1、1本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境坛紫菜MNSOD的克隆与分析一、选题的背景与意义1、背景紫菜是目前世界上人工养殖经济价值最高的海藻之一,全世界年总产值接近20亿美元,约占人工养殖海藻的2/3,我国的紫菜产量位居世界首位1。坛紫菜PORPHYRAHAITANENSIS属于红藻门红毛菜科紫菜属,为我国特有的暖温带性海藻，是我国两个主要紫菜栽培品种之一。坛紫菜原产于福建,在闽、浙、粤沿海地区被广泛栽培,其产量约占全国紫菜总产量的751。超氧化物歧化酶SUPEROXIDEDISMUTASE,SOD是一种广泛存在于生物体内的重要的氧自由基清除剂,与铜CU、锌ZN、铁FE、锰MN等微量元素TA
2、CEELEMENTS代谢有密切关系。根据其活性中心结合的微量元素的不同,SOD主要分为3种类型CU/ZNSOD、FESOD和MNSOD。SOD能够平衡机体的氧自由基,从而避免当机体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应,在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面具有独特的功能,因而受到国内外学者和研究者的广泛关注。目前，对SOD的研究已涉及到化学、生物学、医学、食品科学和畜牧兽医学等多个学科2,3,4。坛紫菜的基因组特性使其成为研究海洋藻类的模式物种，具有较高的科学研究价值，具有丰富飞营养价值，使其成为重要的经济藻类。尽管坛紫菜的科学和经济价值已经逐渐被人们认识，但是目前只
3、有少数几个基因被克隆，其功能基因的研究还处于起始阶段，其分子生物学研究还有待深入开展。2、意义海洋养殖业是我国海洋经济的支柱产业之一。目前，我国的大型海藻养殖产量居世界第一位。超氧化物岐化酶在植物抗逆防御中具有重要作用，克隆坛紫菜MNSOD基因CDNA及基因组DNA全长序列，并进行序列特性相关分析，为研究紫菜抗逆的分子机制，进行抗性育种奠定基础，为下一步研究该基因的表达模式与环境变化的相关性和紫菜抗性育种奠定了基础，有利于推动紫菜产业的持续健康发展。2二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容本研究从坛紫菜的叶状体CDNA中,经PCR扩增得到了MNSOD基因CDNA及基因组DNA全长序列,将
4、它们与GENBANK中其他物种的MNSOD进行了同源性比较与分析,分析ORF、氨基酸序列、蛋白结构和系统进化等，为进行该基因的功能验证提供实验基础。重点难点MNSOD基因CDNA及基因组DNA全长序列的获得。三、研究的方法与技术路线四、研究的总体安排与进度201006201009查阅文献，熟悉实验操作。201010201011开题报告，综述等撰写201102201103提取紫菜RNA，设计引物，获取MNSOD基因核心片段和全长序列等。201103201104实验数据的整理分析以及对整个试验的补充、完善。201004201005撰写论文，结题、答辩。五、主要参考文献1方允中,李文杰自由基与酶基础
5、理论及其在生物学和医学中的应用M北京科学出版社,1994提取坛紫菜RNA逆转录成CDNA设计特异性引物CDNA为模板，用引物扩增得到核心片段用RACE技术获得CDNA全长序列分析ORF、氨基酸序列和蛋白结构等用GENOMEWALKING技术获得MNSOD基因全序列32WEJTASZEKPOXIDATIVEBURSTANEARLYPLANTTOPATHOGENINFECTIONJBIOCHEMJ1997,3226816923MANNT,KEILINDHAEMOCUPREINANDHEPATOCUPREIN,COPPERPROTEINCOMPOUNDSOFBLOODANDLIVERINMAMMAL
6、SJPRORSOCB1938,1263033154MCCORDJM,IRWINFRIDOVICH,SUPEROXIDEANENZYMATICFUNCTIONFORERYTHROCUPREINHEMOCUPREINJJBIOLCHEM,1969,244604960555李东旭,吴蕾,任云霞超氧化物歧化酶的提取和纯化技术研究进展J食品研究与开发,2008,2931831856胡滨,赵艳丽,吴兆亮大肠杆菌发酵生产SOD最佳条件研究J生物技术,2002,1231441467GUIXF,YANGP,QIUYXSTUDIESONTHEPREPARATIONANDTHESTABILITYOFSODMODIF
7、IEDBYLAURIEACIDJWUHANUNIVERSITYJOURNALOFNATURALSCIENCES,2003,322472508李敬玺,王选年,银梅,等超氧化物歧化酶研究和应用进展J动物医学进展,2007,28770759陈鸿鹏,谭晓风超氧化物歧化酶（SOD）研究综述J经济林研究,2007,251596510马晓丽超氧化物歧化酶的研究进展J山西职工医学院学报,2010,220838611EDWARD,LETALMANGANESEACTIVATIONOFSUPEROXIDEDISMUTASE2INTHEMITOCHONDRIAOFSACCHAROMYCESCEREVISIAEJBIO
8、LCHEM2005,208227152272012BOWLER,CETALSUPEROXIDEDISMUTASEINPLANTSCRITREVPLANTSCI1994,1319921813WOLFESIMON,FSTAROVOYTOV,V锰超氧化物岐化酶活性氧植物抗逆性氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质都是直接或间接由氧转化而成的。由于它们都含有氧,而且具有较活泼的化学反应特性,遂统称为活性氧（REACTIVEOXYGENSPECIES,ROS）1。ROS包括超氧根离子O2、氢氧根离子（OH）、羟自由基（OH）、过氧化氢H2O2、单线态氧（1O2）和过氧化物自由基（ROO）。它们可导致膜脂过氧
9、化、碱基突变、DNA链的断裂和蛋白质的损伤等。植物体在正常生长条件下也能产生少量的O2,它主要来源于线粒体的电子转移系统、光合作用,以及一些氧化还原酶的产物2。但在正常的生理情况下,活性氧在不断产生,也不断地被清除,因而不会造成自由基对机体的损伤。活性氧在植物体内的清除由保护酶和抗氧化物质来完成。保护酶主要是超氧化物歧化酶SUPEROXIDEDISMUTASE,SOD、过氧化氢酶（CATALASE,CAT）、过氧化物酶PEROXIDASE,POD等,其中SOD起主要作用。SOD是一种具有特定生物催化功能的蛋白质,由蛋白质和金属离子组成,它广泛存在于自然界的动物、植物以及一些微生物体内。1938
10、年，MANN和KEILIN3首次从牛红细胞中得到一种含铜蛋白血铜蛋白,1969年MCCORD和FRIDOVICH4发现此蛋白能够使超氧阴离子自由基O2发生歧化反应,因而将其定名为超氧化物歧化酶。1SOD的来源、种类与分布迄今为止的研究表明,SOD广泛存在于多种生物体内,已从细菌、原生动物、霉菌、植物、昆虫、鸟类、鱼类和哺乳动物等生物体内分离得到了SOD。根据其活性中心结合的微量元素离子不同,SOD主要分为3种类型,即CU/ZNSOD、MNSOD和FESOD。CU/ZNSOD主要存在于真核细胞的细胞质中,MNSOD主要存在于原核细胞及少数植物细胞,FESOD主要6存在于原核细胞和真核细胞的基质中
11、57。3类主要SOD的主要分布如表1所示。表1不同类型的SOD的主要分布TABLE1THEMAINDISTRIBUTIONOFDIFFERENTTYPESOFSODSOD类型主要分布颜色举例CU/ZNSOD真核细胞细胞质蓝绿色猪血、猪肝MNSOD原核及真核细胞线粒体紫红色人和狒狒肝细胞的胞液FESOD原核细胞黄褐色细菌属、脱硫弧菌属2MNSOD的结构与理化性质21MNSOD的结构SOD从结构上可分为2族,CU/ZNSOD为第1族,MNSOD和FESOD为第2族。天然存在的SOD,虽然活性中心离子不同,但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性5。不同来源的CU/ZNSOD的氨基酸序列同
12、源性很高。FESOD的活性中心是由3个HIS,1个ASP和1个H2O扭曲四面体配位而成8。任何生物来源的MNSOD的一级结构的同一性都很高,且均不同于CUZNSOD的序列。如人MNSOD和鼠、大肠杆菌MNSOD的同一性分别为94和43,不仅如此,参与形成活性中心及与金属连接的氨基酸在所有MNSOD中也都是保守的,而且与金属锰相连的氨基酸也完全一致,它们是组氨酸26、87、181和天冬氨酸1859。MNSOD的CD谱表明,其含有较高程度（32）的螺旋结构,较少折叠。由一级结构预测的二级结构表明,MNSOD中不可能存在象CUZNSOD中那种八股反平行的折叠,也不存在长的松散环,整个结构比较紧凑。E
13、RS和NMR研究揭示MNSOD中的金属离子是处于高自旋状态的3价锰MN3。MNSOD的金属辅基上结合有1个水分子,这个水分子的存在可能与催化机理有关。金属辅基对蛋白质结构有稳定作用,而且与MNSOD的活性直接相关。32MNSOD的理化性质SOD是一种酸性蛋白,在酶分子上共价连接金属辅基,因此它对热、PH以及某些理化性质表现出特别的稳定性。MNSOD、FESOD的结构特征是不含半胱氨酸,而含有较多的色氨酸和酪氨酸,因此紫外吸收光谱类似一般蛋白质,在280NM附近有最大吸收峰。MNSOD的可见光谱在475NM处附近有最大吸收,FESOD在350NM处有最大吸收,这都反映了所含金属离子的光学性质8。
14、动物、植物和真菌中的CU/ZNSOD,大多数原核生物的FESOD和MNSOD都是同源二7聚体,而植物等真核生物的FESOD和MNSOD是同源四聚体,组成FESOD和MNSOD的每个亚基的分子质量约为20KDA,而且每个亚基结合有一个FE/MN原子。FESOD和MNSOD具有同源性,它们与金属相结合的活性中心的碱基序列和三维结构也具有同源性。不同来源的植物MNSOD同源性达70以上,FESOD同源性约60,MNSOD和FESOD之间约50氨基酸相同10。不同类型的SOD对H2O2的敏感性不同,CU/ZNSOD酶活性受H2O2和KCN的抑制,FESOD的酶活性只受H2O2的抑制,而MNSOD的酶活
15、性不受H2O2和KCN的抑制11。MNSOD对热稳定，其构像熔点温度TM一般在84104之间，同时对PH值也有很好的稳定性，在PH4511之间能稳定存在11。植物MNSOD的氨基酸序列相似性大约65，并且与细菌的MNSOD氨基酸序列高度相似12。尽管大部分MNSOD都定位在线粒体中，但在一种海洋硅藻THALASSIOSIRAPSEUDONANACCMP1335中，MNSOD定位在类囊体膜上，认为其功能与光合作用偶联13，在西瓜CITRULLUSLANATUSSCHRAD,CVSUGARBABY种子子叶中，MNSOD定位在过氧化物酶体膜上14。3MNSOD的功能生存环境的变化是不可避免的,任何生
16、物必须去适应各种变化。以植物为例,经研究发现,不同条件、不同物种、不同的发育时期及不同器官发生胁迫后,SOD活性表现有升有降。然而SOD活性不论是升高还是降低,都表现出抗性强的品种比抗性弱的品种活性高。即当SOD活性降低时,抗性强的品种下降幅度小而当活SOD性升高时,抗性强的品种升高幅度大或者抗逆性强的品种活性升高而抗逆性弱的品种降低。这说明在逆境条件下植物的抗性强弱与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关。SOD的作用底物是生物体内产生的超氧阴离子自由基O2,作用机理是SODO2SODO2氧化型还原型SODO2SODH2O2还原型氧化型总反应2O22HSOD酶O2H2O2之后H2O2被抗坏
17、血酸和过氧化氮酶前者是主要的分解为H2O和O2,从而解除O2所造成的氧化胁迫。植物线粒体是ROS产量仅次于叶绿体的细胞器，位于其中的MNSOD在清除ROS中8的作用尤为重要。在豌豆PISUMSATIVUML,CVLINCOLN叶子中，MNSOD主要定位于线粒体和过氧化物酶体中，与植物组织衰老密切相关。衰老表现在叶绿素和蛋白降解、脂质过氧化、质膜通透性增加以及ROS代谢增强。超显微结构研究表明，豌豆叶衰老时，细胞中的叶绿体和过氧化物酶体数量剧增，前者使得H2O2含量增加，后者MNSOD的活性显著增强15。在烟草NICOTINAPLUMBAGINIFOLIAVARP2MNSOD研究中，乙烯、水杨酸
18、和丁香假单胞菌分别被用于研究MNSOD在防御反应中的作用。乙烯可以诱导许多防御蛋白的表达，水杨酸可以诱导逆境胁迫反应，而丁香假单胞菌可以引起超敏反应。研究表明，叶片用乙烯和水杨酸处理后48小时内MNSOD的MRNA含量大幅升高，对与丁香假单胞菌可以在24小时做出反应。这三种处理均可以提高植物细胞的呼吸速率，同样也可以促进MNSOD的转录16。在转MNSOD烟草NICOTINAPLUMBAGINIFOLIAVARP2中，MNSOD定位于线粒体中，将其前导肽编码序列用叶绿体前导肽编码序列置换后，构建表达载体，转化烟NICOTINATABACUMCVPBD6后，检测到叶绿体中MNSOD的活性。利用甲
19、基紫精MV，METHYLVIOLOGEN在光照下可以从PSI中接受电子传递给O2形成O2的特点，用其处理转基因烟草，可以检测到叶绿体中MNSOD的高效过量表达，既可以保护产生ROS的叶绿体元件，也可以保护质膜。在黑暗中，MV也可以从线粒体电子传递链中接受电子而导致O2的产生，用其分别处理莲座组织、幼嫩叶片和衰老叶片，发现了不同的结果在前两者细胞中MNSOD的含量本身较低，处理后MNSOD过量表达而对细胞产生伤害，而衰老叶片的MNSOD表现出很高的活性，说明MNSOD的表达水平在清除ROS过程中是重要的因素17。在西瓜CITRULLUSLANATUSSCHRAD,CVSUGARBABY种子萌发过
20、程中，子叶过氧化物酶体膜上的电子传递链促使NADP产生维持细胞器官代谢，也可以促使O2等自由基的产生；叶片过氧化物酶体中，三条完整的膜多肽18、29和32KDA可以促使O2的产生。过氧化物酶体膜上的MNSOD可以清除膜上产生并释放到基质中O2，并且可以间接调控H2O2的浓度18。31MNSOD与温度胁迫温度是生物生存环境的重要因素之一。因为细胞膜的成分中含有脂类,所以温度过高或过低都会对细胞膜系统造成影响,进一步破坏细胞内的蛋白质和DNA等。SOD作为一种细胞膜保护酶在温度胁迫下发挥作用。许多研究结果表明低温下植物SOD活性下降率与植物品种本身抗寒性强弱呈负相关性。9喜树在4时,酶活下降了55
21、88时变化较慢,且只下降16219。在一定程度上,SOD的活性会随着低温胁迫的加剧而增强而超过了SOD的临界值,其活性会随着胁迫的加深而下降。温度过高,对植物也不利。一般当植物处于45左右的温度时,就会受到伤害或引起死亡。在45条件下,对称猴桃年生盆栽苗进行2H、4H、6H、8H、10H的高温处理,结果表明SOD在初期活性上升,但随着时间延长,其活性下降20。对2个耐热性不同的菠菜品种进行高温处理,结果表明耐热品种中的SOD活性增幅大于不耐热品种21。栾树的耐热性较好,在72时才发生变性22。32MNSOD与干早及水分胁迫在植物体内,水参与了很多代谢过程,具有很重要的生理生化作用。在干早和水涝
22、发生时,SOD的活性都会发生变化。姜慧芳23等对不同品种的花生做了干早胁迫试验,分析结果表明在胁迫初期,SOD活性下降,不同品种间的差异小但在严重干早胁迫条件下,SOD活性上升,且抗早品种的SOD活性增加程度大于敏感品种。陆燕元24等对转基因与非转基因甘薯幼苗在水分胁迫不同时间及解除胁迫后，膜脂过氧化及抗氧化防御系统中主要指标的变化情况的研究中发现，在甘薯体内同时转入CU/ZNSOD和APX基因,可以有效减轻甘薯在水分胁迫条件下受损害的程度,提高甘薯的抗氧化胁迫能力,在水分胁迫逆境解除后,也可以更快更强地进行自我修复。33MNSOD与盐分胁迫限制植物生长的环境因素很多,其中土壤盐渍化的影响较为
23、严重。土壤中的盐分浓度过大,会使土壤渗透势降低,进而对植物造成水分胁迫,或者土壤中某种离子浓度过高形成离子不平衡而对植物产生毒害。通过对某些植物的研究可以看出,在盐害环境下,CUZNSOD活性升高较明显。据报道盐分能促进菠菜的叶绿体膜脂过氧化作用,SOD能有效地抑制这一作用25。在对扁桃砧木叶片进行盐胁迫后,SOD的活性随盐浓度的增大而先升高后下降,并且后期的下降幅度更大26。具有中度抗盐特性的紫花首蓓在受到不同浓度的盐胁迫后,其SOD活性表现出随着盐浓度的增大而增强的趋势,且紫花首蓓中的SOD同工酶的活性各不相同。在超过一定值时,SOD活性会下降27。34MNSOD与化学药剂胁迫除草剂以及一
24、些污水和空气中含有的有毒化学药剂,都对植物有不同程度的伤害,这对农业生产有很大影响。一般来说植物的SOD活性都是升高的,这与上述逆境所导致的氧化胁10迫增加相适应。在铬的胁迫的早期,小麦幼苗的SOD活性明显提高,但随着胁迫时间的延长,SOD活性又急剧下降40。SO2及O3均能促进植物体内活性氧的产生、启动膜脂过氧化作用,SOD等活性氧清除剂能增强植物的抗污染能力18。35MNSOD与病害胁迫大豆在感染SMV后,引起了活性氧的积累,诱导防御酶活性的增强,从而使SOD的活性上升28。在接种白粉菌前后不同抗性材料叶片SOD活性均表现出基本相同的变化趋势。对各种材料进行多种逆境胁迫试验,可以了解材料的
25、抗性、对某种逆境或条件的偏好,从而可以进行品种的筛选,为育种提供参考,以及采取措施避免环境胁迫造成的损失。4红藻门MNSOD研究进展在SOD与环境胁迫的关系方面的研究中，CLARE等29研究了椭圆小球藻CHLORELLAELLIPSOIDEA中SOD与冻害的关系，发现在抗冻藻株中含有MNSOD，而不抗冻藻株中含有FESOD，说明了MNSOD在保护藻株免受冻害胁迫的作用。LI等30研究了氯氰菊酯对斜生栅藻SCENEDESMUSOBLIQUUS在96H生长的抑制作用，结果表明，SOD的活性随着氯氰菊酯浓度的升高增加，并且指出SOD的活性可以作为斜生栅藻对氯氰菊酯的敏感指标。OKAMOTO等31用5
26、PPBHG2、05PPMCD2、20PPMPB2和01PPMCU2分别处理多纹膝沟藻30天与用10PPBHG2、10PPMCD2、50PPMPB2和025PPMCU2分别处理，在两组处理的前期，SOD的总活性迅速提高，但是根据金属离子和浓度的不同而变化，说明了这种藻对不同的金属离子产生的的胁迫表现出不同应答机制。红藻门的抗氧化研究的相关报道较少，仅限于潮间带藻类如皱波角叉菜CHONDRUSCRISPUS和乳头藻属的MASTOCARPUSSTELLATUS的胁迫耐受和ROS代谢的研究32，以及上述两种藻对环境的周期性适应研究32。目前，仅有少量的关于条斑紫菜的MNSOD基因的研究，没有坛紫菜相关
27、方面的研究。4SOD的应用与展望由于SOD在清除O2过程发挥的重要作用，其被广泛用于农业、医学、工业、药学、日用品和食品等多种领域。目前,人们对SOD分子已进行了化学修饰、脂质化改造等,运用基因工程法制备SOD、人工合成SOD模拟酶的研究,均取得了可喜的成果。随着SOD被广泛应用于护肤籍、洗面奶、香皂等领域,以及活性氧、疾病诊断和抗辐射等方面的研究,SOD将成为广大药厂和日用化工厂的重要原料。因此合成具有精确活性中心结构、热力学稳定的、动力学惰性的模拟物将是未来研究的重点。11参考文献1方允中,李文杰自由基与酶基础理论及其在生物学和医学中的应用M北京科学出版社,19942WEJTASZEKPO
28、XIDATIVEBURSTANEARLYPLANTTOPATHOGENINFECTIONJBIOCHEMJ1997,3226816923MANNT,KEILINDHAEMOCUPREINANDHEPATOCUPREIN,COPPERPROTEINCOMPOUNDSOFBLOODANDLIVERINMAMMALSJPRORSOCB1938,1263033154MCCORDJM,IRWINFRIDOVICH,SUPEROXIDEANENZYMATICFUNCTIONFORERYTHROCUPREINHEMOCUPREINJJBIOLCHEM,1969,244604960555李东旭,吴蕾,任云霞超
29、氧化物歧化酶的提取和纯化技术研究进展J食品研究与开发,2008,2931831856胡滨,赵艳丽,吴兆亮大肠杆菌发酵生产SOD最佳条件研究J生物技术,2002,1231441467GUIXF,YANGP,QIUYXSTUDIESONTHEPREPARATIONANDTHESTABILITYOFSODMODIFIEDBYLAURIEACIDJWUHANUNIVERSITYJOURNALOFNATURALSCIENCES,2003,322472508李敬玺,王选年,银梅,等超氧化物歧化酶研究和应用进展J动物医学进展,2007,28770759陈鸿鹏,谭晓风超氧化物歧化酶（SOD）研究综述J经济林研
30、究,2007,251596510马晓丽超氧化物歧化酶的研究进展J山西职工医学院学报,2010,220838611EDWARD,LETALMANGANESEACTIVATIONOFSUPEROXIDEDISMUTASE2INTHEMITOCHONDRIAOFSACCHAROMYCESCEREVISIAEJBIOLCHEM2005,208227152272012BOWLER,CETALSUPEROXIDEDISMUTASEINPLANTSCRITREVPLANTSCI1994,1319921813WOLFESIMON,FSTAROVOYTOV,VSDSYNTHESISDIRECTIONFFORWA
31、RDPRIMERSRREVERSEPRIMERS1241使用RTPCR克隆MNSOD基因CDNA部分序列以坛紫菜总RNA的反转录产物为模板进行PCR扩增。表2PCR反应体系TABLE2THECOMPONENTSOFPCRREACTION反应液成分用量（L）10BUFFER5MGCL225MMOL/L3CDNA50NG/L1DNTP10MMOL/L1GSP1或GSP210MOL/L1GSP3或GSP410MOL/L1TAQDNA聚合酶（5/L05PCR专用水375总反应体积50MNSOD基因PCR扩增程序为94预变性5MIN；94变性45SEC，57复性45SEC，72延伸45SEC，共进行35
32、个循环；72延伸10MIN。PCR反应结束后，12的琼脂糖凝胶电泳检测产物，切胶回收DNA。回收的PCR产物与PMD18T载体连接，转化DH5感受态细胞，PCR鉴定筛选阳性克隆，利用M13通用引物对插入片段进行双向测序，测序由上海英俊公司完成。将DNA序列及其对应的氨基酸序列与GENBANK中已有的相应序列进行比较分析，同时用DNAMAN软件对结果进行比较分析。1242MNSOD基因组部分序列的克隆除反应模块为坛紫菜基因组DNA之外，PCR反应体系、扩增程序及回收、连接、转化和测序步骤同1241一致。125采用RACE技术获得MNSOD基因的CDNA全序列根据已获得的MNSOD基因的CDNA部
33、分序列，用PRIMER50软件分别设计3RACE和5RACE基因特异性引物（GSP）。（表3，表4）表33RACE引物TABLE3PRIMERFOR3RACEPRIMERSLENGTH/BPS/DSEQUENCE（53）MNSOD3GSP20FGGCCACTGGAACCACTCCTTADAPTERPRIMER20RGGCCACGCGTCGACTAGTAC3GSPGENESPECIFICPRIMERFOR3RACESDSYNTHESISDIRECTIONFFORWARDPRIMERRREVERSEPRIMERSINVITROGEN3RACESYSTEMFORRAPIDAMPLIFICATIONO
34、FCDNAENDS表45RACE引物TABLE4PRIMERFOR5RACEPRIMERSLENGTH/BPS/DSEQUENCE（53）MNSOD5NGSP124RGCCGTGTTAAACTTCTTCTGCATCMNSOD5NGSP225RGACTCTAATGCTCGACTTGAGGTCAC5SHORT（OUTERPRIMER）23FCATGGCTACATGCTGACAGCCTA5LONG（INNERPRIMER）34FCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCCAGTCGATG5NGSPNESTEDGENESPECIFICPRIMERFOR5RACESDSYNTHESISDITE
35、CTIONFFORWARDPRIMERSRREVERSEPRIMERS1251MNSOD基因3端CDNA序列的获得使用PROMEGA公司生产的MMLV反转录酶，按使用说明书操作，反转录成3RACECDNA文库，具体步骤为在RNASFREE的PCR管中，加入约1G总RNA、50MOLOLIGODT17接头（ANNEALOLIGO）1L；65反应5MIN，迅速冰浴2MIN；稍事离心，将反应物收集到管底；依次在管中加入5FIRSTSTRANDBUFFER4L、01MOL/LDTT1L、10MMOL/LDNTP混合物1L、40U/LRNASEINHIBITOR05L、200U/L反转录酶05L，加DE
36、PC水至20L；充分混匀，轻微离心将反应体系全部甩到管底；42反应60MIN；7015MIN终止反应，作为下一步PCR的模板。以上述反转录合成的CDNA文库为模板，利用通用接头引物ADAPTERPRIMER与MNSOD3GSP进行3RACE的PCR扩增。PCR扩增程序为94预变性3MIN；94变性45SEC，57复性45SEC，72延伸45SEC，共进行35个循环；72延伸10MIN。PCR反应体系、扩增程序及回收、连接、转化和测序步骤同1241一致。1252MNSOD基因5端CDNA序列的获得本实验采用TAKARA公司的5FULLRACE试剂盒进行MNSODCDNA5端的克隆。本试剂盒应用了
37、“去帽法”原理，TOBACCOACIDPYROPHOSPHATASETAP可以去掉MRNA的5帽子结构，使用T4RNALIGASE将5RACEADAPTOR连接到MRNA的5端后，使用5RACEADAPTOR上的引物与已知序列部分的引物进行两轮套式RTPCR反应，高特异性地扩增CDNA5末端的全长序列（见图1）。图15FULLRACE的扩增原理图（引自TAKARA公司5FULLRACE试剂盒说明书）FIG1THEPROTOCOLOF5FULLRACE取适量的总RNA，按照试剂盒说明书的要求进行5RACE文库的构建，并用其所提供的接头引物和特异性引物，进行两轮巢式PCR扩增CDNA5末端。取处理
38、后的带接头CDNA2L作为模板，利用试剂盒提供的通用接头外侧引物（OUTERPRIMEROFNUP）和巢式特异性引物NGSP1进行第一轮PCR扩增，反应条件为94预变性5MIN；94变性30S，57复性30S，72延伸1MIN，共进行33个循环；最后于72延伸10MIN；按1241的方法将巢式得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收、连接、转化和测序。126采用GENOMEWALKING技术获得MNSOD基因全序列1261染色体步移原理染色体步移技术（GENOMEWALKING）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。本实验采用TAKARA公司的基因组步移试
39、剂盒进行MNSOD基因DNA未知序列的步移。其主要原理是根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SPPRIMER）（见图2），与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物，即AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获得已知序列的侧翼序列（图3）。1262染色体步移技术操作步骤基因组DNA的获取本实验技术利用热不对称PCR进行目的基因步移，基因组DNA的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。使用经过充分纯化的完整的基因组D
40、NA（见图4）。此外，本方法灵敏度极高，模板DNA不能污染，所需的DNA量应要少于3G。已知序列的验证。在进行PCR实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。具体方法为根据已知序列设计特异性引物，对模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。特异性引物的设计。根据验证的已知序列，按照试剂盒说明书中的特异性引物设计原则，分别设计三条上游特异性引物和三条下游特异性引物（表5）。1STPCR反应。基因组DNA经OD测定准确定量后，取适量作为模板，以APPRIMER（四种中的任意一种）和特异性步移引物GSP1进行1STPCR反应。按下列组份配制1S
41、TPCR反应液（表6）。图2GENOMEWALKINGKIT特异性引物设计示意图（引自TAKARA公司GENOMEWALKING试剂盒说明书）FIG2THEPROTOCOLOFGENOMEWALKINGKITSPECIFICPRIMER表5步移引物TABLE5PRIMERSFORGENOMEWALKINGPRIMERSLENGTH/BPS/DSEQUENCE（53）MNSODUGSP124RACGTTCGTCACATACGTGTTGTGGMNSODUGSP226RGAGTACACAACGAGCAACGCAATAGCMNSODUGSP326RGCTGACACAACCTTCCTATCGGAAACM
42、NSODDGSP125FACCACTCCTTCTTCTGGAGCGTCATMNSODDGSP224FACGTTTGGCTCCTTCGACGAGATGMNSODDGSP324FTCCCATTTTGGGCCTGGATGTGTGUGSPUPSTREAMGENESPECIFICPRIMERDGSPDOWNSTREAMGENESPECIFICPRIMERSDSYNTHESISDIRECTIONFFORWARDPRIMERSRREVERSEPRIMERS表6染色体步移PCR反应体系图3GENOMEWALKING试剂盒工作原理示意图（引自TAKARA公司GENOMEWALKING试剂盒说明书）FIG3THE
43、PROTOCOLOFGENOMEWALKINGKITTABLE6THECOMPONENTSOFPCRREACTIONFORGENOMEWALKING基因组DNA（50NG/L）15LDNTPMIXTURE（10MMEACH）8L10LAPCRBUFFERII（MG2PLUS）5LLATAQ（5U/L）05LAPPRIMER1LGSP11LRNASEFREEDH2O195L总反应体系50L1STPCR反应条件为941MIN981MIN9430S631MIN5CYCLES722MIN9430S；253MIN；722MIN9430S；631MIN；722MIN9430S；631MIN；722MIN1
44、5CYCLES9430S；441MIN；722MIN7210MIN2NDPCR反应。取1L1NDPCR反应液作为2NDPCR反应的模板，以APPRIMER（四种中的任意一种）和GSP2为引物进行2STPCR反应。除模板和引物外，反应体系和1STPCR反应液一致。2NDPCR反应条件为9430S；641MIN；722MIN9430S；641MIN；722MIN15CYCLES9430S；441MIN；722MIN7210MIN3NDPCR反应。取1L2NDPCR反应液作为3NDPCR反应的模板，以APPRIMER（四种中的任意一种）和GSP3为引物进行3STPCR反应。除模板和引物外，反应体系和
45、1STPCR反应液一致。3NDPCR反应条件为9430S；651MIN；722MIN9430S；651MIN；722MIN15CYCLES9430S；441MIN；722MIN7210MIN取1ST，2ND，3RDPCR反应液各5L，使用12的琼脂糖凝胶进行电泳。按1241的方法将巢式得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收、连接、转化和测序。127MNSOD基因开放阅读框（ORF）的扩增及内含子验证在对MNSOD基因3RACE和5RACE的测序结果进行比对、拼接之后，寻找最大的开放阅读框（OPENREADINGFRAME，ORF），并将ORF转换成氨基酸序列，用BLASTX程序将编辑后的序列在NC
46、BI数据库中进行氨基酸序列同源性比较，推测ORF的正确性，在此基础上设计扩增MNSOD基因ORF及基因组全长的引物（表7）。表7开放阅读框及基因组全长扩增引物TABLE7AMPLIFICATIONPRIMERSFORORFANDFULLGENEPRIMERSLENGTH/BPSDSEQUENCE（53）MNSODORF120FATGGCGTTTGCTCTGCCCCCMNSODORF222RTTACGCCAGCGGCGTGTCAAACSDSYNTHESISDIRECTIONFFORWARDPRIMERSRREVERSEPRIMERS分别以总坛紫菜总RNA的反转录产物和基因组DNA为模板。反应体系
47、参照本章1241基因保守片段克隆的方法进行，PCR扩增程序如下94预变性3MIN；94变性30SEC，63复性30SEC，72延伸以CDNA做模板为30SEC，以基因组DNA做模板为1MIN，共进行35个循环；72延伸10MIN。按1241的方法将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、回收、连接、转化和测序。128实验结果分析利用DNASTAR50软件包的EDITSEQ程序结合开放阅读框ORF寻找程序（HTTP/WWWBIOINFORMATICSORG/SMS2/CODON_USAGEHTML）分析克隆基因的序列，寻找最大的开放阅读框（OPENREADINGFRAME，ORF），并将ORF转换成氨基酸
48、序列。用BLASTX程序将编辑后的序列在NCBI数据库中进行氨基酸序列同源性比较HTTP/WWWNCBINH1GOVBLAST，以推测ORF的正确性。用CLUSTALX18进行多序列联配。用在线软件HTTP/WWWFRUITFLYORG/SEQ_TOOLS/PROMOTERHTML预测启动子序列转录起始位点，HTTP/WWWDNAAFFRCGOJP/PLACE/SIGNALSCANHTML预测启动子顺式作用元件用；EXPASYPROTEOMICS、SWISSMODEL等软件分析蛋白质结构，用DNAMAN、MEGA40软件等对所推测的氨基酸序列特征及系统进化树进行分析。2结果与分析21坛紫菜基因
49、组及总RNA的提取为保证核酸质量，本实验采用AXYGEN公司生产的MULTISOURCE基因组DNA和RNA提取试剂盒进行核酸提取，DNA及总RNA完整性较好（见图4，图5），避免了传统方法纯度不够，多糖干扰等缺点。适用于常规PCR，RTPCR，染色体步移，CDNA文库构建等要求。22MNSODCDNA核心片段的获得与分析以坛紫菜CDNA为模板，以GSP筛选引物进行PCR扩增，结果显示MNSOD引物GSP2和GSP4效果最好，得到了500BP左右的特异性清晰条带（图6）。对RTPCR片段测序后可知，MNSOD的CDNA确切长度为499BP，与预期片段大小完全一致，经对比发现与条斑紫菜（PORPHYRAYEZOENSIS）MRNA（登录号DQ1464771）的同源性高达94，与莱茵衣藻（CHLAMYDOMONASREINHARDTII）（登录号U245001）MRNA的同源性为72，与雨生红球藻藻（HAE
