUALCYCLEANDRESPONSESTOENVIRONMENTALCONDITIONSJAQUATMICROBECO1,2005,39159170本科毕业设计（20_届）一种吸管虫的生物学研究目录1引言1411研究目的及意义1412研究历史、现状及趋势142吸管类纤毛虫的特征153实验材料1631仪器1632试剂164实验方法1641标本采集16411采集工具准备16412采集地点16413标本采集1642分离1743培养17
29、44活体观察17441具体步骤17442活体观察记录1845蛋白银染色18451试剂配制18452具体步骤185结果与讨论1951出芽斑吸管虫19511形态学描述19512生殖和幼体描述1952讨论与比较206展望21参考文献27致谢错误未定义书签。摘要本工作对出芽斑吸管虫的生物学进行了详细研究，包括形态学，分类学，生活史等。采集于自然水体的吸管虫在实验室条件下培养，通过体式显微镜和光学显微镜观察该类生物的生活史、活体形态学等特征，用蛋白银染方法揭示其游泳体的纤毛图式，核器结构等结构。出芽斑吸管虫虫体杯状或梨形，活体大小为100250100300M。有吸管状吸管610根，针状吸管3050根。柄
30、中空而透明，长度约为3001600M，通常具有横向环纹和纵向沟纹。大核呈冠状，有不规则分枝。游泳体通常为椭球形或耳状，具马蹄形纤毛区，动基列2233，动基列片断1020，大核为“C”形。对本种的鉴定应基于活体体形和大小，吸管的数目和分布，以及柄的形状等特征。关键词纤毛虫；出芽斑吸管虫；形态学；分类学ABSTRACTHEREISADETAILRESEARCHABOUTEPHELOTAGEMMIPARA,INCLUDINGMORPHOLOGY,TAXONOMYANDLIFEHISTORYTHESAMPLESWERECOLLECTEDFROMINTHENATURALWATERANDCULTUREDI
31、NLABOBSERVATIONOFTHELIFEHISTORY,MORPHOLOGYCHARACTERISTICSOFLIVINGCELLSUSINGSTEREOMICROSCOPEANDOPTICALMICROSCOPEPROTARGOLIMPREGNATIONCANREVEALITSCILIAPATTERNOFSWARMERS,MACRONUCLEUSPYRIFORMORCUPSHAPEDBODYABOUT100250100300MINVIVO,COLORLESSTOBROWNSIXTOTENSUCTORIALTENTACLESAND3050PREHENSILETENTACLESABOUT
32、3001600MLONGHOLLOWEDINTERIORLYSTALKTRANSPARENT,SOMETIMESTRANSVERSELYSTRIATEDORLONGITUDINALLYEDGEDMACRONUCLEUSCROWNSHAPEDANDIRREGULARLYBRANCHEDSWARMERWITHELLIPSOIDALOREARSHAPEDBODY,WITH2233SOMATICKINETIESARRANGEDINHORSESHOESHAPE,FRAGMENTKINETIESABOUT1020ROWS,ANDMACRONUCLEUSCSHAPEDKEYWORDCILIATEEPHELO
33、TAGEMMIPARAMORPHOLOGYTAXONOMY141引言11研究目的及意义随着文明的发展，人类的进步，科学技术的不断发展，生物科学也正式迈入现代生物科学的新时代。现代生物科学的主要研究内容主要包括对生物有机体在分子、细胞或个体水平上通过一定的技术手段进行设计操作，改良物种质量和生命大分子特性等工作。近年来，基因工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术的各个方面都取得了巨大成就，整体研究水平飞速提高。原生动物是最原始的真核生物。其原始性不但表现在结构水平上，即停留在单细胞或其群体的水平，不分化组织；同时表现在营养方式的多样性上，包括自养、异养或混合营养。原生动物的生殖通常为无性生殖，且生
34、殖周期相对于其他高等动物来说十分短暂。虽然原生动物是最原始的真核生物，但其自身即为一完整的生命体，可以独立地执行高等动物所具备的各种基本生理功能，加上其较短的生命周期、取材和培养十分简便、相对于其他高等动物细胞而言，单细胞的原生动物的细胞结构十分复杂，因此，纤毛虫原生动物在许多生物学研究领域被作为最理想的实验材料而广泛应用。吸管类纤毛虫原生动物是纤毛门原生动物中的“另类”，因其生活史复杂，生殖方式为典型的无性出芽生殖。生命周期明确分为成体和幼体阶段，成体与幼体的形态完全不同，如成体通常为以透明中空的柄固附或外栖性生活，体表没有纤毛，管状或针状触手成簇或周身分布，以其他原生动物或小型生物为食；幼
35、体游泳体可自由游泳，全身或部分被有纤毛，无柄和吸管，其形态与纤毛门其他类群十分相似陈相瑞，2009。吸管类纤毛虫的生物学特点决定其可作为良好的实验生物，通过动物发生率原理揭示生物进化中的一系列问题。12研究历史、现状及趋势有关纤毛虫的研究可追溯到17世纪后期，1674年列文虎克用自制显微镜首次发现并描述了各类纤毛虫，至今己有300多年的历史宁应之等，1996。对土壤纤毛虫的研究起始于1838年，由EHRENBERG首次发现并描述了一些土壤纤毛虫种类（EHRENBERG，1838）。随后MARTIN、SANDON、KAHL等相关学者不断研究探索并陆续发表了有关土壤纤毛虫分类学和生态学的研究成果，
36、使信息不断完善，更具系统性。20世纪60年代以前，国际上对纤毛虫的研究处于“经典期”，即只对虫体大小、外形、行为等方面的特征进行观察研究。到6070年代，国际间对纤毛虫的研究工作进入“转型期”，即由经典的建立在活体观察水平上的研究转入到应用现代技术对“纤毛图式”、超微结构以及分子生物学特征等进行揭示，取得了阶段性的发展（宋微波等，2000）。80年代后，生物学家在纤毛虫分类学研究中开始应用电镜技术，尤其是进入21世纪后，分子生物学手段的广泛运用，对纤毛虫研究多年来遗留下来的大量混乱和错误的清理提供了有利的帮助。我国对纤毛虫研究起步于本世纪20年代，生物学家开始主要在黄海至南海的广大海域15对各
37、类自由生活以及海胆体内共栖生活的纤毛虫之分类学、地理分布及生态学等领域进行开拓性的工作（宋微波等，2009）。但由于生物技术、现有研究资料与研究背景等方面的限制，对纤毛类原生动物的研究相对落后，仍处于初级阶段，所涉及的内容仅限于形态分类学、系统学、细胞发生学、病害学和生态学等几个方面，很多方向尚未得到开发。吸管类纤毛虫的研究历史迄今约有250年的历史，对该类生物的研究最早见于PALLAS（1766）对结节壳吸管虫的描述，在随后的200多年中，国外大量学者通过经典研究手段对该类群进行了较为系统和详细的研究。纤毛虫原生动物的研究自上世纪50年代进入新阶段，主要是各种银染方法的运用，以及70年代后扫
38、描、投射电镜等现代生物技术的运用，使该类生物的研究飞速发展。但吸管类纤毛虫处于成体阶段时，体表无纤毛，结构相对简单，不同种间在特征方面又有很大的相似性，而蛋白银等现代银染技术应用于该类群的分类学中还有很多难处，因此使其研究工作一直滞留于传统方法活体或固定样品进行观察。早期分类学依据吸管虫的形态学（触手位置，是否具外壳，是否有柄等）将其分为七个科，而近年来生物学家则根据其无性生殖的芽体形成方式不同进行分类，共分为三类一类为外出芽方式的外生亚目，一类为内出芽方式的内生亚目，一类为外翻亚目。GUICHER（1951）通过经典手段对吸管类纤毛虫的外翻亚目做了相对系统的研究，MATTHES（1988）等
39、人在前人的基础上，对历史资料与其自身研究成果进行了整理与理清，完成了该类群的唯一一本巨著SUCTORIAUNDURCEOLARIIDAE。我国对该类生物的研究一直为空白，直到本世纪初方见零星报道。如陈相瑞等人在2005年对青岛沿海生境内吸管虫原生动物的动物区系做了相对完善的研究，吴利、陈相瑞等于2006年对武汉东湖淡水水体内若干类吸管虫的形态学做了简单描述。2吸管类纤毛虫的特征吸管虫在自然界广泛分布，包括淡水和海水的种类，大部分还可附生于其他生物体表ROBERTO,2006RICARDO,2010。吸管虫是纤毛门中高度特化且数量最丰富的类群，约占纤毛虫种类总数的7左右（宋微波等，1999）。在
40、CORLISS的分类系统中，吸管类纤毛虫隶属于纤毛门，动基片纲，吸管亚纲、吸管目（CORLISS，1979）。几乎全部的吸管虫为固附或外栖性生活，无性生殖以出芽为主，根据出芽的三种不同方式，分为外生、内生和外翻3个亚目。由于吸管虫的生殖方式很特殊，所以其生活史可以明确分为成体和幼体两个阶段。成体时体表无纤毛和胞口；部分或周身分布营摄食的管状或针状触手，触手为中空的管状，末端膨大成球状吸盘。触手具有收缩性，能分泌毒液，其上通常生有突出小体，称系缚式刺丝泡，借以捕食其它纤毛虫或它类原生动物（陈相瑞，2009）。多数种类的吸管虫具有无伸缩性的柄。幼体游泳体全身或部分被有纤毛，无柄和吸管，但可自由游泳
41、。该类纤毛虫对环境要求很苛刻，正因为如此，海洋中该类群相对稀少，从EHRENBERG于1833年描述第一种吸管虫结节壳吸管虫至今，约两个世纪所报道的和描述的吸管虫中淡水种类约400种。163实验材料31仪器眉毛笔、吸管、培养皿、载玻片、盖玻片、多孔凹玻片、胚胎皿、解剖镜、光学显微镜、微分干涉显微镜、加热板。32试剂冰醋酸CH3COOH甲醛HCHO乙醇C2H5OH苦味酸NO23C8H2OH氯化高汞（HGCL2）亚硫酸钠NA2SO4对苯二酚（C4H4O2）甘油C3H8O4麝香草酚C10H14O次氯酸钠NACLO硫代硫酸钠NA2S2O3硝酸银AGNO3二甲苯（C8H10）凡士林4实验方法41标本采集
42、411采集工具准备1500和1000ML广口瓶各一个，用于盛放载玻片的染色缸数量视采集点设置而定；2装PFU海绵块约7X7X7CM的密闭塑料袋或具盖水桶一个；3另准备拖浮网，若干个由培养皿改制成的潮湿房分离培养用。412采集地点采集地点为胶州湾养殖区。413标本采集在本工作中，我们针对的是周丛生吸管虫，借用PFU块或载玻片框法进行采集。应用载玻片框时，选择游人不易到达处，将框沉入水中可视情况选择不同深水层悬置并作好标记。通常视水中虫体多寡而让其在水中暴露1至数周。取出时应尽量避免搅动，以染色缸取原位水小心将玻片插入缸内带回。借用PFU块进行采集时，海绵块PFU应事先坠以重物，浸入水中后挤干内部
43、的气泡。根据需要调节海绵块的深度，上端固定于水面标志物上。还需注意1需先行视水质状况而选择放置日期；2浸入水中需先行反复挤压数次以去除气泡。1742分离由于虫体经采集后是一非正常的、高度浓缩了的群落结构，因此分离和处理应力争在数小时内进行，以避免所获种类消亡。在解剖镜下进行，根据虫体的大小而选用不同口径的微吸管将所需虫体挑选至已备好的培养皿或多孔凹玻片内对于虫体数量不多时推荐后者。当用多孔凹玻片分离虫体时，为防止干涸，分离后的玻片即应置于潮湿房内。如不能立刻分离时，则加培养水或清洁水至样品内至少等量以稀释并暂时于低于原水环境510的培养箱内保存此步不应超过24小时。一经分离后即刻应对分离标本进
44、行编号，以备查。编号为年月日序号201010231；201010232，同时标明采集人、地点、主要生境特征（如温度、盐度等）等。分离后，从次日起每日对所分离虫体进行检查，以了解存活情况，同时在必要时进行剔除杂质、其他混入生物等，必要时应及时转移培养水体，补充饵料或进一步的分离、纯化工作。分离后的原始水样应力求较长时间地保存，目的在于发现其他数量较少而尚未被发现的种类。故保持每日镜检12次的频度。对此水样在必要时应做稀释（如高污染或过富水样）或适当的降温处理（如原来水体如此）。43培养根据培养虫体的单一程度可至少将培养类型分为三种，即粗培养，纯培养和克隆培养，本实验是对吸管虫生态学研究的种类鉴定
45、，我们采用粗培养法直接吸取原采集样入培养皿中，镜下去除大型后生动物及多余的沉积物，加适量米粒或剪开的麦粒以致富细菌水较富时也可不加。然后每日检查12次，以清除某些快速繁殖的不欲保留的种类，并每日更新约半量的培养水。44活体观察活体观察方法主要用以获取纤毛虫活体细胞的分类学特征，包括大小、外形、运动特征、纤毛器、伸缩泡、食物泡、内质颗粒及射出体等,以弥补单纯染色的不足。441具体步骤1用毛细吸管吸一小滴虫体于载玻片上，加盖玻片四周涂以少许凡士林以避免直接压在虫体上；2观察与标本原始数据的记录（采集地、日期、编号）在低倍镜下测量应至少选取大、中、小三个不同个体以得到虫体变幅的信息，观察并记录虫体的
46、大小、外形、运动特征；3中倍镜下观察轻压盖玻片以减缓虫体运动纤毛及纤毛器、伸缩泡、内质情况、色素体的有无及体色；4油镜下观察轻压盖玻片至虫体无法运动为止，此时应特别注意细胞的表膜结构、18纤毛特征、射出体的有无/分布/形态、伸缩泡的形成及变化过程、食物泡和内质/表膜下颗粒分布特点等分类学特征。442活体观察记录在记录用纸上对所观察标本予以编号（如201012501）（同时尽可能给出一日后可辨别的名称）采集人，地点，日期，生境特征（盐度、水温、PH等）。体长体宽应至少选取大、中、小三个不同个体推荐观察不少于5个个体。A在低倍镜下观察并记录（10X物镜）绘多幅小图分别显示观察到的虫体特征，拍照。B
47、在中倍镜下观察并记录（2040X物镜）伸缩泡、内质情况、色素体的有无及体色。纤毛器分布特征、长度等。C在油镜下观察并记录（100X物镜）注意细胞的表膜结构，如射出体的有无/分布/形态、皮层下颗粒分布特点等、纤毛器特征、伸缩泡的形成及变化过程、食物泡、确定虫体体色来源、内质（结晶体），必要时拍照。45蛋白银染色蛋白银染色技术最早为一组织染色法，BODION于1937年首先将之应用于原生动物上，经过几十年来不断的改进，已成为纤毛虫纤毛图式显示的最重要和最基本的方法。本方法主要用以显示虫体的皮层及内部结构，如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维系统等，而银线系统则不被染色。本实验我们采用WILBE
48、RT之蛋白银法。451试剂配制1BOUIN液3份冰醋酸CH3COOH，1份甲醛溶液HCHO，15份苦味酸NO23C8H2OH；2饱和升汞液氯化高汞HGC12溶于水制成饱和溶液；3显影液100ML蒸馏水，01G对苯二酚（C4H4O2），5G亚硫酸钠NA2SO4；4蛋白胶蛋清滤液加等量甘油C3H8O4，放少许麝香草酚C10H14O，05保存。452具体步骤1用BOUIN液或饱和升汞HGCL2将虫体于胚胎皿中固定510MIN；2用蒸馏水洗34次BOUIN液以水洗至无色为准；3以最细微吸管小心将虫体“吹”至胚胎皿中心；4用0102的次氯酸钠NACLO微量直接供至虫体处以漂白至“透明”约12MIN用HG
49、CL2固定时，标本往往漂白效果略差；195蒸馏水洗两次清洗完全为止；6将胚胎皿中蛋白银浓度控制在约05，加盖后在5060的加热板上保持3050MIN视不同种类的嗜染状况及虫体大小而调整时间；7用0102的显影液在室温下显影15MIN或更短；8镜检结束，用5的硫代硫酸钠NA2S2O3定影约5MIN；9蒸馏水洗一次此时应清洁虫体，将虫体转入载玻片上并与等量的蛋白胶混匀，用眉毛笔调体位在必要时如需腹面朝上等，除去余液，至加热板烘片约10MIN；10常规脱水封片70酒精起809095100100无水酒精和二甲苯混合液11二甲苯二甲苯，以上过程每步约25MIN,其中在无水酒精中每步应不少于5MIN，以确保彻底脱水。5结果与讨论51出芽斑吸管虫511形态学描述出芽斑吸管虫成体组成包括了一长柄。活体大小约为100400100300M，但一般梨状图1B；3A，C，E。最宽部分在前端，逐渐朝着尾部缩小，圆形或稍扁平状断面。具有两种类型的吸管58根指状吸管，长约20到30M，有收缩性，通常集中于身体顶端的地区图1B；3A，C，E；3050根针状吸管的触手达200M，细长而尖锐。在活体观察中我们观察到很多虫体表面有大量的球形颗粒，通常聚集在虫体的上半部分，围绕吸管状触手呈冠状分布图1B；3A。柄是透明的，而中空，长约300160
