1、免疫学检测原理,第一节基于抗原-抗体反应 的检测方法,学习目的 ：一、掌握抗原-抗体结合反应的特点二、了解影响抗原-抗体反应的因素三、学习抗原-抗体反应的基本检测方法,抗原-抗体反应： 指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应。,主要应用：用已知抗原检测未知抗体用已知抗体检测未知抗原定性或定量检测体内各种大分子 物质用已知抗体检测某些药物、激素和 炎性介质等各种半抗原物质,一、抗原-抗体结合反应的特点,高度特异性定义：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体 结合。分子基础：抗原表位与抗体的抗原结合部位间存在 分子结构的互补性，二者可特异性结合。交叉反应 共同抗原决定基刺激机体产生的抗体
2、分别与两种抗原 ( 共同抗原 ) 结合发生反应。机理：具有相同的抗原表位,抗原-抗体结合的带现象与可见性前带现象：抗体过剩 后带现象：抗原过剩网格复合体：抗原、抗体的数量比例合适。 反应体系基本不存在游离的抗原或抗体，形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。,可逆性 抗原-抗体反应为分子表面的非共价键结合，结合虽稳定但可逆。,过剩方结合价未被完全占据，成游离小分子复合物或解离，不可见,二、抗原-抗体反应的影响因素,内因：1）抗体的特异性和亲和力 2）抗原理化性质、抗原表位多寡和种类 3）抗原抗体的浓度、比例 （影响最大，决定因素）外因：1）电解质 使抗原-抗体复合物失 去电荷而凝集，出现可见反
3、应 2）酸碱度 最适pH68 3）温度 适宜（可增加抗原 与抗体的碰撞机会，加快结合速度）,三、抗原-抗体反应的基本检测方法,凝集反应：细菌或红细胞等颗粒性抗原与相应抗体直接反应出现凝集。沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体结合后， 在一定条件下出现肉眼可见的沉淀。补体参与的反应：应用抗体与红细胞表面抗 原结合，激活反应体系中的补体成分， 根据溶血现象判定试验结果。免疫标记技术：用荧光素、酶、 放射性核素或化学发光物质等标 记抗体或抗原，进行抗原-抗体 反应的检测.,单向免疫扩散：,特点：定性半定量,用途：可用于测定血清IgG IgM IgA 和C3等的含量,原理：沉淀环的直径与抗原含量呈正相关,操
4、作：铺板 打孔 加样 放湿盒 看结果,双向免疫扩散,用途：鉴定两种抗原是否相同,特点：定性半定量,操作：铺板 打孔 加样 放湿盒 看结果,免疫电泳,常用于血清蛋白的组分分析,在一定量的抗体中，分别加入递增量的抗原，经一定时间后形成抗原抗体复合物，用浊度计测量反应液体的浊度，并与一系列标准品对照，由此推算样品中的抗原含量。,免疫比浊,原理：抗体浓度（高浓度）固定时，形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加，反应液的浊度也随之增加。,免疫标记技术：,（1）免疫荧光法,（2）酶免疫测定,（3）放射免疫测定法,（4）化学发光免疫分析,（5）免疫印迹法,（1）免疫荧光法,优点:特异性高缺点:检查
5、任一抗原均须制备相应荧光抗体。,间接荧光法优点:敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二 抗即可用于多种抗原的检测。缺点：非特异性反应亦增强。,直接荧光法,荧光素与抗体连接，再与抗原反应（对抗原定性或定位）,（2）酶免疫测定 将抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效 性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。,酶联免疫吸附试验(ELISA)：测定可溶性抗原或抗体。,免疫组化技术：应用标记的抗体与组织或细胞抗原发生反应，结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。,双抗体夹心法间接法酶联免疫斑点实验 ELISPOTBAS-ELISA（生物素-亲和素系统）,双抗体夹心法：用于检
6、测特异性抗原。,操作步骤： 用已知抗体包板 洗涤 封板 洗涤 加入待检标本 洗涤 加酶标抗体 洗涤 加底物显色 结果观察,间接法：用于检测特异性抗体。,基本步骤：用已知抗原包板洗涤加入待检抗体洗涤加酶标二抗洗涤加底物显色观察结果,酶联免疫斑点实验,A: 用已知抗原检测分泌特异性抗原的B细胞：,用已知抗原包被固相载体，B细胞分泌的抗体与之结合，加入酶标记的第二抗体，通过底物显色反应可检测B细胞分泌的特异性抗体。,B:用抗细胞因子抗体检测细胞分泌的细胞因子：,用抗细胞因子抗体包被固相载体，加入不同来源的细胞，细胞分泌的细胞因子与包被抗体结合，再加入酶标记的抗细胞因子抗体，通过底物显色反应测定结合在
7、固相载体上的细胞因子。,BAS-ELISA 生物素-亲和素系统,借助所形成的亲和素-生物素-酶复合物追踪生物素标记的抗原或抗体，通过酶催化底物显色，可检出相应抗体或抗原。,原理：生物素与亲和素的高度亲和力、 生物素能与抗体结合,（3）放射免疫测定法,用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原-抗体反应的特异性。,（4）化学发光免疫分析,将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下生成激发态中间体，当回复至稳定的基态时发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。,（5）免疫印迹法,又称Western印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等技术进行检测。 该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原。,谢谢观赏,
