1、抗 体 的 选 择,其木格2010.10,主 要 内 容,基础概念,如何选择二抗,标记物的选择,涉及的试验,基础概念,概 念1. 抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的糖蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。,抗体的分子结构,轻链：VL、CL重链：VH CH1、CH2、CH3、CH4 IgG IgM IgA IgE IgD,二、免疫球蛋白的功能区,功能区
2、：是不连续，紧密折叠的区域，由重链和轻链经链内二硫键连接而成的球状结构。该区具有特殊的功能特性。,1.类和亚类（根据H链的抗原性不同） IgG (gamma) IgA (alpha) IgM (mu) IgD (delta) IgE (epsilon),(1)类,(2)亚类,IgG：IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 IgA：IgA1, IgA2,主要功能1. VL和VH是抗原结合的部位（FV区）。2. CL和CH上具有同种异型的遗传标记。3. IgG的CH2和IgM的CH3具有补体固有成分C1q的结合点，参与激活补体系统。4. CH3/CH4具有结合包括单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、
3、B细胞、NK细胞等细胞的Fc段受体的功能。5. IgG的CH2+CH3 具有介导IgG通过胎盘的特性。,三、免疫球蛋白的水解片段 1. 木瓜蛋白酶（Papain）（将重链于近氨基端切断） Fab段（fragment of antigen- binding，抗原结合片段） Fab段可以与抗原结合，具有抗体的活性。 Fc段（fragment crystalizable，可结晶片段） Fc段不能与抗原结合，但可执行Ig的其他生物学功能。,2. 胃蛋白酶（Pepsin）（将重链于近羧基端切断） F( ab )2 ：可结合2个抗原表位。 pFc ：无生物学活性。,如何选择二抗,什么是一抗二抗？,一抗是针
4、对抗原的抗体，二抗是针对一抗的抗体。即抗体也可以充当抗原刺激机体产生抗体。 第一抗体就是平常所说的抗体，即能和抗原特异性结合。 第二抗体是能和抗体结合的，即抗体的抗体。主要用于检测抗体的存在。利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就有目的蛋白。,如何选择二抗？,检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，同时在后继试验中也会有不同的检测方案，因此在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，其中如何根据一抗的种属来源和类型选择二抗尤为重要。,1、一抗的种属来源：,二抗应选用与使用的一抗相同
5、的物种来源，例如：如果你的一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗则选抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是从兔血清里制备的兔源多克隆抗体，则相应的二抗需要选择抗兔的二抗。即根据一抗的物种来源选择相应的抗该物种的二抗。,1、一抗的种属来源：,常用的二抗产品包括：抗小鼠二抗（anti-mouse）、抗兔二抗（anti-rabbit）、抗山羊二抗（anti-goat）、抗绵羊二抗（anti- sheep）、抗人二抗（anti-human）、抗豚鼠二抗（anti- guinea pig）抗大鼠二抗（anti-rat）、抗猪二抗（anti-swine）、抗马二抗（anti-horse）、抗牛二
6、抗（anti- bovine）、抗鸡二抗（anti- chicken）、抗鸭二抗（anti- duck）等。,2、一抗的类别亚型：,除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。一般来说多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。,2、一抗的类别亚型：,单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果一抗是小鼠IgM，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgM。如果单克隆一抗是小鼠IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，I
7、gG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者您也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果一抗是小鼠IgG1，那么可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。,2、一抗的类别亚型：,在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG。这类型的二抗有通用的IgG（H+L）二抗，或者特异性只结合IgM的Anti IgM （mu） Antibody、IgA的Anti IgA （alpha） Antibody、IgE的Anti IgE （epsilon） Antibody等。,由于在选择二抗的时候要综合考虑一抗的类型及后继检测方案的要求，因此除了需要考虑
8、一抗的种属及类型外，还需要根据后继的检测方案选择不同标记的二抗，因此需要对二抗的标记物进行选择。 按照标记分，有HRP、AP、生物素等标记二抗，FITC、TRITC、Rhodamine、Cy3/5、Dylight等荧光二抗；按照检测物种分，有抗人、大鼠、小鼠、猪、驴、绵羊、山羊、小鸡、马、兔、仓鼠、狗、牛，以及多种细菌类二抗；另外，还有IgG、IgA、IgM以及IgG（Fc）、IgG（ab）2等不同类型抗体。,3、二抗的种属来源,一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一
9、抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。驴来源的二抗，非常适合做类似双标的免疫实验。,4、二抗的耦联标记,一般来讲，耦联到二抗上的探针主要有酶、荧光基团、生物素、金颗粒。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western Blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗；而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用Biotin/Avidin（生物素-亲和素）检测系统。在一些
10、荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。,5、是否经过血清吸附过的二抗,为减少二抗与样本的非特异性结合，需使用不同血清吸附的二抗。如检测样本是人源的蛋白，一抗是小鼠源的单克隆抗体，二抗就需要选择抗小鼠源的二抗，如果对实验的特异性要求很高，推荐经过人血清吸附过的抗小鼠源的二抗，这种二抗由于经过人血清吸附而排除了与人源组织（如IgG等）可能发生非特异性反应的IgG，因此将非特异性结合降低到最低。,6、Anti-IgG还是Anti-IgG, F（ab）2 fragment,在一些如胸腺、脾脏、血液的组织以及造血细胞、淋巴细胞、B细胞等细胞内，通常含有较多
11、的Fc受体，这时候选择二抗时最好选择Anti-IgG, F（ab）2 fragment这样的特异性二抗，这样就消除了由于Fc部分与IgG的非特异性结合。常规的Anti-IgG （H+L）二抗与IgG的重链和轻链都有结合反应，即与IgG的Fc的F（ab）2片段都能结合；由于IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此Anti-IgG （H+L）与它们都有交叉反应。而Anti-IgG, F（ab）2 fragment经过了IgG Fc片段的吸附，因此只与IgG的F（ab）2片段结合，然而IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此与它们也有交叉反应。,7、Anti-IgG（H+L）、Ant
12、i-IgG （gamma）、Anti-IgM （mu）、Anti-IgA （alpha）,在一些特殊的实验里，只需要检测样本里的IgG或者IgM，常规的Anti-IgG （H+L）由于与IgG的重链和轻链都有结合反应，而IgG、IgM、IgA都有保守的轻链结构域，因此不能特异性的检测某种类型的IgG或者IgM。这时候就需要针对特殊类型Ig分子的二抗。如KPL的Anti-IgG （gamma）二抗是由Anti-IgG（H+L）与IgM、IgA等吸附后的二抗，消除了能与后者结合的部分。,标记物的选择,偶联到二抗上的探针种类,常见二抗的应用,HRP和AP是酶，二抗上挂了酶，要给相应的底物才能显色，显
13、色方式可以通过发荧光也可以不发荧光（例如给予ECL底物，其中的H2O2和鲁米诺在HRP的作用下，能在黑暗中发出荧光；也可以给予双氧水和DAB，反应产生棕色不溶于水的物质）。 荧光标记物如FITC为异硫氰酸荧光素，本身就是黄绿色荧光，二抗结合后可直接在荧光显微镜下观察；生物素一般也是挂在二抗上的，利用卵白素分别连接生物素标记的第二抗体和生物标记的酶，由酶催化底物，生成终产物，这个终产物也是不溶于水的。,酶,主要有两种不同的酶耦联物，HRP和AP。比较而言，前者更经济、快速、稳定，而后者较前者更为灵敏，通常情况下，HRP广泛应用于免疫组化、western blot和ELISA中，而碱性磷酸酶（AP
14、）更适合于固相的免疫检测实验，如ELISA和western blot.,荧光基团,异硫氰酸荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明菁 类 染 料藻红蛋白或藻胆色素蛋白A C M A,荧光基团,异硫氰酸荧光素,异硫氰酸荧光素-Fluorescein Isothiocyanate （FITC）荧光标记二抗 FITC纯品为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水和酒精溶剂。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长为520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。由于FITC是小分子化合物，每一个抗体可标记几个FITC分子，IgM通常用小分
15、子的荧光素标记，如FITC、Cy3/5、Texas Red等。FITC荧光二抗主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。然而FITC的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。,四甲基异硫氰酸罗丹明,四甲基异硫氰酸罗丹明-Tetramethyl Rhodamin Isothiocyanate（TRITC），Rhodamine Red-X（RRX）, Texas Red（TR）荧光标记二抗 这些罗丹明的衍生物耦联基团具有不同的吸收波长 （550, 570, 596nm）和最大发射波长（570, 590, 620nm）。尽管TRITC经常和FITC一起在双标记实验中使用，
16、使用RRX和TR可以得到更好的颜色区分。,四甲基异硫氰酸罗丹明,在使用装有氪氩灯的激光共聚焦扫描显微镜作三标记的实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2（或者FITC）和Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，而且和这两者覆盖都很少。氪氩灯激发光为488nm，598nm和647nm，分别是Cy2（FITC）, RRX和Cy5的理想激发波长。,四甲基异硫氰酸罗丹明,因为FITC和PE可以被氩灯的488nm波长激发, 在流式细胞仪中用FITC作双标，另一种用藻红蛋白（PE）耦联基团要比罗丹明好。TRITC为罗丹明的衍生物，呈紫红色粉末，较稳定。最大吸收光波长为 550nm，最大发射光
17、波长为620nm，呈现橙红色荧光，与FITC的绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。因其荧光淬灭慢，也可用于单独标记染色。,菁类染料,Cyanine dyes,菁类染料,菁类染料,Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。,菁类染料,Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近T
18、RITC, 在荧光显微镜中，可使用和TRITC一样的滤波片。 Cy3在氩光灯（514nm或528nm）下可以被激发出50的光强，在氦氖灯（543nm）或者汞灯（546nm）下则约75。Cy3可以和荧光素一起作双标。Cy3还可以和Cy5一起在共聚焦显微镜实验中作多标记。,菁类染料,Cy5耦联基团的激发波长最大650nm，发光波长最大670nm。在氪氩灯（647nm）下它们可被激发出98的荧光，在氦氖灯下（633nm）为63。 Cy5可以和很多其他的荧光基团一起用在多标记的实验中。由于它的最大发射波长在670nm，Cy5很难用裸眼观察，而且不能用汞灯作理想的激发。通常观察Cy5时采用具有合适激发光
19、和远红外检测器的共聚焦显微镜。在水相封片剂中应当加入抗淬灭剂。使用传统的表面荧光显微镜时，不推荐使用Cy5。,藻红蛋白或藻胆色素蛋白,藻红蛋白或藻胆色素蛋白(Phycoerythrin,PE）荧光标记二抗 存在于被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。,藻红蛋白或藻胆色素蛋白,藻红蛋白PE的吸收波长范围较广，最大的吸收波长为566nm，最大的发射波长为574nm。藻红蛋白作为荧光标记物具有以下
20、优点：首先具有强的长波长激发和发射荧光，可避免来自其他生物材料荧光的干扰；并且具有极高的发射量子产率；另外PE具有非常高的水溶性而且与许多生物学或合成材料的多位点稳定交联。,AMCA,Aminomethylcoumarin Acetate （AMCA） 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。,
21、AMCA,由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。且由于肉眼不能很好的检测AMCA所激发的蓝色荧光，因而AMCA耦联的二抗更适用于检测大量存在的抗原。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。,荧光素根据其发射波长可分为：,菁类染料（Cy2,Cy3,Cy5） TRITC,RRX,TR,FITC AMCA,小 结,TRITC经常和FITC一起用于双标记实验中，也可以使用RRX或TR，但TR会产生较高的背景。在使用装有氪氢灯的激光共聚
22、焦扫描显微镜作三标记实验时，RRX尤其有用，可以和Cy2（或FITC）及Cy5一起使用，因为RRX的发射波长在Cy2和Cy5中间，且和这两者的重叠很少。,常用在多标记实验中（免疫荧光、流式细胞术），其缺点是，淬灭快，所激发的蓝色荧光，肉眼不能很好的检测。因而更适用于检测大量存在的抗原。,Cy2比FITC更稳定，且在表面荧光显微镜下，Cy2的荧光FITC更强。Cy3和Cy5比大多基团更亮，更稳定，背景更弱，常在共聚焦显微实验中作多标记。但Cy5不能用表面荧光显微镜观察，用有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。,FITC是广泛使用的荧光基团但其最大的缺点是淬灭快使用抗淬灭剂可以减轻。PE常和FITC一
23、起用于流式细胞术双标记实验,!NOTE!,由于观察荧光需要一定波长的激发光，必须根据实验室已有的仪器可发光的波段进行选择。另外，多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X （RRX）和德克萨斯红（TR）荧光素的区别就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的区别明显。如果对灵敏度有更高的要求，则Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。 由于存在货期，尽量推荐客户在试验设计时就选择好抗体，如试验中间需要更换，尽早定货，以免耽误试验进程、影响结果。,生物素,生物素（biotin）可以和抗生素蛋白/链酶亲和素（avidin/streptavidin）发生不可逆反应而紧密结合在一起。首先加入生
24、物素标记的二抗，在加入耦联有酶或荧光集团的avidin或streptavidin，后者能够结合于二抗表面的多个位点上，从而极大的放大检测信号。,生物素,WB最好是HRP标记的二抗（即辣根过氧化物酶），因为如果用生物素标记二抗的话，还要再加三抗（HRP标记），那样又要洗膜，又要三抗孵育，这样时间又要延长将近两个小时。,如何搭配流式抗体荧光标记,流式细胞仪能检测多少个通道是由有多少根激光决定的以及每根激光的功能决定的，所以首先需要注意两点：流式细胞仪有哪些激光。比如标配的FACSCalibur只有一根488nm的激光，能做FL1、FL2、FL3三个荧光通道/三个颜色，而选配的Calibur (FA
25、CSCalibur的简称)配有488nm和635nm两根激光，可以检测FL1-FL4四个通道/4个颜色。,不同型号的流式细胞仪的同样的一个通道检测荧光素的能力是不一样的，比如Calibur的FL3（第3通道）能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCPCy5.5,PE-Cy7,而Aria的第3通道只能检测PE-TexasRed, PE-Cy5, PerCP。Calibur第3通道能检测的PerCP-Cy5.5在FACSAria上是第4通道检测。Calibur和LSR都能检测4个颜色，但是第4个通道检测荧光素是不一样的。,搭配荧光素原则,搭配流式荧光素有2个原则：1
26、、每个通道只能选择1种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配，但需注意1、每个通道只能选择1种荧光素。以Calibur为例说明，Calibur的FL1通道选择了FITC就不能选择AlexaFluro488，或者选择了Alexa Fluro488就不能选FITC Calibur的FL3通道尽管能检测PE-Texas Red, PE-Cy5, PerCP, PerCP-Cy5.5, PE-Cy7五个荧光素，但是我们搭配的时候只能选择其中1个。,2、各个通道之间的荧光素可以随意搭配：如果客户的流式细胞仪能做4个通道，在第1个原则之下，那么每个通道随便选出1个荧光素就可以组合成4个颜色。以2跟激光的
27、Calibur为例，Calibur各个荧光素之间可以搭配出16种组合。比如常用的搭配是F I T C( F L 1 )P E（F L 2）PerCP（FL3）+APC(FL4), 这个搭配组合可以更改成Alex Fluro(FL1)PE（FL2）PerCP（FL3）+APC(FL4), 或者FITC(FL1)PE（FL2）PerCP（FL3）+Alex Fluro(FL4)，或者FITC(FL1)PE（FL2）PE-Cy5（FL3）+APC(FL4)等等。总之，在第1原则之下，我们可以随意搭配和组合各个荧光素。但是需要注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的话，上流式以后，容易导致补偿过度。,
28、供应商能提供的每种抗体的荧光素是不一样的。我们需要根据同时结合供应商能提供的每种抗体的荧光素进行搭配。原则上同一个标志的不同的克隆号带同1个荧光素在应用上没有区别的，但是有些不同克隆号的抗体之间可能会有一些稍微的差异，需要仔细看说明书。我们可以尽量选择在说明书上有流式图形的抗体，或者选择荧光素种类最多的克隆号的抗体。,为什么某些品牌的流式细胞仪要推荐使用Alex Fluro488和Alex Fluro647呢？因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定，适合流式细胞仪的光谱性质，对pH值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时发射光谱存在巨大差异，无需补偿。,如果检测的指标数目超过了流式细胞仪的通道
29、，怎么办？如果需要做5个指标，而流式细胞仪只能做4个通道，首先将指标归成2类，再将样本分成2份，分别检测。比如需要同时检测CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么将样本分成两份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。,1、为什么要用同型对照？,同型对照是使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性与细胞结合而产生的背景染色。同型对照是真正意思上的阴性对照，它不但可以用来设定流式细胞仪的电压，而且还可以帮忙省去昂贵与繁琐的重组细胞因子竞争封闭步骤。在流式细胞仪上
30、样前，染色方式如下：样本管：一抗样本同型对照管：同型对照样本,2、如何选择同型对照？,一般选择与一抗的成分完全相同种属来源、相同亚型和亚链、相同荧光标记的抗体，比如抗人的CD56 APC标记的抗体，货号是555518,成份是Mouse IgG1,。那么它的同型对照应该是APC标记的Mouse IgG1,，货号是555751。注意同型对照的成份跟它的名称是相同的。,如果是抗体的组合形式是纯化的一抗荧光标记的二抗，那么应该选择一抗的同型对照。比如CDw125的纯化抗体，货号是555901，成分是Mouse IgG1,。它的同型对照是纯化的Mouse IgG1,，货号是555746。它的二抗PE标记
31、的抗小鼠IgG1,货号是550083。那么染色方式如下：样本管： 纯化的CDw25PE标记的抗Mouse IgG1样本同型对照管： 纯化的同型对照PE标记的抗Mouse IgG1样本,如果没有找到适合的同型对照，在保持来源相同、荧光标记相同、免疫球蛋白类别相同条件下，那么优先选择的顺序应该是亚链不同亚型不同相同类别。比如，某种的抗体的来源是Mouse IgG2,。如果在同型对照表里面找到不到完全相同的同型对照，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2为同型对照。如果也没有找到Mouse IgG2，那么优先选择相同荧光标记的Mouse IgG2b作为同型对照。如果最后还是没有找到Mouse
32、 IgG2b，那么选者相同荧光标记的Mouse IgG2作为同型对照。,哪些客户需要使用同型对照？,A 对流式不是非常熟悉的客户。B 做胞内流式客户，比如胞内细胞因子、趋化因子和信号蛋白等。C 使用不常见的标志或者特异性不高的标志的客户，因为客户不熟悉不常见标志的表达情况，根据同型对照可以判断阳性细胞的位置。一些特异性不高的抗体，如多抗，非特异性结合非常多，使用同型对照可排除假阳性。D 对流式非常熟悉又使用常用的表面标志的客户一般可以不使用同型对照。,为什么有时候同型对照的表达会比抗体的表达高？,首先需要检查同型对照的抗体是否加错类型、剂量等。其次，因为有些标志在细胞的表面或者胞内表达不高，而
33、跟其类似的抗原非常多，那么加入同型对照时，同型对照非特异性的结合会超过抗体的特异性，所以会造成这种现象，在细胞表面时如图所示。这个时候推荐使用其他阴性对照，如空白对照等。,三、补偿微球,流式细胞仪的荧光补偿隔一段时间之后需要调整到适合的位置。如果荧光补偿没有调节好，会导致细胞分群不明显或者流式检测得到的结果图非常不漂亮，而且会影响到检测结果的不真实。荧光补偿的调节对初学者来说非常不容易掌握，同时，补偿调节是流式细胞术中比较难掌握的操作。尤其是一些不常见的标志检测时，需要经验非常丰富的流式操作者根据多年的经验判断调节补偿，才可以得到比较好的数据和图片。,现在不需要这么麻烦，因为补偿微球让一切变得
34、更简单。BD CompBeads是专用于流式细胞仪多色分析的荧光补偿调整微球。它的实用性是在于克服了以往普通的做三色以上的流式分析时补偿难调、耗费样本（往往用待测样本单标来进行补偿调节）的缺点。它本身不携带任何荧光，借助于与客户自己的特异性荧光抗体孵育结合来调节补偿。它不但能象待测的样本细胞一样在同样的实验条件下固定、破膜等，操作起来很简单，灵敏度高，一致性好，使补偿更轻松更准确，而且最难得的是它最适合于多色分析（如五色、六色、七色等）和复合荧光素（如PE-Cy7、APC-Cy7等），因为这时的补偿往往难度较大。各型号的流式仪器均能使用。Compbeads使用后可以将流式的条件保存，方便下次做
35、同样的荧光染色搭配时参考用。,涉及的试验,1、免疫组化,免疫组化，是应用免疫学基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。,1、免疫组化,实验所用主要为组织标本和细胞标本两大类，前者包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片，后者包括组织印片、细胞爬片和细胞涂片。 其中石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究；石蜡切片制作过程对组织内抗原暴露有一定的影响，但可进
36、行抗原修复，是免疫组化中首选的组织标本制作方法。,1、免疫组化,免疫组化常用的染色方法 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫酶标法，亲和组织化学法，后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用。,免疫组织化学的临床应用,主要包括以下几方面： 1、恶性肿瘤的诊断与鉴别诊断；2、确定转移性恶性肿瘤的原发部位； 3、对某类肿瘤进行进一步的病理分型； 4、软组织肿瘤的治疗一般需根据正确的组织学分类，因其种类多、组织形态相像，有时难以区分其组织来源，应用多种标志进行免疫组化研究对软组织肿瘤
37、的诊断是不可缺少的； 5、发现微小转移灶，有助于临床治疗方案的确定，包括手术范围的确定。 6、为临床提供治疗方案的选择。,2、免疫荧光技术,免疫荧光技术是利用荧光素标记的抗体（或抗原）检测组织、细胞或血清中的相应抗原（或抗体）的方法。由于荧光抗体具有安全、灵敏的特点，因此已广泛应用在免疫荧光检测和流式细胞计数领域。根据荧光素标记的方式不同，可分为直标荧光抗体和间标荧光抗体。间标荧光抗体中一抗并不直接连接荧光素，而是先将一抗结合到蛋白，然后带有荧光素的二抗再结合至一抗。通过二抗的结合，能将信号进行放大，因此能在一定程度上提高检测的灵敏度，但是随之带来的高背景也降低了检测的特异性。,2、免疫荧光技
38、术,近年来，随着荧光素和荧光检测技术的不断进步，荧光检测的灵敏度已经接近同位素检测的水平，直接标记的荧光抗体逐渐取代间接标记抗体。这些标记了荧光素的抗体直接结合至抗原，大大提高了检测的特异性，使检测的结果更加准确可靠。荧光检测技术的发展，使得免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查IgM抗体，做为近期接触抗原的标志。利用单克隆荧光直接标记抗体鉴定淋巴细胞的亚类。通过流式细胞仪，针对细胞表面不同抗原，可以同时使用多种不同的荧光抗体，对同一细胞进行多标记染色。,3酶联免疫吸附试验（ELISA）,酶联免疫检测是目前应用最广泛的免疫检测方法。该方法是将二抗标记上酶
39、，抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的作用结合起来，根据酶作用底物后的显色颜色变化来判断试验结果，其敏感度可达ng 水平。常见用于标记的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶（AP）等。由于酶联免疫法无需特殊的仪器，检测简单，因此被广泛应用于疾病检测。常用的方法有间接法、夹心法以及BASELISA。,3酶联免疫吸附试验（ELISA）,间接法是先将待测的蛋白抱被在孔板内，然后依次加入一抗、标记了酶的二抗和底物显色，通过仪器（例如酶标仪）定量检测抗原。这种方法操作简单但由于高背景而特异性较差。目前已逐渐被夹心法取代。夹心法利用二种一抗对目标抗原进行捕获和固定，在确保灵敏度的同时大大提高了反应的特异
40、性。近年来，抗原的定量检测技术也不断推陈出新。近年来，在夹心法ELISA 的基础上，开发了多抗原检测试剂盒，能同时检测微量液相样本中多个抗原含量。这项技术的应用大大缩短了诊断的时间，提高诊断的可靠性和及时性。,4、Western Blotting,Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,本次课程结束，谢谢欣赏,
