1、实验一 多克隆抗体制备,微生物与免疫教研室周芳美,一、实验目的,掌握多抗制备的原理和过程熟悉常用的佐剂掌握福氏完全佐剂的作用机理和制备方法掌握研磨法和注射器法制备免疫乳剂，掌握制备成功的判别标准掌握动物的免疫方法,二、实验原理,抗体：介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原激活后增殖分化为浆细胞所合成分泌的一类能与相应抗原特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。单克隆抗体：抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇激活具有相应抗原受体的B细胞产生的针对这一抗原决定簇的抗体，称为,天然抗原分子中常含有多种不同抗原特异性的抗原表位，以该抗原物质刺激机体免疫系统，体内多个B细胞克隆被激活，产
2、生的抗体中含有针对多种不同抗原表位的免疫球蛋白，称为多克隆抗体。,多克隆抗体,多克隆抗体制备的意义,免疫血清：将抗原注入机体所产生的抗体是针对多种抗原决定簇的混合抗体，含有这种特异性抗体的血清。免疫血清作用：对传染病的诊断、预防和治疗有重要意义，而且对器官移植，肿瘤以及某些科研工作也有重要意义。,多克隆抗体优缺点： 优点 ：作用全面，具有中和抗原，免疫调理，介导补体介导的细胞毒作用，ADCC等作用，来源广泛，制备容易。 缺点：特异性不高，易发生交叉反应，从而应用受限。,三、实验试剂与材料,动物：健康家兔抗原：生化大实验中制备的LDL佐剂：弗氏佐剂注射器、研钵 等,动物的选择,动物的选择常根据抗
3、体的用途和量来决定，也与抗原的性质有关如要获得大剂量的抗体，则采用大动物；如要获得直接标记诊断用的抗体，则直接采用本动物；如要获得间接的标记诊断用抗体，则必须用异源动物制备抗体,动物的选择,如果难以获得的抗原，且抗体的需要量少，则可以采用纯系小鼠制备免疫用的动物最好选择适龄的健康雄性动物，免疫时应同时选用数只动物进行免疫一般实验室采用的抗体，多用兔子和羊；,抗原,就其化学成分而言，有蛋白质抗原、类脂抗原、多糖类抗原和核酸抗原等.根据物理性状可分为颗粒型抗原和可溶性抗原。就抗原性而言，有完全抗原和不完全抗原。为了获得较好的抗血清，最好是选用蛋白质抗原,不同的抗原，其免疫原性的强弱均不相同，这种免
4、疫原性的强弱取决于抗原的分子量、化学活性基团、立体结构、物理形状和弥散速度等本次实验采用抗原是生科大实验制备的LDL（至少有2mg，如量不够则用牛血清白蛋白），用生理盐水溶解。,抗原剂量的选择,抗原的免疫剂量依照给予抗原的种类，免疫次数，注射途径，以及受体动物的种类，免疫周期及所要求的抗体特性等而不同。剂量过低，不能形成足够强的免疫刺激剂量过高，有可能造成耐受在一定范围内，抗体效价随注射抗原的剂量而增高。,抗原剂量的选择,小鼠首次抗原剂量为：50-400g/次大鼠为100-1000g/次兔子为200-1000g/次加强免疫的剂量为首次剂量的1/5-2/5,佐剂,概念：预先与抗原同时注入体内，可
5、增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答类型的非特异性免疫增强性物质。种类：一种本身具有免疫原性，如百日咳杆菌、抗酸杆菌（结核分枝杆菌）以及革兰阴性杆菌等；另一种本身无免疫原性，如氢氧化铝、磷酸钙、矿物油乳剂、表面活性剂等。目前应用最多的是弗氏佐剂。,佐剂,佐剂的条件作为一种良好的佐剂，必须具备下列条件： （1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性； （2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，减低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体； （3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫、细胞免疫和非
6、特异性免疫功能； （4）良好的佐剂应具有无毒性或副作用低的特点。,佐剂,主要作用机制：改变抗原物理性状，延缓抗原的降解和排除，延长抗原在体内滞留的时间刺激单核-巨噬细胞系统，增强其对抗原的处理和提呈能力刺激淋巴细胞的增殖分化，从而增强和扩大免疫应答的能力,佐剂,主要用途：增强特异性免疫应答，用于预防接种及制备动物免疫血清作为非特异性免疫增强剂，用于抗肿瘤与抗感染的辅助治疗,弗氏佐剂,动物实验中最常用的佐剂：弗氏不完全佐剂(incomplete Freunds adjuvant IFA) 羊毛脂 1 份 +石蜡油 5 份，混合，高压灭菌后保存。用时加热融化，冷却至50左右，加抗原进行乳化处理。
7、弗氏完全佐剂(complete Freunds adjuvant,CFA) 弗氏不完全佐剂 10ml +卡介苗 10mg200mg 卡介苗可10010min灭活处理。,四、步骤和方法,颗粒性抗原多克隆抗体的制备伤害杆菌O抗血清的制备（介绍）1、伤害杆菌O抗原的制备：,接种,37 18-24h,洗下菌苔（用NS）,100 1h,过滤,4000r/min,20min,得到原液,稀释,109/ml应用液,颗粒性抗原多克隆抗体的制备伤害杆菌O抗血清的制备（介绍）,2、免疫方法： 选择体重2-3kg的健康家兔，将已经稀释好的抗原按下列剂量及程序做皮内注射。第一天注射1ml，第8天注射1ml，第15天注射
8、2ml，末次注射后7天颈动脉放血，测效价。,可溶性抗原多克隆抗体的制备,第一次免疫（基础免疫）,第一次加强免疫,第二次加强免疫,效价测定,2-4周,2-3周,7天,第一次免疫（基础免疫）,免疫乳剂的制备研磨法: 取1.2ml佐剂加入到无菌的研钵中，缓慢加入1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，每加一滴研磨至小滴消失，边加边往同一个方向研磨，抗原全部加入后继续研磨至乳白色粘稠的油包水乳剂。,研磨法,本法适于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。注意事项：每加一滴应研磨至小滴消失，滴加速度要慢边加边往同一方向研磨，否则不易制成乳白色粘稠的油包水乳剂，免疫效果就差。,免疫乳剂的
9、制备,注射器法： 取1.2ml佐剂+1ml抗原+0.2ml卡介苗混合液，用两个注射器用皮管对接，使佐剂和抗原往返推拉，直至乳化完全。 适用于制备少量的抗原乳剂。本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少。,免疫乳剂制备成功的判别标准,油包水状态 鉴定方法是将乳化剂滴入4左右冷水中，若保持完整不分散，成滴状浮于水面，即乳化完全，为合格的油包水剂。,免疫,将制成的乳剂吸入注射器，在兔子背部及颈部皮下注射8-10点，每点约0.2ml每隔14天用初次用量的2/5的抗原于不完全抗原中，在皮下多点注射加强免疫,每点0.2ml,共加强2次。第二次加强免疫开始,在免疫后第7天用免疫双扩散法检查抗体效价。,思考题,
10、佐剂的种类有哪些？佐剂的作用原理是什么？有何用途弗氏佐剂中弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂有何区别？抗原的免疫原性与哪些因素有关？,第一次加强免疫,实验目的 1.掌握多克隆抗体的应答特点 2.理解加强免疫的作用和必要性 3.加强动物技能,实验原理,体液免疫的一般规律 在抗原诱导下，浆细胞产生的抗体经淋巴液和血液流向全身，血液中抗体的浓度随应答时间的持续而增高。在初次接受抗原刺激中，机体发生初次应答，再次接受相同抗原刺激，机体产生二次应答或称回忆应答。,初次应答和再次应答的特点和比较,加强免疫的作用和必要性,再次应答，增加抗体量增强抗体的亲和力,材料和试剂,试剂：LDL抗原溶液，佐剂材料：注射器，研钵，消毒棉球,实验步骤,免疫乳剂的制备（注射器法和研钵法任选） 取抗原溶液（基础免疫的2/5）+弗氏不完全佐剂制备成油包水状态.免疫 将制成的乳剂吸入注射器，在兔子背部及颈部皮下注射，每点约0.2ml.,第二次加强免疫,实验原理及方法同第一次加强免疫,效价测定,取血分离血清双向免疫扩散效价测定,血清采集与处理,取血方法： 耳缘静脉取血、颈动脉取血等。血清处理： 取好血后，放入37，30min后，使血清充分析出（不能冰冻，否则产生溶血），经3000rpm/5min分离血清，剩余放进-20冰箱保存。,双向免疫扩散,
