1、本科毕业论文系列开题报告生物工程水产养殖环境中菊酯类农药微生物降解菌的筛选及初步鉴定一、选题的背景与意义菊酯类农药开发于20世纪70年代出来，主要用于茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉、林木及卫生害虫的防治等，为杀虫剂中第三大类,是仅次于有机磷、氨基甲酸酯的一类杀虫剂，此类农药对农作物害虫高效、低毒的特性。不仅广泛应用于农作物中，还可用于渔业生产上杀灭寄生虫拟除虫菊酯中只有氟氯氰菊酯又名百树得、百树菊酯、氟氰戊菊酯在渔业生产中被禁用，但该类化合物具有亲脂性和环境持久性，能直接进入鳃和血液中，对鱼类产生强烈的毒性，若农药蓄积在水产品中，将对食用的消费者的健康造成影响。市售养殖水产品不同程度存在拟除虫菊
2、酯类农药污染。从水产养殖环境中菊酯类农药微生物降解菌的筛选及初步鉴定，是菊酯类农药对水产环境修复的一种有效手段即生物修复。生物修复的优点主要有（1）可加速农药的降解过程，具有高效性；（2）不会形成二次污染或导致污染物的转移，可以达到污染物永久去除的目的，使土地的破坏和污染物的暴露减少到最小程度。（3）在其它技术难以使用的场地，如建筑下或公路下生物修复却可以顺利进行。有关农药微生物降解的研究，在对有机磷和有机氯的降解方面的研究较多，而对于菊酯类可降解菌的研究,主要在农作物中，对于水产环境中的研究比较少。从养殖水环境中筛选菊脂类农药降解菌并运用到水产养殖行业中，可有效减少菊脂类农药在水产养殖环境中
3、的残留，进而提高鱼类等水产品的安全性。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1、水产养殖环境中菊脂类农药降解菌筛选、分离培养；2、降解菌降解能力的测定；3、农药降解菌种属的鉴定形态学观察，包括革兰氏染色等。16SRRNA序列扩增测序，将测到的序列与GENEBANK中已知的细菌序列相比较，根据亲缘关系远近最终确定种属。拟解决的主要问题1、菊酯类农药降解菌的分离鉴定；2、菊酯类农药降解菌降解能力的测定。三、研究的方法与技术路线研究方法对采集样品，在含有一定量的拟除虫菊酯类农药的培养基上进行降解菌株的培养、分离纯化，采用GCECD方法对分离得到的降解菌进行降解能力的初步测定，并采用形态学
4、观察、PCR方法等对耐药菌株进行菌种鉴定。技术路线四、研究的总体安排与进度2010年11月12月查阅资料，确定试验方案，写开题报告与文献综述。2011年1月4月1、水产养殖环境中菊脂类农药降解菌筛选、分离培养；采集样品富集分离筛选GCECD降解率测定菌种鉴定形态学观察16SRRNA2、降解菌降解能力的测定；3、农药降解菌种属的鉴定4、并翻译两篇外文文献。2011年5月分析讨论实验结果，整理总结手中资料，完成本科毕业论文。五、主要参考文献1邹明强，杨蕊，金钦汉，等农药与农药污染大学化学，2004，19625342GRANTRJ，BETTSWBBI0DEGRADATIONOFTHESYNTHETI
5、CPYRETHROIDCYPERMETHRININUSEDSHEEPDIPJAPPLIEDMICROBIOLOGY，2003361731763COLLINSP，CAPPELLOSCYPERMETHRINTOXICITYTOAQUATICLIFEBIOASSAYSFORTHEFRESHWATERPRAWNPALAEMONETESARGENTINUSJARCHENVIRONCONTAMTOXICO，2006，5179854MANNAS，BHATTACHARYYAD，BASAKDK，ETA1SINGLEORALDOSETOXICITYSTUDYOFACYPERMETHRININRATSJINDIAN
6、JPHARMACO，2004，36125285翟良安，姚爱侵，赵小春，等溴氰菊酯对鱼类毒性的研究J淡水渔业，19904I0136张征，李今，梁威，等拟除虫菊酯杀虫剂对水生态系统的毒性作用J长江流域资源与环境，2006，1511251297温学等常用渔药及各类养殖禁药J农家之友，20070345468王朝辉，尹伊伟，林小涛，等拟除虫菊酯农药对水生态系统的生态毒理学研究综述J暨南大学学报自然科学版，2000，2131231279蒋长征，戎江瑞等宁波市养殖水产品拟除虫菊酯类农药残留调查A卫生研究，2007,36669269310MALONYSE，MAULEA，SMITHARWPURIFICATION
7、ANDPRELIMINARYCHARACTERIZATIONOFPERMETHRINASEFROMAPYRETHROIDTRANSFORMINGSTRAINOFBACILLUSCEREUSJAPP1ENVIONMICROBIO1，1993，5972007201311GRANTRJ，DANEILLTJ，BETTSWB，ETA1ISOLATIONANDIDENTIFICATIONOFSYNTHETICPYRETHROIDDEGRADINGBACTERIAJJAPP1MICROB，2002，9253454012张建云，崔树军，武秀琴，等1株氟氯氰菊酯降解菌GZ3的分离和鉴定安徽农业科学，2010，3
8、81366356636，664013张丽萍，徐莲，吴莹等氯氰菊酯降解茵的筛选鉴定及其降解特性研究J生态与农村环境学报2009，253697214王兆守，林淦，李秀仙等拟除虫菊酯降解菌的分离、筛选及鉴定J福建农林大学学报自然科学版,2003217618015廖敏，张海军，马爱丽等两株拟除虫菊酯类农药高效降解茵混合降解性能研究J农药学学报2009，11447247916MALONYSE，MAULEA，SMITHARWAPPLENVIRONMICROBIOL1988，54112874287617MALONYSE，MAULEA，SMITHARWARCHMICROBIO11992,15828228618
9、MALONYSE，MAULEA，SMITHARWAPPLENVIRONMICROBOL，1993,5972007201319虞云龙，宋凤鸣，郑重，等一株广谱性农药降解菌的分离与鉴定J浙江大学学报，1997，23211111520虞云龙，盛国英，傅家谟，等杀灭菊酯的微生物降解及酶促降解J环境科学，1997，18258毕业论文文献综述生物工程菊酯类农药微生物降解菌的筛选及初步鉴定研究概况摘要简单介绍了拟除虫菊酯农药的应用及其对水产养殖环境的危害。重点综述了国内外菊脂类农药降解菌的筛选及鉴定方面的研究进展，阐述了生物修复对于减少农药危害的重要性。提出了课题研究的发展思路。关键词拟除虫菊酯；降解菌；水
10、产养殖；生物修复正文拟除虫菊酯农药是一类结构中含有苯氧基环丙烷酯的农药,主要包括三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、甲氰菊酯等1。开发于20世纪70年代出来，主要用于茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉、林木及卫生害虫的防治等，为杀虫剂中第三大类,是仅次于有机磷、氨基甲酸酯的一类杀虫剂，此类农药对农作物害虫高效、低毒的特性，及对环境稳定和降解速度慢的特点2，对昆虫有特异的杀伤力,对哺乳动物有中等毒性，对鱼类等水生生物高毒，仅10NG/L拟除虫菊酯就能导致河流或湖泊中的无脊柱动物全部死亡35。1菊脂类农药对水产养殖环境的影响拟除虫菊酯类农药不仅广泛应用于农作物中，还可用于渔业生产上杀灭寄生虫6拟除虫菊酯中只有氟氯氰
11、菊酯又名百树得、百树菊酯、氟氰戊菊酯在渔业生产中被禁用7，但该类化合物具有亲脂性和环境持久性，能直接进入鳃和血液中，对鱼类产生强烈的毒性，若农药蓄积在水产品中，将对食用的消费者的健康造成影响。市售养殖水产品不同程度存在拟除虫菊酯类农药污染8。蒋长征、戎江瑞等9采用GB/T5O091622003动物性食品中有机氯农药和拟除虫菊酯多组分残留量的测定的方法对宁波市养殖水产品拟除虫菊酯类农药残留进行调查，结果氯氰菊酯检出范围ND99014MG/KG，超标率30；氰戊菊酯检出范围ND03800MG/KG，超标率13，溴氰菊酯检出范围ND36340MG/KG，超标率09。鱼、虾、蟹类中以虾类中拟除虫菊酯超
12、标率最高。2菌株的分离、筛选及降解性能的研究一直以来，用微生物来降解除草剂、杀菌剂、石油、塑料、多环芳烃等,对受污染的土壤和水体的生物进行修复，是环境科学研究的热点。而用微生物降解方法解决农药残留问题的研究，却是个较新的领域。由于农药残留所带来的食品安全问题越来越受到人们的关注，用微生物降解方法解决农药残留问题可为绿色食品生产提供一条新的途径。可降解农药的微生物的研究是国内外的研究热点，随着研究的发展，被发现的降解农药的微生物种类不断增多，对其降解机理的了解也日趋深入，降解效果稳定也日趋提高。国内已报道过多种具有降解菊酯类农药的能力的微生物，如红球菌属RHODOCOCCUSSP芽孢杆菌属BAC
13、ILLIUSSP、假单胞菌属PSEUDONOMONASSP等1011。有关农药微生物降解的研究，在对有机磷和有机氯的降解方面的研究较多，而对于菊酯类可降解菌的研究,主要在农作物中,对于水产环境中的研究比较少。目前对于菊脂类农药微生物降解菌的研究主要集中在从多种农作物或土壤中筛选菊脂类农药降解菌以及可降解不同种类菊脂类农药的微生物和其降解机理的研究。张建云12等通过富集筛选的方法，从农药污染的土壤中筛选到1株氟氯氰菊酯降解菌，并对其进行了分类鉴定和降解性能的初步研究，为进一步利用该菌对氟氯氢菊酯农药污染的治理奠定基础。张丽萍等13从农药厂废水排放口附近的污泥中分离到1株能降解氯氰菊酯的细菌LQ3
14、,在有酵母粉、蛋白胨、葡萄糖等营养物质存在的条件下，以共代谢方式降解氯氰菊酯，5D内对20MGL氯氰菊酯的降解率达到721。该菌株还能降解功夫菊酯、甲氰菊酯、联苯菊酯和溴氰菊酯。王兆守等14分离出1株能以拟除虫菊酯类杀虫剂为唯一碳源和能源的降解菌WL0JL5，经鉴定为阴沟肠杆菌,该菌对100MGL的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯的降解率分别5243、5076和5689,对有机磷农药也有一定的降解能力。廖敏15等将两株可同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的高效菌株M6R9和M5R1进行单一菌和混合菌对比实验，发现单菌及混合菌对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率均与接种量OD呈正相关,且混合菌对
15、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分别比单一菌M6R9和M5R14提高25、34、23和145、146、155，半衰期分别缩短81H、148H、131H和403H、507H、464H，表明混合菌对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解存在协同作用,即混合菌可提高3种菊酯类农药残留的去除率。3降解菌的鉴定目前，国内外很多有关农药残留降解菌研究的报道，但对拟除虫菊酯类农药的降解菌报道相对较少。国外报道的菌株有蜡状芽孢杆菌属BACILLUSCEREUS1619等一些菌,而国内则集中在产碱菌属ALCALIGENESSP的一株菌2022。许育新等23从农药厂污泥中分离到一株降解氯氰菊酯的放线菌命名为CDT
16、3，并对该菌进行了鉴定，研究了其生理特性。结果表明，CDT3能以共代谢的方式降解氯氰菊酯，经16SRDNA序列分析，鉴定为红球菌属RHODOCOCCUSSP。生理生化特征革兰氏染色阳性，不能发酵葡萄糖产酸，严格呼吸型代谢，氧化酶阴性，接触酶阳性，VP反应阴性，甲基红反应阴性，不能利用淀粉，可液化明胶，还原硝酸盐到亚硝酸盐，可氧化乙醇到乙酸。张建等24通过对污泥样品中的微生物分离和纯化，得到一株功夫菊酯降解菌GFL。GF1在LB培养基平板上菌落乳白色、圆形、不透明、边缘整齐、表面隆起、湿润光滑，培养48H后可产生血红色色素。菌体呈长杆状，周生鞭毛。其生理生化结果如下革兰氏染色阳性，甲基红和VE反
17、应阳性，过氧化氢酶和接触酶测定阳性，氧化酶测定阴性，不能利用硝酸盐和淀粉，能水解明胶，不能利用柠檬酸盐，吲哚实验呈阳性，蔗糖、葡萄糖发酵不产气。4小结与展望对于水产养殖环境中的菊酯类农药微生物降解菌筛选的实验可参照微生物学实验25和常见细菌系统鉴定手册，从水产养殖环境中采集水样和沉积物，用2216E培养基培养并进行筛选和初步鉴定26。生物修复是降解农药的一种有效手段，具有高效、安全、费用低等优点。由于菊脂类农药的广泛使用，对水产环境不可避免的会造成一定的影响。降解菌可用于降解、去除拟除虫菊酯类农药残留27。减少或去除菊酯类农药对鱼类、蚌类等水生生物的危害。尽管农药降解菌运用于水产环境比较少，但
18、随着水环境污染引起的水产品安全质量问题越来越受到人们的关注，这方面的研究将会得到更好的发展。参考文献1邹明强，杨蕊，金钦汉，等农药与农药污染大学化学，2004，19（6）25342GRANTRJ,BETTSWBBIODEGRADATIONOFTHESYNTHETICPYRETHROIDCYPERMETHRININUSEDSHEEPDIPJAPPLIEDMICROBIOLOGY,2003（36）1731763COLLINSP,CAPPELLOSCYPERMETHRINTOXICITYTOAQUATICLIFEBIOASSAYSFORTHEFRESHWATERPRAWNPALAEMONETESAR
19、GENTINESJARCHENVIRONCONTAMTOXICO,2006,5179854MANNAS,BHATTACHARYYAD,BASAKDK,ETA1SINGLEORALDOSETOXICITYSTUDYOFACYPERMETHRININRATSJINDIANJPHARMACO,2004,36（1）25285翟良安，姚爱侵，赵小春，等溴氰菊酯对鱼类毒性的研究J淡水渔业，1990（4）10136张征，李今，梁威，等拟除虫菊酯杀虫剂对水生态系统的毒性作用J长江流域资源与环境，2006，15（1）1251297温学，等常用渔药及各类养殖禁药J农家之友，2007（3）45468王朝辉，尹伊伟，
20、林小涛，等拟除虫菊酯农药对水生态系统的生态毒理学研究综述J暨南大学学报自然科学版，2000，21（3）121279蒋长征，戎江瑞，等宁波市养殖水产品拟除虫菊酯类农药残留调查卫生研究，2007，36（6）69269310MALONYSE,SMITHARWPURIFICATIONANDPRELIMINARYCHARACTERIZATIONOFPERMETHRINASEFROMPYRETHROIDTRANSFORMINGSTRAINOFBACILLUSCEREUSJAPPLENVIONMICROBIO1,1993,59（7）2007201311GRANTRJ,DANEILLTJ,BETTSWB,ET
21、A1ISOLATIONANDIDENTIFICATIONOFSYNTHETICPYRETHROIDDEGRADINBACTERIAJJAPP1MICROBIOL,2002,9253454012张建云，崔树军，武秀琴，等1株氟氯氰菊酯降解菌GZ3的分离和鉴定安徽农业科学，2010，38（13）66356636，664013张丽萍，徐莲，吴莹，等氯氰菊酯降解茵的筛选鉴定及其降解特性研究J生态与农村环境学报，2009，25（3）697214王兆守，林淦，李秀仙，等拟除虫菊酯降解菌的分离、筛选及鉴定J福建农林大学学报自然科学版，2003（2）17618015廖敏，张海军，马爱丽，等两株拟除虫菊酯类农药
22、高效降解茵混合降解性能研究J农药学学报，2009，11（4）47247916PONNALARAGHAVENDRASCREENING,SELECTIONANDCHARACTERIZATIONOFPHYTICACIDDEGRADINGLACTICACIDBACTERIAFROMCHICKENINTESTINEJINTERNATIONALJOURNALOFFOODMICROBIOLOGY,2009,13312913417MALONYSE,MAULEA,SMITHARWAPPLENVIRONMICROBIOL,1988,54112874287618MALONYSE,MAULEA,SMITHARWARC
23、HMICROBIO1,1992,15828228619MALONYSE,MAULEA,SMITHARWAPPLENVIRONMICROBOL,1993,5972007201320虞云龙，宋凤鸣，郑重，等一株广谱性农药降解菌的分离与鉴定J浙江大学学报，1997，23（2）11111521虞云龙，盛国英，傅家谟，等杀灭菊酯的微生物降解及酶促降解J环境科学，1997，18（2）5822虞云龙，陈鹤鑫，樊德方，等拟除虫菊酯类杀虫剂的酶促降解J环境科学学报，1998，18（2）20821123许育新，戴青华，李晓慧，等氯氰菊酯降解菌卡朱CDT3的分离鉴定及生理特性研究J农业环境科学学报，2004，23（
24、5）95896324张建，张振华，黄星，等功夫菊酯降解菌GF1的分离鉴定及其降解特性研究J土壤SOILS，2009，41（3）45445825赵斌，何绍江，等微生物学实验M北京科学出版社，200219021026东秀珠，蔡妙英，等常见细菌系统鉴定手册M北京科学出版社，200124239827LAZAROELEUTERIOBIODEGRADATIONSTUDIESANDSEQUENCINGOFMICROCYSTINLRDEGRADINGBACTERIAISOLATEDFROMADRINKINGWATERBIOFILTERANDAFRESHWATERLAKEJTOXICON,2010,553143
25、41442本科毕业设计（20_届）水产养殖环境中菊酯类农药微生物降解菌的筛选及初步鉴定目录中英文摘要引言21实验部分211实验材料2111样品来源3112主要溶液和试剂3113培养基3114实验仪器312实验方法3121菌株的富集和分离3122菌液中菊酯类农药降解率的测定3123菌株16SRRNA序列的PCR扩增与克隆32结果与讨论421菌落422菌株降解率的测定423菌株的初步鉴定5231基因克隆检测结果5232同源性比较623316SRRNA序列系统进化树的分析6234革兰氏染色73结论8致谢错误未定义书签。参考文献8摘要拟除虫菊酯类农药是一类高效、广谱农药，在水产养殖过程中常用于杀灭寄生
26、虫等，从而导致养殖水体及养殖生物中该类农药残留超标，影响人类健康。本研究从海水及底泥的富集培养物中分离获得一株可降解氯氰菊酯和溴氰菊酯的菌株，进一步利用气相色谱法对分离菌株的降解能力进行测定，结果表明，在28OC温度下，对浓度为100MG/L的氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率分别为943和977，通过革兰氏染色和16SRRNA序列分析，初步鉴定为噬甲基菌。关键词拟除虫菊酯；降解菌；生理特性；降解率ABSTRACTPYRETHROIDINSECTICIDESASAKINDOFPESTICIDEISJUSTAFTERORGANOPHOSPHATEANDCARBAMATEESTER,WHICHISWIDE
27、LYUSEDINPLANTEDCROPWITHITSHIGHEFFICIENCYANDLOWTOXICBUTTHEREMAININGPESTICIDESWILLGOINTOHUMANBODYTHROUGHTHEBIOLOGICCHAINANDAFFECTHUMANHEALTHAPYRETHROIDSDEGRADINGBACTERIASTRAINWASISOLATEDFROMSEAWATERANDSEDIMENTTHEDEGRADINGABILITYOFBACTERIAWEREDETECTEDBYTHEGCECDTHERESULTSSHOWEDTHATTHESTRAINWASABLETODGRA
28、DECYPERMETHRINANDDELTAMETHRINBYAPPROXIMATELY943AND977RESPECTIVELYINTHEENVIRONMENTOF28CTHESTRAINWASPRELIMINARILYINDENTIFIEDASMETHYLOPHAGAMARINASTRAINKEYWORDSPYRETHROIDDEGRADINGBACTERIUMPHYSIOLOGICALCHARACTERISTICDEGRADATIONRATE引言拟除虫菊酯类农药是杀虫剂中第三大类，为目前仅次于有机磷、氨基甲酸酯的一类杀虫剂，约占杀虫剂总量的201。其中使用较广泛的主要有氯氰菊酯、溴氰菊酯
29、、氟氯菊酯、甲氰菊酯等。其中氯氰菊酯和溴氰菊酯使用最为广泛，但其比较稳定，不易被对光、热分解2，由于长期大量使用的已经造成了生态系统的严重破坏。溴氰菊酯对鱼类具有强毒性3，可在40C以下存放六个月无分解，遇碱分解，无抗药性。拟除虫菊酯类农药具有高效广谱、作用迅速、持效长等特点，特别是对有机磷农药已产生抗性的害虫有很好的效果4。拟除虫菊酯类农药广泛应用于农作物如茶树、蔬菜、果树、棉花等生产中的害虫防治。在水产养殖中主要是清塘、毒杀杂鱼和有害生物以及杀灭寄生虫等5。由于其在渔业生产中的广泛使用，在养殖水环境以及养殖水产品中存在不同程度的残留6。蓄积在水产品中的农药将会通过食物链进入人体，因而严重影
30、响消费者的健康。市售养殖水产品不同程度存在拟除虫菊酯类农药的污染。蒋长征、戎江瑞6等对宁波市养殖水产品拟除虫菊酯类农药的残留问题进行调查，结果显示，在鱼、虾、蟹类中氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等都存在不同程度的超标情况。有些微生物可降解除草剂、多环芳烃、石油、杀菌剂、人工合成高分子化合物，通过筛选降解菌可为受污染的土壤和水体的生物修复提供一条有效的途径。对于农药微生物降解的研究始于本世纪40年代，相对而言，用微生物降解方法解决农药残留问题是个较新的研究领域7。随着人民生活水平的提高，食品中农药残留的问题越来越受到人们的关注，用微生物降解方法解决农药残留问题可为绿色食品生产提供一条新的途径8。有
31、关农药微生物降解的研究，在对有机磷和有机氯的降解方面的研究较多，对于菊酯类农药的研究较少。而对于可降解菊酯类农药微生物的研究主要集中在农作物中，对于水产环境中的研究比较少9。生物修复是指生物尤其是微生物催化降解环境污染物，减少或最终消除环境污染的受控或自发过程，其基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用10。将农药降解菌应用于水产环境的生物修复是目前国内外研究的重点。随着研究的发展，被发现的降解农药的微生物种类不断增多，对其降解机理的研究也日趋深入，降解菌降解效果的稳定性也日趋提高，目前国内已报道过多种具有降解菊酯类农药能力的微生物1113。许育新1等从农药厂污泥中分离得到一株可降解氯氰菊酯
32、的放线菌CDT3。对该菌进行了鉴定，并且研究了其生理特性。实验结果表明，CDT3能降解氯氰菊酯，其途径为共代谢。经16SRDNA序列分析，鉴定其为红球菌属（RHODOCOCCUSSP）。洪源范14等以农药废水池污泥为样品分离到1株命名为JQI45的细菌，该菌株的生长能以甲氰菊酯为唯一碳源。该菌株在24H内对20MG/L的甲氰菊酯的降解率可高达998，进一步根据其16SRRNAGENBANKACCESSIONNODQ177525序列相似性和生理生化特征分析，结果表明该菌为鞘氨醇单胞菌属SPHINGOMONASSP。拟除虫菊酯类农药是一类含酯键的农药，具有多个苯环结构，为具有中等毒性的一类农药15
33、。本实验利用划平板划线法筛选到了一株可降解溴氰菊酯和氯氰菊酯的菌株，并对其降解效率进行了详细研究，进一步通过革兰氏染色和16SRRNA分析，初步鉴定该菌株为噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）。1实验部分11实验材料111样品来源宁波附近海域取海水、沉积物样品。112主要溶液和试剂浓度为20G/L的溴氰菊酯、氯氰菊酯，丙酮、正己烷、氯化钠、无水硫酸钠、异辛烷分析纯，购自国药集团药业股份有限公司，引物27F（5AGAGGTTTTGATCCTGGCCAG3）、1541R（5ACGGCTACCTTGTTACGACT3）购自南京金斯瑞生物科技有限公司，PCR反应所需的DNTPS、RTAQ
34、DNA聚合酶及PMD19购自TAKARA公司。113培养基基础培养基海洋细菌培养基（PH76）蛋白胨，5G；磷酸高铁，001G；酵母膏，1G；过滤海水，1000ML；固体培养基，15G琼脂。富集培养基海洋细菌培养基中添加氯氰菊酯和溴氰菊酯的混合液，浓度为100MG/L。114实验仪器电热恒温水浴锅，核酸蛋白定量检测仪，离心机，氮气吹干仪，岛津GC2010，电子天平，PCR仪，无菌操作台，振荡器，摇床等。12实验方法121菌株的富集和分离1、将水样和沉积物样品经过初步过滤后各取10ML加入到灭菌后的海洋细菌培养基中，在75RMIN1、30C下摇床培养24H。2、加入氯氰菊酯和溴氰菊酯，使其终浓度
35、为100MG/L，然后，在120RMIN1，28C下继续摇床振荡培养。3、将水样和沉积物中通过摇床培养的混合菌接种到平板上，在温度28C，湿度88下培养24H，挑取单菌落接种到培养基中，28C150RMIN1摇床培养5天。122菌液中菊酯类农药降解率的测定利用正己烷/丙酮（11，V/V）混合溶剂提取菌液中的氯氰菊酯和溴氰菊酯，通过GCECD检测菌液中的农药残留，计算获得菌株的降解率。123菌株16SRRNA序列的PCR扩增与克隆1231菌液PCR采用16SRRNA反应引物27F和1541R进行PCR扩增；PCR反应条件经过94C预变性2MIN后，循环扩增35次94C30S，60C30S，72C
36、1MIN，循环结束后72C延伸10MIN。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳检测。表1PCR体系TAB1PCRSYSTERMPCR体系体积H2O1725L10BUFFER25L菌液1LDNTP2L引物L10L引物210LRTAQ025L总体积25L1232琼脂糖凝胶中DNA片段的回收将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，置于15ML离心管中；按13的比例加入300L抽提缓冲液；于恒温水浴中50C温育至凝胶融化，23MIN混合一次；将滤液转移至SPINCOLUMN内，在6000RMIN1离心，弃滤液；加入2500L抽提缓冲液后1200RMIN1离心，弃滤液；向SPINCOLUMM管内加入750L淋洗缓
37、冲液，12000RMIN1离心，弃去滤液；12000RMIN1离心1MIN，将SPINCOLUMM转移至无菌15ML离心管并彻底清除离心柱内残液；向SPINCOLUMM管内加入25L灭菌水，静置1MIN，12000RMIN1离心，置于20C下保存。1233质粒连接质粒连接体系PMD19TVECTOR1L；回收的PCR片段4L；SOLUTION25L。将上述反应体系置于PCR仪中16C反应1H。1234转化取100L感受态细胞悬液于15MLEP管中，加入PUC质粒DNA溶液轻轻摇匀，冰上放置30MIN；42C水浴90S立即转到冰上冷却数分钟；加入冰预冷的LB液体培养基890L，混匀后37C振荡培
38、养1H，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（AMPR）；将上述菌液摇匀后取100L涂布于含AMP100GML1的LB固体平板上，37C倒置培养16H；筛选白色菌落置于5ML含AMP的LB培养液中，37C培养5H。1235PCR检验及测序在LB固体平板上挑选白色菌落，利用菌落PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。12416SRRNA序列系统进化树分析BLAST序列比对将测序结果于NCBI上进行BLAST比对；绘制系统树选择同源性较高的细菌16SRRNA序列进行比对分析，构建系统进化树。2结果与讨论21菌落用涂有农药的平板从水样、沉
39、积物中取样划平板，通过一段时间的培养，平板上出现了生长较好的菌落，选取较明显的菌落标号。其中19号菌的菌落形态为规律的白色菌落，线条明朗，长势旺，厚重；1016号菌落形态为生长无规律，有单菌落，个体不大，散乱在整个平板上，并且有黄色小菌落；1719号菌落形态为生长2天的菌落个体不大，但密集且黏糊在一起，培养5天后菌落成较大圆形，菌落较多。22菌株降解率的测定挑选21株菌28C条件下进行摇瓶培养，19号菌培养过程中加入溴氰菊酯，终浓度为100MG/L，1019号菌培养过程中加入氯氰菊酯，终浓度为100MG/L，2021号菌培养过程中同时加入氯氰菊酯和溴氰菊酯，终浓度各为100MG/L，培养7天后
40、，通过GCECD法分析培养基中氯氰菊酯、溴氰菊酯的浓度，计算降解率。表2微生物降解率TAB2MICROBIALDEGRADATIONRATE序号降解率氯氰菊酯溴氰菊酯16572934388948665006787796284509674109011194212590134631490415967161000178818368199682085675921977943结果如表2所示，菌株14，69号菌可降解溴氰菊酯，其中7号菌降解率最高，为962；菌株1019号可降解氯氰菊酯，其中16号菌降解率最高，为1000；20、21号菌既可降解溴氰菊酯又可降解氯氰菊酯，其中，21号菌对溴氰菊酯和氯氰菊酯降
41、解率分别为977和943，具有较好的降解效果。23菌株的初步鉴定挑选3株降解能力较强的菌株7号、16号和21号，通过16SRRNA对三株菌进行初步鉴定。231基因克隆检测结果如图1所示，以16SRRNA引物扩增后片段大小为15KB左右，与引物设计时理论扩增片段大小相同。图1基因克隆后凝胶电泳图FIG1THERESULTOFTHEGELELECTROPHORESIS232同源性比较如表3所示，7号菌株的16SRRNA序列与红细菌属（RHODOBACTERACEAEBACTERIUM）的序列同源性为100。16号菌株的16SRRNA序列与噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）的序列同源
42、性为100。21号菌株的16SRRNA序列与噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）STRAIN222同源性为99。表3降解菌的测序和同源性比较TAB3DEGRADINGBACTERIUMSEQUENCINGANDHOMOLOGYCOMPARISON序号GENBANK搜索结果7RHODOBACTERACEAEBACTERIUM100同源16METHYLOPHAGAMARINA100同源21METHYLOPHAGAMARINASTRAIN22299同源23316SRRNA序列系统进化树的分析将21号菌株16SRRNA测序结果提交到NCBI上进行BLAST，其核苷酸的序列同源性分析结果表
43、明，该菌株的16SRRNA序列与多数噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）的序列同源性均在99以上，将其最相近的10个16SRRNA序列构建进化树，如图2所示。系统树整体由2个分支构成，菌株21号处于噬甲基菌（METHYLOPHAGAMARINA）属部分菌株的系统进化树的一个分支中，根据16SRRNA的系统进化树及BLAST分析，21号菌属于噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）。UNCULTUREDBACTERIUMCLONEUVRV058UNCULTUREDBACTERIUMCLONEUVRV007UNCULTUREDBACTERIUMCLONEUVRV070UNC
44、ULTUREDBACTERIUMCLONEUVRV080METHYLOPHAGAMARINASTRAINKM5METHYLOPHAGAMARINASTRAIN222METHYLOPHAGATHALASSICASTRAINATCC33146METHYLOPHAGATHALASSICASTRAINDSM5690UNCULTUREDBACTERIUMCLONEODP46B02METHYLOPHAGAAMINOSULFIDOVORANSMETHYLOPHAGAMARINASTRAIN101216图2基于16SRRNA序列同源性构建的菌株21和相关细菌的系统进化树FIG2PHYLOGONETICTREE
45、BASEDONTHESEQUENCEHOMOLOGYOFSTRAINS21ANDBACTERIARELATED21号菌序列ACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATTGACCACAAAGTGGTAAGCGACCTCCCGAAGGTTAGTCTACCTACTTCTTTTGCAGCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGACTAGCTTTATGGGATTAGCAT
46、ACTCTCGCGAGTTAGCAACCCTTTGTACTAGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGGACAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTAGCGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCGCTACATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTC
47、GCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTATCGCGTTAGCTTCGATACACAAAGAATAAATTCTCCATACACCTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGCCCAGTGAGTCGCCTTCGCCACTGATGTTCCTTCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGAAATTC
48、CACTCACCTCTACCACACTCTAGCCATCCAGTATCAAAATGCAATTTCCCAGGTTGAGCCCGGGATTTCACATCTGACTTAAATAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTATAGGTAACGTCACAGTTGCAAGGTATTAACTTACAACCTTTCCTCCCTATTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGGTTGCCCCCA
49、TTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCTGATATAGGTTCATCTAATAGCACGAGGTCCGAAGAGCCCCCGCTTTCCTCCGTAGAGCGTATGCGGTATTAGCAGCCGTTTCCGGCTGTTGTCCCCCACTACTAGGCAGATCCCTATACATTACTCACCCGTCCGCCACTAATCCGTCTAGCAAGCTAGACTTCATCGTTCGACTTGCATGTGTTAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCTA234革兰氏染色对16、21号菌株进行革兰氏染色生化实验，表明16、21号菌株是一株革兰氏阴性菌，这与噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）特征相符
