1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的研究一、选题的背景与意义烟草环斑病毒（TOBACCORINGSPOTVIRUS，TRSV）是中国进境检疫法规中明确规定禁止入境的危害性有害生物。该病毒寄主范围广，可侵染52科246种植物，是果树、蔬菜、花卉等经济作物的重要病害之一，发生严重时可导致绝产。中国进口的植物种球茎和苗木中携带该病毒的风险很大。国内外针对TRSV所用的检测技术主要有DASELISA和RTPCR技术。相比传统的电镜观察和生物学鉴定，这2种方法在检测周期方面具有明显的优势，操作快速简便和高通量。但是，DASELISA的检测周期仍然需要6H左右，且检测灵
2、敏度相对较低，假阳性较高；RTPCR的整个检测周期仍需4H左右，且需要特殊的PCR扩增设备、电泳设备和紫外成像设备，仪器昂贵，对人员技术能力要求较高，不利于技术向基层实验室的推广及现场检疫。环介导等温扩增技术（LAMPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATION,LAMP）作为一种新的核酸扩增方法，依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BSTDNA酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列。该方法扩增效率非常高，灵敏度高，特异性强，只要恒温水浴锅即可，扩增结果加入荧光染料后可用肉眼直接观察，无需特殊仪器，操作方便，对设备要求低，LAMP的
3、整个反应周期只需1525H，检测周期非常短。本研究的建立，将提供一种快速简便检测烟草环斑病毒的方法，使该病毒乃至动植物种的其他病毒、细菌及真菌的基层实验室检测和现场检疫成为可能。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题本研究旨在建立用RTLAMP技术检测植物中的烟草环斑病毒的方法。整个研究内容包括1、设计RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的引物序列；2、确定RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的最佳温度；3、确定RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的最佳反应时间；4、检验本研究设计的引物在植物病毒检验中的特异性；5、比较常规的RTPCR方法和本研究建立的方法检测烟草环斑病毒的灵敏度；6、检验用荧光染料SYB
4、RGREENI判断实验结果的准确性；7、检验本研究建立的方法在样品检验中的应用。三、研究的方法与技术路线针对本研究的内容设计研究方法和技术路线如下1、查阅文献，建立初步的烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法；2、根据GENBANK（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）中已登录的烟草环斑病毒的外壳蛋白基因序列D12477，设计F3、B3、FIP（F1CTTTTF2）、BIP（B1CTTTTB2）、LOOP1和LOOP2共6条引物；3、按照建立的烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法，设置58、60、63、65四个反应温度进行温度优化试验；4、按照建立的烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法，在最佳
5、温度条件下，设置30MIN、60MIN、90MIN三个反应时间进行时间优化试验；5、用烟草环斑病毒、南芥菜花叶病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、番茄环斑病毒以及马铃薯V病毒等几种常见的植物病毒RNA进行特异性试验；6、用101、102、103、104和105稀释的烟草环斑病毒RNA样品为模板，用常规的RTPCR方法和本研究建立的RTLAMP方法进行扩增灵敏度比对试验；7、用凝胶电泳和荧光染料SYBRGREENI两种方法判断灵敏度试验中的RTLAMP扩增产物，比较荧光染料SYBRGREENI判断实验结果的准确性；8、用已用DASELISA检测呈TRSV阳性的进境大豆样品，采用本研究建立的RT
6、LAMP方法进行扩增检测，结果采用SYBRGREENI染色观察，检验该方法在样品检验中的应用。四、研究的总体安排与进度1、烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法的初步建立。2010年12月15日至2010年12月25日。2、RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的引物序列的设计。2010年12月26日至2010年12月31日。3、RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的温度优化试验。2011年1月3日至201年1月9日。4、RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的时间优化试验。2011年1月10日至2011年1月16日。5、本研究设计的引物在植物病毒检验中的特异性检验试验。2011年1月17日至2011年1月23日
7、。6、常规的RTPCR方法和本研究建立的方法检测烟草环斑病毒的灵敏度比较试验；用荧光染料SYBRGREENI判断结果的准确性试验。2011年2月21日至2011年3月6日。7、本研究建立的方法在进境大豆样品检验中的应用试验。2011年3月7日至2011年3月11日。五、主要参考文献1洪健，周雪平ICTV第八次报告的最新植物病毒分类系统J植物病理学报，2005，35（6）192MORIONES,E，NAVASCASTILLO,JTOMATOYELLOWLEAFCURLVIRUS,ANEMERGINGVIRUSCOMPLEXCAUSINGEPIDEMICSWORLDWIDEJVIRUSRESEAR
8、CH，2001，711231343BRIDDON,RW，MANSOOR,S，BEDFORD,ID，ETALCLONESOFCOTTONLEAFCURLGEMINIVIRUSINDUCESYMPTOMSATYPICALOFCOTTONLEAFCURLDISEASEJVIRUSGENES，2000，2019264GRACIA,CM，DE,B，GRANVAL,DM，G,VCUESTAOCCURRENCEOFDIFFERENTTOSPOVIRUSESINVEGETABLECROPSINARGENTINAJJOURNALOFPHYTOPATHOLOGY，1998，14742232275JDCASTELL
9、O，ASSISTANTPROFESSOR，ETALDETECTIONOFTOBACCOMOSAICANDTOBACCORINGSPOTVIRUSESINWHITEASHTREESBYENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYJTHEAMERICANPHYTOPATHOLOGICALSOCIETY，1984，6897877906兰玉菲，郗丽君，等植物病毒检测技术J山东农业科学，2006，558627王健华，王运勤，等植物病毒检测技术研究进展J热带农业科学，2005，3（25）71758唐毕锋，马立业，等环介导等温扩增技术的应用和发展J实用医学杂志，2008，22（24）3972
10、39749何琳，徐海圣，等白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立J水产学报，2010，34（4）59860310孙颖杰，岳志芹，等牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用J华中农业大学学报，2010，29（2）20320711谢青梅，曹永曹，等H5亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增（RTLAMP）检测技术J中国兽医学报，2010，30（1）414612MANMOHANP，GUILLERMOP，SHINGOINOUE，ETALREALTIMEREVERSETRANSCRIPTIONLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONFORRAPIDDETECTI
11、ONOFWESTNILEVIRUSJJCLINMICROBIOL，2004，42125726313POONL，LEUNGCS，CHANKH，ETALDETECTIONOFHUMMANINFLUENZAAVIRUSESBYLOOPMEDIATEDISOTHERNALAMPLICATIONJCLINMCROBIOL，2004，4251956196114黄帆，李琳，等DNA环介导恒温扩增技术速检测结核分枝杆菌的研究J现代食品科技，2008，24（8）83583815包云娟，朱水荣环介导等温技术在假结核耶尔森菌检测中的应用J微生物检测方法，2010，32055956016王敏雅，徐明汉，等沙门菌INV
12、A基因LAMP快速检测法的建立和初步应用J中国卫生检验杂志，2008，18101971198117王中光，张守发，等牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立J中国预防兽医学报，2010，32210811118夏永恒，杨兵，等2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立J中国动植物检疫，2009，26（5）293219刘宝山，潘树德，等环介导等温扩增技术在畜禽疾病诊断中的应用J中国兽医杂志，2009，459646520赵飞，邹为民LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用J南方水产，2007，3（2）717521甘文佳，胡旭初LAMP技术及其在病原诊断中的应用J中国病原生物学杂志，2010，5214
13、314522鲁勇，李红海，等LAMP快速检测沙门菌INVA基因的方法建立于应用J浙江中西医结合杂志，2009，19（4）21621823SFUKUTA，TIIDA，YMIZUKAMI，ETALDETECTIONOFJAPANESEYAMMOSICVIRUSBYRTLAMPJARCHIVESOFVIROLOGY，2003，1481713172024周广青，常惠芸，邵军军环介导等温基因扩增技术及其在病毒检测中的应用J生物技术通讯，2008，229029225刘佳，黄丛林，等环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒J中国农业科学,2010，43（6）1288129426KANEKOH，IIDAAOK
14、IK，ETALSWNSITIVEANDRAPIDDETECTIONOFHERPESSIMPLEXVIRUSANDVARICELLAZOSTERVIRUSDNABYLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONJJCLINMICROBIOL，2005，43332903296毕业论文文献综述食品质量与安全植物病毒LAMP检测技术研究进展摘要植物病毒几乎可以侵染所有的作物，造成花叶，矮化，褪绿，生长迟缓、畸形等症状，严重影响作物的产量和质量，造成很大的经济损失。2007年最新的检疫性有害生物病毒种类更是达到39种，基本涵盖了对我国农业有重大潜在性危害的病毒。关键词植物病毒；L
15、AMP；检测1植物病毒11植物病毒的危害植物病毒几乎可以侵染所有的作物，造成花叶，矮化，褪绿，生长迟缓、畸形等症状，严重影响作物的产量和质量，造成很大的经济损失。目前，植物病毒分为18个科、81个属以及亚病毒感染因子的类病毒和病毒卫星，共计900多种1。植物病毒传播方式广泛，可通过汁液接触，昆虫介体，嫁接等多种方式传播，且作物一旦染病一般缺乏有效的治疗方式。因此，即使在科技发达的今天，仍然可见植物病毒肆虐的身影。1990年双生病毒毁坏了多米尼加95的蕃茄；19911992年在美国佛罗里达该类病毒在蕃茄上造成的损失达14亿美元2；19921997年，棉花曲叶病毒导致巴基斯坦的棉花损失达50亿美元
16、，并有200多万公顷棉田遭受严重危害3；19901998年，番茄斑萎病毒使葡萄牙、巴西和阿根廷的马铃薯作物生产受到严重的影响4。我国自1997年就将一些重要的植物病毒列为检疫性名单，2007年最新的检疫性有害生物病毒种类更是达到39种，基本涵盖了对我国农业有重大潜在性危害的病毒。12植物病毒检测方法现状植物病毒本身具有亚显微性、隐蔽性、潜伏性和微量性，以及不易分离不易培养不易观察等特性，给检测带来了很大的困难。早期植物病毒的鉴定方法主要通过汁液磨擦、介体传播和嫁接等方法接种指示植物后观察症状，同时结合血清学检测5、电镜学检测，随着分子生物学的发展，各种分子生物学技术以其具有灵敏度高、特异性强等
17、优点被广泛应用于植物病毒的检测鉴定6,7。本文就近年来LAMP技术在植物病毒检测领域的研究进展做一简述，同时，也对今后植物病毒检测技术的发展方向做一展望。2LAMP检测技术21LAMP检测技术简介环介导等温扩增技术LOOPMEDIATEDISOTHENNALAMPLIFICATION，LAMP是日本学者NOTOMI等于2000年建立的，它主要是在具有链置换活性的BSTDNA聚合酶作用下，利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，且可在等温条件进行扩增反应。反应结果可通过肉眼观察，或者通过浊度仪检测反应过程中获得的副产品焦磷酸镁所形成的白色沉淀的混浊度来判定，也可在反应管中加入荧光染色试
18、剂，在紫外灯下观察，对反应产物实时临测。运用该技术使基因的扩增和产物的检测一步完成，其特点表现为扩增效率高，可在L560MIN扩增109L010；特异性高，所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有无来判别8。该技术自产生以后，主要应用于病原微生物的快速检测，包括病毒913、细菌1416、真菌、支原体、寄生虫17等；在动植物疾病诊断1821、食品卫生检验及环境监测方面应用广泛；同时也应用于动物胚胎的性别鉴定、肿瘤的基因检测及基因芯片22的开发等。22LAMP检测方法在植物病毒检测中的研究现状在病毒检测方面，LAMP无论是对RNA病毒还是DNA病毒均能做到快速检测。2003年，FUKUTA等用RT
19、LAMP直接从感染花叶病毒的叶、种子中快速检测出日本红薯花叶病毒23。同年，FUKUTA等用LAMP法检测了番茄叶黄病毒。他们又于2004年对LAMP进行了改进，建立了免疫捕获RTLAMPICRTLAMP，对感染菊花的番茄点状枯萎病毒进行了检测，并对其建立的方法进行了评价，结果显示，免疫捕获RTLAMP的敏感性比RTPCR高L00倍24。SHIRO等用免疫捕获RTPCR对番茄斑点枯萎病进行检测，得到了与FUKUTA同样的结果，即比RTPCR敏感性高，并且通过观察反应管的浊度直接判定结果，大大简化了结果的判定程序。2010年6月，刘佳等建立用LAMP方法检测菊花中的番茄不孕病毒TAV的检测方法，
20、实验中LAMP比RTPCR的灵敏度高3个数量级，实验结果表明，扩增产物直接加入荧光染料来定性研究菊花是否携带病毒时，该方法完全能满足实验的需求25。23LAMP检测技术展望LAMP虽然是本世纪才发展起来的一种分子生物学技术，还存在诸多的缺点和不足，但它在不断地改进和完善。近年来，有学者发现LAMP扩增反应所需要的BST聚合酶比TAQ聚合酶有更高的耐受性26，对与DNA和RNA的检测来说，核酸抽提步骤或省略，也能达到检测的目的，这是一个很闪光的优点11。LAMP以其不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单、扩增快速高效和适合各种条件下的快速检测等许多优点，实用性强，因此会有更广阔的应用前景。参考文献1
21、洪健，周雪平ICTV第八次报告的最新植物病毒分类系统J植物病理学报，2005，35（6）192MORIONES,E，NAVASCASTILLO,JTOMATOYELLOWLEAFCURLVIRUS,ANEMERGINGVIRUSCOMPLEXCAUSINGEPIDEMICSWORLDWIDEJVIRUSRESEARCH，2001，711231343BRIDDON,RW，MANSOOR,S，BEDFORD,ID，ETALCLONESOFCOTTONLEAFCURLGEMINIVIRUSINDUCESYMPTOMSATYPICALOFCOTTONLEAFCURLDISEASEJVIRUSGENES
22、，2000，2019264GRACIA,CM，DE,B，GRANVAL,DM，G,VCUESTAOCCURRENCEOFDIFFERENTTOSPOVIRUSESINVEGETABLECROPSINARGENTINAJJOURNALOFPHYTOPATHOLOGY，1998，14742232275JDCASTELLO，ASSISTANTPROFESSOR，ETALDETECTIONOFTOBACCOMOSAICANDTOBACCORINGSPOTVIRUSESINWHITEASHTREESBYENZYMELINKEDIMMUNOSORBENTASSAYJTHEAMERICANPHYTOPATH
23、OLOGICALSOCIETY，1984，6897877906兰玉菲，郗丽君，等植物病毒检测技术J山东农业科学，2006，558627王健华，王运勤，等植物病毒检测技术研究进展J热带农业科学，2005，3（25）71758唐毕锋，马立业，等环介导等温扩增技术的应用和发展J实用医学杂志，2008，22（24）397239749何琳，徐海圣，等白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立J水产学报，2010，34（4）59860310孙颖杰，岳志芹，等牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用J华中农业大学学报，2010，29（2）20320711谢青梅，曹永曹，等H5亚型禽流感病毒的逆转录
24、环介导等温扩增（RTLAMP）检测技术J中国兽医学报，2010，30（1）414612MANMOHANP，GUILLERMOP，SHINGOINOUE，ETALREALTIMEREVERSETRANSCRIPTIONLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONFORRAPIDDETECTIONOFWESTNILEVIRUSJJCLINMICROBIOL，2004，42125726313POONL，LEUNGCS，CHANKH，ETALDETECTIONOFHUMMANINFLUENZAAVIRUSESBYLOOPMEDIATEDISOTHERNALAMPLICATIO
25、NJCLINMCROBIOL，2004，4251956196114黄帆，李琳，等DNA环介导恒温扩增技术速检测结核分枝杆菌的研究J现代食品科技，2008，24（8）83583815包云娟，朱水荣环介导等温技术在假结核耶尔森菌检测中的应用J微生物检测方法，2010，32055956016王敏雅，徐明汉，等沙门菌INVA基因LAMP快速检测法的建立和初步应用J中国卫生检验杂志，2008，18101971198117王中光，张守发，等牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立J中国预防兽医学报，2010，32210811118夏永恒，杨兵，等2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立J中国动植物检疫，
26、2009，26（5）293219刘宝山，潘树德，等环介导等温扩增技术在畜禽疾病诊断中的应用J中国兽医杂志，2009，459646520赵飞，邹为民LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用J南方水产，2007，3（2）717521甘文佳，胡旭初LAMP技术及其在病原诊断中的应用J中国病原生物学杂志，2010，5214314522鲁勇，李红海，等LAMP快速检测沙门菌INVA基因的方法建立于应用J浙江中西医结合杂志，2009，19（4）21621823SFUKUTA，TIIDA，YMIZUKAMI，ETALDETECTIONOFJAPANESEYAMMOSICVIRUSBYRTLAMPJARCHI
27、VESOFVIROLOGY，2003，1481713172024周广青，常惠芸，邵军军环介导等温基因扩增技术及其在病毒检测中的应用J生物技术通讯，2008，229029225刘佳，黄丛林，等环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒J中国农业科学，2010，43（6）1288129426KANEKOH，IIDAAOKIK，ETALSWNSITIVEANDRAPIDDETECTIONOFHERPESSIMPLEXVIRUSANDVARICELLAZOSTERVIRUSDNABYLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONJJCLINMICROBIOL，2005，43332
28、903296本科毕业设计（20_届）RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的研究目录1引言错误未定义书签。2正文主体121供试材料122引物设计123烟草环斑病毒的RTLAMP扩增2231总RNA提取2232RTLAMP扩增2233RTLAMP结果分析224RTLAMP的检测反应温度优化试验225RTLAMP的检测反应时间优化试验226RTLAMP的特异性试验227RTLAMP的灵敏度试验228烟草环斑病毒RTPCR检测方法的建立229烟草环斑病毒的RTLAMP扩增产物的结果鉴定方法研究2210大豆样品中的TRSV的RTLAMP快读检测23结果与分析331实验结果3311RTLAMP的检测反应温度优
29、化试验结果3312RTLAMP的检测反应时间优化试验结果3313烟草换班病毒的RTLAMP特异性扩增结果3314RTLAMP检测灵敏度试验4315扩增产物的结果鉴定方法研究4316大豆样品中TRSV的RTLAMP快速检测结果532讨论54小结6致谢7参考文献8附录9摘要为了提高TRSV检测的准确性及检测效率，缩短检测时间，降低检测成本，本研究建立了一种快速、简便的RTLAMP检测烟草环斑病毒的方法。首先，合成本研究设计的引物，配制扩增混合体系，同时设置一个空白对照和一个阳性对照；然后，在60水浴锅中恒温扩增60MIN；最后，采用琼脂糖凝胶电泳或SYBRGREENI染色的方法判断扩增结果，若有瀑
30、布状条带出现或者溶液呈黄绿色，表示在样品中检测出了目标病毒，没有出现瀑布状条带或者溶液呈橘红色，则表示没有检测出目标病毒。采用本研究建立的RTLAMP方法对大豆TRSV阳性样品进行检测，并用荧光染料SYBRGREENI法观察，结果显示，阳性样品均显示明显的绿色。关键词烟草环斑病毒；环介导等温扩增；检测。ABSTRACTABSTRACTINORDERTOIMPROVINGTHEACCURACYANDTHEEFFICIENCYOFDETECTINGTRSV,SHORTENTHEDETECTIONTIME,REDUCINGTHEDETECTIONCOST,THESTUDYESTABLISHEDARA
31、PIDANDSIMPLETRSVDETECTIONMETHODSUSINGLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONLAMPFIRSTCOMPOUNDPRIMERSTHATHAVEBEENDEVISEDINTHISSTUDY,PREPAREMIXSYSTEMFORAMPLIFICATION,SETAQAPCROSSREFERENCEANDAPOSITIVECROSSREFERENCETHENAMPLIFYIN60WATERBATHPOTFOR60MINATLASTAGAROSEGELELECTROPHORESISORSYBRGREENIDYINGAREUSEDTOD
32、ETERMINETHEAMPLIFICATIONRESULT,IFWATERFALLSTRIPEORKELLYSOLUTIONAPPEARS,THATMEANSTHEPOSITIVEABOUTTARQETVIRUS,IFNOWATERFALLSTRIPEAPPEARSORTANGERINESOLUTION,THATMEANSTHENEQATIVEABOUTTARQETVIRUSUSINGTHISMETHODSTODETECTTHETRSVPOSITIVESAMPLEANDTHEFLUORESCENTDYESYBRGREENIWEREUSEDTOOBSERVETHERESULT,ITSHOWST
33、HATPOSITIVESAMPLESSHOWOBVIOUSGREEN。KEYWORDSTOBACCORINGSPOTVIRUSTRSVLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONLAMPDETECTION。11引言烟草环斑病毒（TOBACCORINGSPOTVIRUS，TRSV）隶属豇豆花叶病毒科（COMOVIRIDAE）线虫传多面体病毒属（NEPOVIRUS），是中国进境检疫法规中明确规定禁止入境的危害性有害生物。该病毒寄主范围广，可侵染52科246种植物，是果树、蔬菜、花卉等经济作物的重要病害之一，发生严重时可导致绝产。中国进口的植物种球茎和苗木中携带该病毒的风险
34、很大1。目前，国内外针对用RTPCR和ICRTPCR技术检测植物病毒的研究已有不少35。TRSV所用的检测技术主要有DASELISA2、RTPCR技术和ICRTPCR技术6等。相比传统的电镜观察和生物学鉴定，这3种方法在检测周期方面具有明显的优势，操作简单方便。但是对设备和人员技术能力的要求较高。环介导等温扩增技术（LAMPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATION,LAMP）作为一种新的核酸扩增方法，具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的BSTDNA酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶
35、序列7,8,9,10。目前，LAMP技术被广泛应用于植物病毒如番茄不孕病毒101、红薯花叶病毒12、动物病毒如对虾白斑综合征病毒13、牙鲆弹状病毒14、细菌如假结核耶尔森菌15、沙门菌16，牛瑟氏泰勒虫17等的检测。本文针对烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法的建立进行了研究报道。首先，根据GENBANK（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）中已登录的烟草环斑病毒的外壳蛋白基因序列L09205，在序列的保守区，设计得到F3、B3、FIP（F1CTTTTF2）、BIP（B1CTTTTB2）、LOOP1和LOOP2共6条引物。合成设计的引物之后，根据查阅到的文献配制扩增混合体系，同时每个实验
36、设置一个空白对照和一个阳性对照。然后，用设计的引物，在58、60、63和65四个温度条件下进行反应温度优化试验，在30MIN、60MIN和90MIN三个时间条件下做反应时间优化试验，用烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、南芥菜花叶病毒以及马铃薯V病毒等多种植物病毒RNA为模板进行引物特异性试验，与RTPCR对比做引物灵敏度试验，以确定本方法的最佳反应条件和本研究设计的引物的可行性。最后，采用琼脂糖凝胶电泳或SYBRGREENI染色的方法判断扩增结果。2材料与方法21供试材料含有TRSV的阳性样品物质购自美国AGDIA公司，样品状态为新鲜叶片经液氮处理，磨成粉末状，冷藏于
37、4冰箱保存。含有TRSV的大豆样品由本实验室从美国进境大豆中截获，经DASELISA和普通RTPCR检测确认为阳性。番茄环斑病毒（TOMATORINGSPOTVIRUS，TORSV）、香石竹环斑病毒（CARNATIONRINGSPOTVIRUS，CRSV）、黄瓜绿斑驳病毒（CUCUMBERGREENMOTTLEMOSAICVIRUS，CGMMV）、南芥菜花叶病毒（ARABISMOSAICVIRUS，ARMV）、马铃薯V病毒（POTATOVIRUSV，PVV）等阳性标准物质也都购自美国AGDIA公司。RTLAMP引物由上海英骏生物技术公司合成。核酸提取试剂TRIZOL购自上海生物工程公司。RTL
38、AMP扩增试剂盒由本实验室研制。ONESTEPRNAPCRKIT与DL2000MARKER购自大连TAKARA公司。22引物设计引物序列见表1，根据GENBANK（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）中已登录的烟草环斑病毒的外壳蛋白基因序列L09205，采用BLAST程序进行同源性比较，在序列的保守区，使用PRIMEREXPRESS30软件，设计得到F3、B3、FIP（F1CTTTTF2）、BIP（B1CTTTTB2）、LOOP1和LOOP2共6条引物，分别识别外壳蛋白编码基因的8个位点。表1RTLAMP检测烟草环斑病毒的引物2TAB1THERTLAMPPRIMERSFORIDENTI
39、FICATIONOFTRSV引物PRIMERS序列SEQUENCE来源SOURCEF35CCAGCCCACGTTGTACTTT3L09205/AF461163/AY363727/U50869B35TTGATGGGTCAACTTCCAT3LOOP15TTGGCAGTGTATTGTTACCATGC3LOOP25ATTCAATTGGGTGATACTTTCGC3FIP5ACATGGGGCCCGTCATTGATTTTTTCCACAAATCAAGTAACGATGGC3BIP5GAGTTAAATAATCCAACTATGACGTGGCTTTTCATTGATAGATATTATGAGGCGAAAGA323烟草环斑
40、病毒的RTLAMP扩增231总RNA提取采用TRIZOL试剂方法提取7。232RTLAMP扩增反应体系2ULAMPMIX10L，引物F3和B3的终浓度各为02M，LOOP1和LOOP2的终浓度各为08M，FIP和BIP的终浓度各为16M，BSTDNA聚合酶（5U/L）15L，AMVRNA聚合酶（5U/L）1L，模板RNA1L，用DDH2O补充至总体积20L。反应条件如下在恒温60的水浴锅中扩增1H。233RTLAMP结果分析反应结束后，取10L扩增产物进行20琼脂糖凝胶电泳，在GELDOC2000（BIORAD）凝胶成像系统上观察并记录结果。24RTLAMP的检测反应温度优化试验以烟草环斑病毒
41、RNA为模板，按照建立的RTLAMP检测方法，分别在58、60、63和65四个温度条件下进行扩增，反应时间为1H。每个温度条件设置二个RNA样品重复，一个空白对照。25RTLAMP的检测反应时间优化试验以烟草环斑病毒RNA为模板，按照建立的RTLAMP检测方法，分别在30MIN、60MIN和90MIN三个时间条件下进行扩增，反应温度为60。每个时间条件设置二个RNA样品重复，一个空白对照。26RTLAMP的特异性试验以烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、南芥菜花叶病毒以及马铃薯V病毒等多种植物病毒RNA为模板，按照建立的烟草环斑病毒RTLAMP检测方法，进行特异性研究。
42、其中，烟草环斑病毒设置二个RNA样品重复，其余病毒设置一个RNA样品，并设置一个空白对照。27RTLAMP的检测灵敏度试验将提取好的烟草环斑病毒RNA模板进行10倍系列稀释，得到101、102、103、104和105稀释的病毒RNA样品。采用建立的RTLAMP和RTPCR方法进行扩增灵敏度比对试验。28烟草环斑病毒RTPCR检测方法的建立RTPCR反应体系参照ONESTEPRNAPCRKIT试剂盒说明进行，其中引物为F3和B3。反应条件如下50CDNA合成30MIN，94预变性2MIN；94变性30S，58复性30S，72延伸1MIN，35个循环；最后72延伸5MIN。29烟草环斑病毒的RTL
43、AMP扩增产物的结果鉴定方法研究将灵敏度实验中的RTLAMP扩增产物，用凝胶电泳法观察扩增结果；取5L扩增产物，直接加入01L的荧光染料SYBRGREENI，观察颜色变化。210大豆样品中TRSV的RTLAMP快速检测取已用DASELISA和普通RTPCR检测呈TRSV阳性的进境美国大豆样品，采用本研究建立的RTLAMP方法进行扩增检测，结果采用SYBRGREENI染色观察。3结果与分析331实验结果311RTLAMP的检测反应温度优化试验结果在相同反应时间，本实验设计的烟草环斑病毒的引物在58、60和63均出现可见条带，65没有出现条带。在60条件下的扩增条带清晰明亮，63条带模糊不清晰（图
44、1），由此，确定60为最佳反应温度。图1RTLAMP扩增烟草环斑病毒反应温度优化试验结果FIG1TEMPERATUREOPTIMIZATIONRESULTSOFRTLAMPFORTRSV注,MDL2000分子量标准1358466079631012651,2,4,5,7,8,10,11TRSVRNA3,6,9,12空白对照。NOTEMDL2000MARKER1358466079631012651,2,4,5,7,8,10,11TRSVRNA3,6,9,12NEGATIVECONTROL312RTLAMP的检测反应时间优化试验结果在60时，本实验设计的烟草环斑病毒的引物在60MIN和90MIN均出
45、现明显的条带，30MIN条件下没有出现扩增条带（图2），且60MIN和90MIN的条带在亮度和清晰度方面没有显著差异，故确定60MIN为最佳反应时间。图2RTLAMP扩增烟草环斑病毒反应时间优化试验结果FIG2TIMEOPTIMIZATIONRESULTSOFRTLAMPFORTRSV注,MDL2000分子量标准1330MIN4660MIN7990MIN1,2,4,5,7,8TRSVRNA3,6,9空白对照。NOTEMDL2000MARKER1330MIN4660MIN7990MIN1,2,4,5,7,8TRSVRNA3,6,9NEGATIVECONTROL313烟草环斑病毒的RTLAMP特异
46、性扩增结果烟草环斑病毒的阳性标准物质经过RTLAMP扩增后，能够得到特异性的瀑布状条带，而其它病毒毒株的RNA模板则无扩增条带出现，空白对照中无特异性基因条带（图3）。这表明本研究设计的6条引物针对TRSV的检测具有非常好的特异性。4图3RTLAMP特异性扩增烟草环斑病毒结果FIG3RESULTSOFRTLAMPSPECIFICAMPLIFICATIONOFTRSV注,MDL2000分子量标准1,2TRSVRNA3TORSVRNA4CRSVRNA5CGMVRNA6ARMVRNA7PVVRNA8空白对照。NOTEMDL2000MARKER1,2TRSVRNA3TORSVRNA4CRSVRNA5C
47、GMVRNA6ARMVRNA7PVVRNA8NEGATIVECONTROL314RTLAMP检测灵敏度试验不同稀释梯度的烟草环斑病毒RNA经过RTLAMP扩增后，其检测灵敏度为103病毒稀释液，比普通RTPCR扩增灵敏度高出10倍（图4）。图4RTLAMPANDRTPCR检测烟草环斑病毒的灵敏度结果FIG4THESENSITIVITYRESULTSOFRTLAMPANDRTPCRFORTRSVAMPLIFICATION注,MDL2000分子量标准16RTLAMP扩增灵敏度712RTPCR扩增灵敏度1,7101稀释液2,8102稀释液3,9103稀释液4,10104稀释液5,11105稀释液6,
48、12空白对照。NOTEMDL2000MATKER16RTLAMPAMPLIFICATIONSENSITIVITY712RTPCRAMPLIFICATIONSENSITIVITY1,6101DILUTION2,8102DILUTION3,9103DILUTION4,10104DILUTION5,11105DILUTION6,12NEGATIVECONTROL315扩增产物的结果鉴定方法研究本研究利用沉淀法和染色法对LAMP产物进行了检测。LAMP沉淀较少，肉眼较难分辨沉淀的有无；LAMP产物中加入SYBRGREENI染色剂，对照颜色呈橙红色，而有扩增产物则呈绿色（图5A）。在紫外灯下观察，空白对
49、照和无RTLAMP产物的样品管均没有发出白色荧光，而有RTLAMP扩增产物的样品管则发出白色荧光，且白色荧光的亮度与RNA模板浓度的高低成正比（图5B）。RTLAMP扩增产物，用凝胶电泳法观察结果和用荧光染料SYBRGREENI观察的结果一致。A肉眼观察OBSERVATIONWITHNAKEDEYES5B紫外观察OBSERVATIONWITHULTRAVIOLETLIGHT图5荧光染料SYBRGREENI处理RTLAMP产物的观察结果FIG5THERESULTSOFRTLAMPPRODUCTSTREATEDWITHSYBRGREENI注,A肉眼观察；B紫外观察。1101稀释液2102稀释液3103稀释液4104稀释液5105稀释液6空白对照
