1、1本科毕业论文系列开题报告生物技术甬江中下游两种自由生纤毛虫形态学研究一、选题的背景与意义甬江水系为浙江省八大水系之一，发源于奉化、新昌和嵊州交界的乌山。上游称剡江，中游称奉化江，在宁波市区以下始称甬江，在镇海口外游山注入东海,是宁波的母亲河，干流总长106KM，流域面积5400KM2。原生动物在动物界中属于最原始、最低等的单细胞动物，它们身体通常较微小，一般长度在100300UM之间。原生动物的种类繁多，如今记载的种类已逾65000种，其中至少有半数为现存种。原生动物结构简单，生命周期短，对污染反应迅速，水体环境的突然变化能及时从原生动物群落的变化上反映出来。原生动物除了可以在自然水域中广泛
2、分布外，还可以在处理废水和污水时建立起来的人工体系中栖居。在污水处理的人工体系中，原生动物的种类及数量与生物处理的效果有着密切的关系，因此，原生动物又可以用来作为污水处理的指示生物。原生动物与细菌之间存在相互依存的功能关系，直接观察原生动物的种类组成和生长，不仅能反映出细菌的生长情况，也能间接地监测出水质，起着指示的作用。利用化学综合污染指数这一普遍接受的水质化学评价方法，将原生动物对污染的反映属性直接建立在化学参数的基础之上，从而更客观地反映出水质的状况。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容；1、定期对甬江中下游水体中的纤毛虫进行采集；2、光学显微镜观察目标生物的活体形态；3、
3、对纤毛虫原生动物的活体形态与染色后得到的结构进行种类确定；4、了解纤毛虫对甬江水体的影响；拟解决的主要问题1、纤毛虫的分离与培养；22、蛋白银法染色技术；三、研究的方法与技术路线研究方法1、采集工具准备准备500和1000ML广口瓶各一,用于盛放载玻片的染色缸数量视采集点设置而定,装PFU海绵块约7X7X7CM的密闭塑料袋或具盖水桶等,拖浮网，同时还应准备若干个由培养皿改制成的潮湿房以备用分离培养用。2、标本采集在浅的水体如水塘、河沟、浅滩或潮间带的积水处,可先用木杆将水搅动,至底层沉积物泛起后以大广口瓶采水,并应捞取若干地点之植物茎叶或漂浮物枯叶、败絮等。3、分离与培养分离根据虫体的大小而选
4、用不同口径的微吸管将所需虫体挑选至已备好的培养皿或多孔凹玻片内对于虫体数量不多时推荐后者。当用多孔凹玻片分离虫体时,为防止干涸，分离后的玻片即应置于潮湿房内。可视情况选择不同的培养方式如不能立刻分离时,则建议加培养水或清洁水至样品内至少等量以稀释并暂于低于原水环境510的培养箱内保存但此步不应超过24小时。对土壤样本则可取土样数克入1012CM之培养皿内,加入培养水,24小时后解剖镜下观察,或将水以纱布滤出后观察,并挑取虫体进行分离。一经分离后即刻应对分离标本进行编号，以备查。培养根据培养虫体的单一程度可至少将培养类型分为三种,即粗培养,纯培养和克隆培养,使用者可根据所需选取其适用的方式。一般
5、说来，对于做分类区系或生态学研究中的种类鉴定时,可优先考虑选用前两者，而从事分子生物学、细胞发生、种下关系的研究或存疑种的鉴定时则可主要采用后两种方法。1、活体观察用毛细吸管吸一小滴虫体液量尽可能少以将盖玻片压至极限而水不至于自四边溢出为度于载玻片上,加盖玻片四周涂以少许凡士林以避免直接压在虫体上；观察与标本原始数据的记录（采集地、日期、编号），在低倍镜下测量应至少选取大、中、小三个不同个体以得到虫体变幅的信息,观察并记录虫体的大小、外形尤其应注意个体间的外形差异,同一个体之外形变化以及同一虫体之具体不同部位的变化特征、运动特征主要包括虫体运动特征，纤毛器的运动特征，游泳的体位变化中倍镜下观察
6、轻压盖玻片以减缓虫体运动纤毛及纤毛器长度,分布和排列特征等,伸缩泡位置/数目以及形成过程，排空间歇时间，3有无收集管等、内质情况有无特殊的油球、空泡、结晶体、食物泡数目/分布特征等、色素体的有无及体色。油镜下观察轻压盖玻片至虫体无法运动为止,此时应特别注意细胞的表膜结构、纤毛特征、射出体的有无/分布/形态、伸缩泡的形成及变化过程、食物泡和内质/表膜下颗粒分布特点等分类学特征。观察所用光学显微镜以微分干涉显微镜为最好,如以相差显微镜,推荐正低相差为佳PLPOSITIVELOW,若仅有明视野观察则可通过改变数值光栏以详细观察表膜结构。2、记录在记录用纸上对所观察标本予以编号（如199912501）
7、（同时尽可能给出一日后可辨别的名称）采集人，地点，日期，生境特征（盐度、水温、PH等）体长体宽技术路线4采样点现场测定部分理化因子水温、盐度、PH、溶解氧浮游类群浮游生物网、水样采集器周丛类群PFU法、载玻片框法底栖类群挖取地质、沙子，捞取沉积物原位水样水样瓶密封样品采集样品室内处理理化因子测定氨氮、硝氮、磷酸盐、BOD纤毛虫分离、富集记录种类构成，优势种丰度/生物量形态学观测活体观察、显微图像记录、形态学记录染色制片各种银染法获得纤毛图式、银线系等结构SPSS、PRIMER数据分析特征分析、数据统计处理种类鉴定绘图、数据处理信息整理四、研究的总体安排与进度2010年10月2010年12月1实
8、验前的准备工作查找资料，对实验内容做初步的了解；2实验仪器和药品的准备；3取样；4完成开题报告及任务书。2011年11月2011年2月撰写文献综述及翻译英文文献2011年2月2010年3月撰写初稿。2010年4月2010年5月1初稿经指导老师指正后进行修改和完善；2毕业论文定稿，准备答辩。5五、主要参考文献1张毅强近代兽医原生动物学的分类概况J广西畜牧兽医2005,21288912齐桂兰,刘桂杰常见原生动物纤毛虫的采集、分离与培养J生物学教学,2008,33738393陈琳纤毛虫的生物学基础与危害鱼类的常见种属J福建畜牧兽医,1999,245514PIERCERW,TURNERJTECOLOG
9、YOFPLANKTONICCILIATESINMARINEFOODWEBSJREVAQUATSCI,1992,61391815张毅强近代兽医原生动物学的分类概况J广西畜牧兽医,2005,21288916刘磊简析活性污泥中微生物群体的特征及作用J环境科学与技术,2009,326C5615627科海所海洋原生动物J齐鲁渔业,2007,248608CAMPBELLL,LANDRYLRRESPONSEOFMICROBIALCOMMUNITYSTRUCTURETOENVIRONMENTALFORCINGINTHEARABIANSEAJDEEPSEARESEARCH1998,452230123259李江平
10、,李雯指示生物及其在环境保护中的应用J云南环境科学,2001,201515410范晓鹏,沈韫芬环境因素对原生动物群落特征的影响J应用与环境生物学报,2001,7655444711黄彬,张明凤,陈寅山,许友勤原生动物生物指数在福州市内河水质评价中的运用J福建环境,2003,204293112刘松岩,吴坤杰,田海军原生动物在水体生物监测中的应用研究J信阳农业高等专科学校学报,2007,17311211313王娅宁,施心路,刘桂杰等纤毛原生动物研究的经济意义J生物学杂志,2009,266727514周可新,许木启,曹宏等土壤原生动物在环境监测中的应用J动物学杂志,2003,381808315MART
11、INGONZALEZA,BORNIQUELS,DIAZSULTRASTRUCTURALALTERATIONSINCILIATEDPROTOZOAUNDERHEAVYMETALEXPOSUREJCELLBIOLINT,2005,29211912616沈韫芬,冯伟松,顾曼如河流的污染监测M北京中国建筑工业出版社,199517崔木子,施心路,刘桂杰等原生动物的水质监测及净化作用研究综述J吉首大学学报自然科学版,2008,281909318邢宏,邢光印,张杨水中原生动物对细茵的影响J中国给水排水,2006,22104619林利明,朱延彬,谭石慈利用原生动物的趋化性进行水质生物检测的方法研究J华南师范大
12、学学报自然科学版,1994,4424620许木启,翟家骥,邵永怡利用PFU原生动物群落多样性快速监测北京通惠河水质J动物学杂志,1998,3341721李风超,沈韫芬,刘存歧应用原生动物群落评价枯水期白洋淀的水质现状J生态学杂志,2005,24778578922CAIRNSJJBIDWELLJRTOUCITYTESTINGWITHCOMMUNITIESMICROCOSMSMESOCOSMSANDWHOLESUSTEMMANIPULATIONSJREVENVIRONCONTAMTOXICAL1996,147456923陈声贵，许木启,杨向平等原生动物在活性污泥中的作用J生态学杂志,2002,21
13、3475124LINXIAOFENG,SONGWEIBOREDESCRIPTIONOFTHEMARINECILIATE,CERTESIAQUADRINUCLEATAPROTOZOACILIOPHORAFROMQINGDAO,CHINAJJMARBIOLASSUK,2004,84,1625SONGWEIBO,CHENSHAO,YIZHENZHEN,LILIQIONG,ETALTHEMORPHOLOGY,MORPHOGENESISANDSSRRNAGENESEQUENCEOFANEWMARINECILIATE,DIOPHRYSAPOLIGOTHRIXSPECNOVCILIOPHORAEUPLOTI
14、DAJSCIENCEDIRECT,2009,45,385026刘春龙,李忠秋,孙海霞纤毛虫对反刍动物瘤胃内环境指标、营养物质代谢的影响的研究J家畜生态,2004,25357607毕业论文文献综述生物技术原生动物对水质监测作用的研究进展摘要纤毛虫是原生动物中种类数量最多、个体最大的一个类群，在水生生态系统中，纤毛虫对水体的物质循环起着重要的促进作用，对水体纤毛虫的生态学研究，对全面了解水体中有机物质的循环过程及类群间相互关系、结构与功能的变化等有重要的意义，它的某些种类可作为有机污染的指示生物，应用其种类组成分布特征及优势种的生态耐性，可监测评价水体的污染状况。关键词原生动物；纤毛虫；水质；生物
15、监测；原生动物在动物界中属于最原始、最低等的单细胞动物，它们身体通常较微小，一般长度在100300UM之间。原生动物的种类繁多，如今记载的种类已逾65000种，其中至少有半数为现存种1。常见的纤毛虫有草履虫PARAMECIUM、棘尾虫STYLONYCHIA、喇叭虫STENTOR、钟虫VORTICELLA2等。纤毛虫（CILIATE）是原虫中结构最复杂，种类最多的一个门，包括4700种由生活和2500种营固著生括或寄生的虫种，海水水和淡水中都有分布自由生活种类是浮游生物的组成部分3，如钟虫、游朴虫、棘尾虫等个体较大者，均可作为鱼类的饵料，形成食物链的一大部分基础，也是连接微食物环和经典食物链的重
16、要中介4，故在水系中起着重要作用。1原生动物概述原生动物是动物界中最低等的一类真核单细胞动物，个体一般微小，由单个细胞组成。它们活领域分布的及其广泛，一般在淡水、海水、沼泽甚至潮湿的土壤中均可生存，也有不少寄生在其他动物的体内。原生动物的分类相对复杂，德国学者BUTSCHLI是第一个提出原生动物在单细胞模式基础上的分类系统的人，他把原生动物门划分为4个纲鞭毛虫纲、肉足虫纲、孢子虫纲、纤毛虫纲5。原生动物能用来改善水质、评价和指示污水厂的运行和处理效果6。在水处理工作中常见的主要是3类1肉足虫。它们最主要的特征是虫体的细胞质可以延伸形成伪足，并利用其作为运动和摄食的主要胞器，某些无明显伪足的种类
17、可以利用原生质流进行运动。2鞭毛虫。通常具有一根或一根以上的鞭毛，作为运动的细胞器。鞭毛虫种类繁多，分布很广，生活方式多种多样。营寄生生活的鞭毛虫主要寄生于宿主的消化道、泌尿道、血液及阴道毛滴虫对人体危害较大。3纤毛虫。纤毛虫的体形多样化，是在原生动物中特化程度最高、最为复杂的一大类群。以纤毛为运动胞器8是纤毛虫的主要特征，多数种类终生全身被有纤毛，有的只在生活某一阶段存在纤毛。绝大多数纤毛虫具有一层柔软的表膜和近体表的伸缩泡，虫体可分表膜、胞质和胞棱。纤毛虫分为固着型和游泳型2种，固着型纤毛虫常见的种类有钟虫属、累枝虫属、聚缩虫属等，游泳型则包括草履虫属、肾形虫属、斜管虫属及棘尾虫属等。目前
18、，全球已知纤毛虫约9000种7。原生动物在海洋微食物网及近岸生态系的物质流动与能量传递过程中担当着枢纽作用，因此，长期以来，该类群的种类鉴定一直是制约相关微生态研究的一个瓶颈。有人研究酸度对原生动物群落的影响当酸度达到一定程度，再增大同样会对其产生破坏性影响，其它物理化学因素也是如此8。因此，利用原生动物监测水质可以直接反映出环境质量变化对水生生物的影响及其危害的程度，是实现水环境监测目的的一种最直接而有效的手段。2原生动物的指示作用21环境污染指示指示生物又叫生物指示物，指那些在一定地区范围内，能通过其特性、数量、种类群落等变化，指示其环境或某一环境因子特征的生物9。目前比较经典的生物指数如
19、BECK生物指数、GOODNIGHT和WHITLEY生物指数、TRENT生物指数和CHANDLE计分制等。原生动物结构简单，生命周期短，与它们所生存的环境直接接触，对污染反应迅速。当外部环境存在胁迫时，原生动物群落特征都会发生相应规律性变化10，及时反映出水体环境的突然变化。另外，绝大多数原生动物种类为世界性分布，不受季节和地区差异的限制。黄彬等11用原生动物做指示，来评价福州市内河的环境情况。刘松岩等12也将原生动物应用水体生物的检测中。利用纤毛虫的种类组成分布特征及优势种的生态耐性，不仅可以评价水体的污染状况，还可应用纤毛虫监测土壤环境13。实践表明，纤毛虫可用于检测土壤中的重金属毒性。膨
20、大肾形虫和齿脊肾形虫是土壤中常见的两种纤毛虫，许多毒性实验证明14,它们与其他常用的测试生物一样对环境的变化敏感，甚至更为敏感，因为它们没有保护性的细胞壁，更直接的暴露在周围环境中，与污染物相接触。MARTINGONZALEZ等研究发现，土壤中重金属CD、ZN污染能促进土壤纤毛虫的超微结构变化，使细胞的活动能力受限15。22反映水质状况原生动物与细菌之间存在相互依存的功能关系，直接观察原生动物的种类组成和生长，不仅能反映出细菌的生长情况，也能间接地监测出水质，起着指示的作用。利用化学综合污染指数16这一普遍接受的水质化学评价方法，将原生动物对污染的反映属性直接建立在化学参数的基础之上，从而更客
21、观地反映出水质的状况。在自然环境中，水质较好的水体自养程度高，植物性鞭毛虫所占比9例较高；随着水体有机污染程度的提高，异养程度增加，动物性鞭毛虫所占比例将增加17。原生动物与细菌之间也存在相互依存的功能关系，掠食性的原生动物可以使细菌生长维持在对数生长期，防止细菌种群的衰老，提高细菌酶的活力18。林利明等19曾利用草履虫对不同水质的趋化性，分析它们移动到实验区水样的数目，从而判断水质的污染程度和毒性大小。许木启等20报道了北京通惠河原生动物群落多样性特征与水质的相互关系。李凤超等21应用PFU微型生物群落监测方法，对长期处于低水位状态下的白洋淀水质进行了综合评价。结果表明，白洋淀水域受府河污水
22、的影响，淀内的内源性污染对原生动物群落造成了极大的影响。23生物系统物质循环研究发现，不同生境中的原生动物在食物链中所占据的营养级是不同的，它不仅仅是有机物和碎屑的分解者，细菌、藻类的捕食者和浮游动物的捕食对象，还起到连接具有高生产力的，能保持大量营养成分的微生物圈和后生动物的作用22。因此它在水生态系的物质循环和能量流动中起到十分重要的作用。目前世界上普遍采用活性污泥法进行污水处理，即利用活性污泥中的细菌吸附、氧化分解污染物23。原生动物是活性污泥中细菌的主要捕者，而纤毛虫在运行良好的活性污泥中占原生动物总数70，通过纤毛虫对细菌的捕食作用，使活性污泥中的细菌始终保持在对数生长期，促进生物消
23、耗，减少污泥生成量，所以纤毛虫是活性污泥中最常见也是最重要的捕食者24。在畜牧业方面，瘤胃内的原生动物主要有两个亚类鞭毛虫纲和纤毛虫纲，前者主要存在幼年动物中，后者则是成年反刍动物体内主要的类群，占整个瘤胃微生物生物量308025。纤毛虫在增加瘤胃饱和脂肪酸的含量、维持细菌必需的厌氧环境及降低硝酸盐和亚硝酸盐的致毒作用方面有重要意义26。3展望原生动物群落的变化可以指示和预报水域污染的现状和发展的趋势，我们可以利用它们在水体的变化情况监测水质的变化，在监测评价水质的瞬时变化和长期内的连续变化方面，原生动物作为理想的监测生物具有不可替代的作用。但是由于水质情况复杂，生态系统多种多样，适应能力各不
24、相同，难以确定污染物的性质和含量。因此，在条件许可的情况下，应采取多种方法进行综合监测，以确保监测结果的科学性。参考文献1张毅强近代兽医原生动物学的分类概况J广西畜牧兽医2005,21288912齐桂兰,刘桂杰常见原生动物纤毛虫的采集、分离与培养J生物学教学,2008,33738393陈琳纤毛虫的生物学基础与危害鱼类的常见种属J福建畜牧兽医,1999,245514PIERCERW,TURNERJTECOLOGYOFPLANKTONICCILIATESINMARINEFOODWEBSJREVAQUATSCI,1992,6139181105张毅强近代兽医原生动物学的分类概况J广西畜牧兽医,2005
25、,21288916刘磊简析活性污泥中微生物群体的特征及作用J环境科学与技术,2009,326C5615627科海所海洋原生动物J齐鲁渔业,2007,248608CAMPBELLL,LANDRYLRRESPONSEOFMICROBIALCOMMUNITYSTRUCTURETOENVIRONMENTALFORCINGINTHEARABIANSEAJDEEPSEARESEARCH1998,452230123259李江平,李雯指示生物及其在环境保护中的应用J云南环境科学,2001,201515410范晓鹏,沈韫芬环境因素对原生动物群落特征的影响J应用与环境生物学报,2001,7655444711黄彬,
26、张明凤,陈寅山,许友勤原生动物生物指数在福州市内河水质评价中的运用J福建环境,2003,204293112刘松岩,吴坤杰,田海军原生动物在水体生物监测中的应用研究J信阳农业高等专科学校学报,2007,17311211313王娅宁,施心路,刘桂杰等纤毛原生动物研究的经济意义J生物学杂志,2009,266727514周可新,许木启,曹宏等土壤原生动物在环境监测中的应用J动物学杂志,2003,381808315MARTINGONZALEZA,BORNIQUELS,DIAZSULTRASTRUCTURALALTERATIONSINCILIATEDPROTOZOAUNDERHEAVYMETALEXPOS
27、UREJCELLBIOLINT,2005,29211912616沈韫芬,冯伟松,顾曼如河流的污染监测M北京中国建筑工业出版社,199517崔木子,施心路,刘桂杰等原生动物的水质监测及净化作用研究综述J吉首大学学报自然科学版,2008,281909318邢宏,邢光印,张杨水中原生动物对细茵的影响J中国给水排水,2006,2210419林利明,朱延彬,谭石慈利用原生动物的趋化性进行水质生物检测的方法研究J华南师范大学学报自然科学版,1994,4424620许木启,翟家骥,邵永怡利用PFU原生动物群落多样性快速监测北京通惠河水质J动物学杂志,1998,3341721李风超,沈韫芬,刘存歧应用原生动物
28、群落评价枯水期白洋淀的水质现状J生态学杂志,2005,24778578922CAIRNSJJBIDWELLJRTOUCITYTESTINGWITHCOMMUNITIESMICROCOSMSMESOCOSMSANDWHOLESUSTEMMANIPULATIONSJREVENVIRONCONTAMTOXICAL1996,147456923陈声贵，许木启,杨向平等原生动物在活性污泥中的作用J生态学杂志,2002,213475124LINXIAOFENG,SONGWEIBOREDESCRIPTIONOFTHEMARINECILIATE,CERTESIAQUADRINUCLEATAPROTOZOACIL
29、IOPHORAFROMQINGDAO,CHINAJJMARBIOLASSUK,2004,84,161125SONGWEIBO,CHENSHAO,YIZHENZHEN,LILIQIONG,ETALTHEMORPHOLOGY,MORPHOGENESISANDSSRRNAGENESEQUENCEOFANEWMARINECILIATE,DIOPHRYSAPOLIGOTHRIXSPECNOVCILIOPHORAEUPLOTIDAJSCIENCEDIRECT,2009,45,385026刘春龙,李忠秋,孙海霞纤毛虫对反刍动物瘤胃内环境指标、营养物质代谢的影响的研究J家畜生态,2004,253576012本
30、科毕业设计（20_届）甬江中下游两种纤毛虫的形态研究目录1引言111环境污染指示112反映水质状况113生物系统物质循环12实验方法与材料221采样2211采集工具准备2212采集地点和时间2213采集标本222分离与培养2221分离2223培养223活体观察224染色观察3241蛋白银法3242银氨染色法33结果与分析331相似瓦榴弹虫PINACOCOLEPSSIMILISKAHL,19333311形态描述3312分析比较432东方诺兰德虫NOLANDIAORIENTALIS6321形态描述6322分析比较64讨论11致谢11参考文献12摘要甬江水系为浙江七大水系之一，流域面积约占宁波总面积
31、的48，为浙东地区的重要水资源。随着经济的发展及城市人口的急剧增长，工业废水与生活污水的无序排放对该水系的生态系统造成巨大损害。纤毛虫原生动物作为良好的生物指示种，在环境监测中扮演重要角色，但关于甬江水体内纤毛虫原生动物的研究少有报道。鉴于此，我们开展了对该水体内纤毛虫的种类构成、群落结构的变化等研究。本文主要对两种纤毛虫，PINACOCOLEPSSIMILISKAHL,1933相似瓦榴弹虫与NOLANDIAORIENTALIS东方诺兰德虫，进行详尽的形态描述，主要内容包括活体形态、蛋白银与氨银法染色后得到纤毛图式、大核形状等特征。关键词甬江原生动物；纤毛虫；形态描述。ABSTRACTYONG
32、JIANGRIVERISONEOFTHESEVENMAJORRIVERSYSTEMSINZHEJIANGPROVINCE,THEDRAINAGEAREAAPPROXIMATELYCOMPOSESTHENINGBOTOTALAREA48,WHICHISAIMPORTANTWATERRESOURCEFORTHEEASTERNZHEJIANGPROVINCEWITHECONOMICDEVELOPMENTANDRAPIDGROWTHOFURBANPOPULATION,INDUSTRIALWASTEWATERANDDOMESTICSEWAGEDISCHARGEOFTHEWATERSYSTEMDISORD
33、ERCAUSEDENORMOUSDAMAGETOTHEECOSYSTEMCILIATEISAGOODBIOLOGICALINDICATORSPECIESANDPLAYANIMPORTANTROLEINMONITORINGINTHEENVIRONMENTHOWEVER,THEREAREONLYFEWREPORTSABOUTCILIATESINTHEYONGJIANGRIVERINVIEWOFTHIS,WECARRIEDOUTTHESTUDIESABOUTTHECILIATEDCOMPOSITIONANDCOMMUNITYSTRUCTURETHISARTICLEMAINLYDESCRIBEDTHE
34、MORPHOLOGYANDINFRACILIATUREOFTWOCILIATESPINACOCOLEPSSIMILISKAHL,1933,NOLANDIAORIENTALIS,INCLUDINGTHEMORPHOLOGYINVIVO,THEINFRACILIATUREAFTERSILVERCARBONATEIMPREGNATIONANDAFTERPROTARGOLIMPREGNATION,THEMACRONUCLEARSHAPEANDOTHERFEATURESKEYWORDSYONGJIANGRIVERPROTOZOACILIATEMORPHOLOGICALDESCRIPTION11引言甬江水
35、系为浙江省七大水系之一1，发源于奉化、新昌和嵊州交界的乌山。上游称剡江，中游称奉化江，在宁波市区以下始称甬江，在镇海口外游山注入东海,是宁波的母亲河，干流总长106KM，流域面积5400KM2。甬江流域是浙江省城市化程度最高、经济最发达地区之一，随着经济的发展和城市化进程的推进，流域的水资源问题日益严重2，导致生物多样性的降低。而原生动物与细菌之间存在相互依存的功能关系，直接观察原生动物的种类组成和生长，不仅能反映出细菌的生长情况，也能间接地监测出水质，起着指示的作用。近20年来，我国纤毛虫的研究已取得了长足的进展，但至今为止，还没有任合有关甬江纤毛虫类的研究。11环境污染指示指示生物又叫生物
36、指示物，指那些在一定地区范围内，能通过其特性、数量、种类群落等变化，指示其环境或某一环境因子特征的生物3。目前比较经典的生物指数如BECK生物指数、GOODNIGHT和WHITLEY生物指数、TRENT生物指数和CHANDLE计分制等。原生动物结构简单，生命周期短，与它们所生存的环境直接接触，对污染反应迅速。当外部环境存在胁迫时，原生动物群落特征都会发生相应规律性变化4，及时反映出水体环境的突然变化。另外，绝大多数原生动物种类为世界性分布，不受季节和地区差异的限制。黄彬等5用原生动物做指示，来评价福州市内河的环境情况。刘松岩等6也将原生动物应用水体生物的检测中。利用纤毛虫的种类组成分布特征及优
37、势种的生态耐性，不仅可以评价水体的污染状况，还可应用纤毛虫监测土壤环境7。实践表明，纤毛虫可用于检测土壤中的重金属毒性。膨大肾形虫和齿脊肾形虫是土壤中常见的两种纤毛虫，许多毒性实验证明8,它们与其他常用的测试生物一样对环境的变化敏感，甚至更为敏感，因为它们没有保护性的细胞壁，更直接的暴露在周围环境中，与污染物相接触。MARTIN等2005研究发现，土壤中重金属CD、ZN污染能促进土壤纤毛虫的超微结构变化，使细胞的活动能力受限9。12反映水质状况原生动物与细菌之间存在相互依存的功能关系，直接观察原生动物的种类组成和生长，不仅能反映出细菌的生长情况，也能间接地监测出水质，起着指示的作用。利用化学综
38、合污染指数10这一普遍接受的水质化学评价方法，将原生动物对污染的反映属性直接建立在化学参数的基础之上，从而更客观地反映出水质的状况。在自然环境中，水质较好的水体自养程度高，植物性鞭毛虫所占比例较高；随着水体有机污染程度的提高，异养程度增加，动物性鞭毛虫所占比例将增加11。原生动物与细菌之间也存在相互依存的功能关系，掠食性的原生动物可以使细菌生长维持在对数生长期，防止细菌种群的衰老，提高细菌酶的活力12。林利明等199413曾利用草履虫对不同水质的趋化性，分析它们移动到实验区水样的数目，从而判断水质的污染程度和毒性大小。许木启等199814报道了北京通惠河原生动物群落多样性特征与水质的相互关系。
39、李凤超等200515应用PFU微型生物群落监测方法，对长期处于低水位状态下的白洋淀水质进行了综合评价。结果表明，白洋淀水域受府河污水的影响，淀内的内源性污染对原生动物群落造成了极大的影响。13生物系统物质循环研究发现，不同生境中的原生动物在食物链中所占据的营养级是不同的，它不仅仅是有机物和碎屑的分解者，细菌、藻类的捕食者和浮游动物的捕食对象，还起到连接具有高生产力的，能保持大量营养成分的微生物圈和后生动物的作用16。因此它在水生态系的物质循环和能量流动中起到十分重要的作用。目前世界上普遍采用活性污泥法进行污水处理，即利用活性污泥中的细菌吸附、氧化分解污染物17。原生动物是活性污泥中细菌的主要捕
40、者，而纤毛虫在运行良好的活性污泥中占原生动物总数70，通过纤毛虫对细菌的捕食作用，使活性污泥中的细菌始终保持在对数生长期，促进生物消耗，减少污泥生成量，所以纤毛虫是活性污泥中最常见也是最重要的捕食者。在畜牧业方面，瘤胃内的原生动物主要有两个亚类鞭毛虫纲和纤毛虫纲，前者主要存在幼年动物中，后者则是成年反刍动物体内主要的类群，占整个瘤胃微生物生2物量3080。纤毛虫在增加瘤胃饱和脂肪酸的含量、维持细菌必需的厌氧环境及降低硝酸盐和亚硝酸盐的致毒作用方面有重要意义18。2实验方法与材料实验主要步骤是采样，分离培养，活体观察，染色观察，数据记录。21采样211采集工具准备准备500和1000ML广口瓶各
41、一,用于盛放载玻片的染色缸,装PFU海绵块约7X7X7CM的具盖水桶等,拖浮网以及若干个由培养皿改制成的潮湿房以备用分离培养用。为进行定量研究,备有浮游生物计数框、水样采集器（510升）及量筒5001000ML等。对于浮游生种类我们准备约2050M孔径的小型微孔浮游生物网；水样采集器；PFU。对于周丛生种类以及固着生种类我们对前者仍可用PFU块进行采集,而后者则需用载玻片框。培养和分离用水是选取洁净的自然水,并经加热至80即可,冷却充气后封口保存备用212采集地点和时间于2011年3月15日4月15日在甬江中下游宁波大学南侧江段。213采集标本在浅的水体浅滩的积水处,用木杆将水搅动,至底层沉积
42、物泛起后以大广口瓶采水,并应捞取若干漂浮物枯叶、败絮等。采用浮游生物网,在水中经若干次来回拖捕以富集虫体。所获之虫体水样在瓶内不应装得过满,以免造成水体缺氧。用载玻片框，将框沉入水中并作好标记。通常视水中虫体多寡而让其在水中暴露1至数周。取出时应尽量避免搅动，以染色缸取原位水小心将玻片插入缸内带回。海绵块PFU坠以重物,浸入水中后挤干内部的气泡（浸入水中需先行反复挤压数次以去除气泡）。调节海绵块的深度，上端固定于水面标志物上。22分离与培养由于虫体经采集后是一非正常的、高度浓缩了的群落结构，因此我们在分离和处理时力争在数小时内进行,以避免所获种类消亡。221分离解剖镜下进行,根据虫体的大小而选
43、用不同口径的微吸管将所需虫体挑选至已备好的多孔凹玻片内。当用多孔凹玻片分离虫体时,为防止干涸，分离后的玻片立即置于潮湿房内。当我们不能立刻分离时,则加培养水至样品内以稀释并暂于低于原水环境510的培养箱内保存但此步不应超过24小时。223培养根据培养虫体的单一程度可至少将培养类型分为三种,即粗培养,纯培养和克隆培养,我们选用粗培养。粗培养直接吸取原采集样入培养皿中,镜下去除大型后生动物及多余的沉积物,加适量米粒或剪开的麦粒以致富细菌水较富时也可不加。通常可每日检查12次,以清除某些快速繁殖的不欲保留的种类,并每日更新约半量的培养水。此种培养对于不易建立纯培养的种类或小型种类特别值得提倡。此外当
44、培养水体中种类较丰富而个体数量总数量不大时,均可采取此方法以达到富集虫体且最大限度地保存各种的目的。此方法由于虫体生活在原来的水环境内,较之纯培养更易于全面地检获和保存标本,因此也更多地应用于对某生境所有种类的构成研究上。23活体观察活体观察方法主要用以获取纤毛虫活体细胞大小、外形、运动、纤毛器、伸缩泡、食物泡、内质颗粒3及射出体等特征,以弥补单纯染色的不足。具体步骤用毛细吸管吸一小滴虫体于载玻片上，加盖玻片四周涂以少许凡士林以避免直接压在虫体上；观察与标本原始数据的记录。在低倍镜下测量，观察并记录虫体的大小、外形、运动特征；中倍镜下观察，纤毛及纤毛器的长度,分布和排列特征等；伸缩泡的位置，数
45、目以及形成过程，排空间歇时间，有无收集管等；内质中有无特殊的油球、空泡、结晶体、食物泡数目和分布特征等；色素体的有无及体色。油镜下观察，我们特别注意细胞的表膜结构，纤毛特征，射出体的有无、分布和形态，伸缩泡的形成及变化过程，食物泡和内质，表膜下颗粒分布特点等分类学特征。24染色观察本次实验中一共用到两种染色方法蛋白银染色法和氨银染色法。241蛋白银法蛋白银染色技术最早为一组织染色法,BODION1937年首先将之应用于原生动物上，经过几十年来不断的改进，已成为纤毛虫纤毛图式显示的最重要和最基本的方法。本方法对大部分纤毛虫的染色效果极佳，但对于咽膜类、肾形类及篮环目等类群则常常不够理想。其主要用
46、以显示虫体的皮层及内部结构，如纤毛下器、毛基体、核器及各种表膜下纤维系统等，而银线系统则不被染色。具体步骤1将虫体于胚胎皿中用BOUIN液或饱和升汞HGCL2固定510MIN；2蒸馏水洗34次BOUIN液以水洗至无色为准；3以最细微吸管小心将虫体“吹”至胚胎皿中心；4用0102的次氯酸钠NACLO微量直接供至虫体处以漂白至“透明”约12MIN；5蒸馏水洗两次以清洗完全为度；6将胚胎皿中蛋白银浓度控制在约05，加盖后于5060的恒温箱底板上保持30MIN；7室温下用0102的显影液显影15MIN；8镜检后用5的硫代硫酸钠NA2S2O3定影约5MIN；9蒸馏水洗一次此时应清洁虫体，将虫体转入载玻片
47、上并与等量的蛋白胶混匀，用眉毛笔调体位，除去余液，至温箱烘片约10MIN；10常规脱水封片。242银氨染色法又名碳酸银染色法。此染色法的突出特点是快速简便，显示功能强，应用得当时可在十几分钟内得到高质量的类似蛋白银的染色效果。这对于许多不易用蛋白银染色的种类如大部分咽膜目类，肾形目类及篮环目类尤其突出。具体步骤（1）在凹玻片中加一滴10福尔马林（4甲醛），然后加一滴虫体悬液，静置1MIN；（2）于其中加入一滴FERNANDEZGALIANO液；（3）将凹玻片置于约60的电热板上，不停振动；（4）待溶液由黄色变为棕色时，约5MIN，加一滴冷水或硫代硫酸钠溶液终止显影；（5）镜检，拍照；（6）清洗
48、后入载玻片加等量的蛋白胶混匀，调体位，除余夜后烘片约510MIN；（7）常规脱水封片。3结果与分析31相似瓦榴弹虫PINACOCOLEPSSIMILISKAHL,1933311形态描述大部分活体体长和形状相近，大约55652030M，卵圆型或圆筒形，横向面为圆形。横向面的前末端较短且第二层盔板的前末端像个皇冠般尖锐化；其后末端明显钝圆（图1A,2AD）。射出体呈杆形，长约3005M，主要位于口区，由于十分小且数目较少，所以很难观察到（图1K）。无色的细胞质中经常有若干个灰色至褐色的食物泡（直径最大可达15M）和颗粒（在28M）。一个大小1210M的椭圆形大核，多数位于身体中部，而且有一个连接紧
49、密的小核（图1A,2M,N）。身体末端有一个直径大约1015M收缩液泡，排泄孔位于身体的尾部（图1A,CE,2H）。游泳速度快，有时沿底层爬行。相似瓦榴弹虫的盔板分6层排布围口层，前端的次二层，前端主层，后端主层，后端次二层和尾层。每层平均由15个无色长方形盔板组成，且大多数盔板的形状大小相同。围口层几乎在活体中很难辨认。前端次二层有两个尖锐的尖刺（图1A,B,2G）。前端主层，后端主层和后端次二层没有独特性。尾层只能在间接或极后端的视图中才能看到，且尾端有一些56M长的尾端刺毛（图1A,2AD,I）。盔板中比较精细4的结构在图1B,2EG中盔板无开口；靠近右侧边缘的脊光滑且发达；右侧边缘的一系列长齿与脊没有相连；左侧边缘的曲线非常平滑和细长。口位于细胞顶端。围口动基列是由配对的毛基体组成的，此动基列被三个口区细胞器打断（图1E,2K）。口区细胞器短，斜向排布（图1E）细胞器1由4对的毛基粒组成；细胞器2和3都由三对的毛基粒组成。活体口腔筐不明显，通过蛋白银染法可看到其长大约1520M（图1K,2K）。躯体纤毛长度约10M并有规则的排布，平均的组成14个横环和15个纵列（表1）。在顶端的每纵列有4个成对紧密分布的毛基粒出现（图1E,K,2K）。在尾部有一明显（长约25M）的纤毛（图1A,2A,D）。312分析比较根据FOI
