1、第十七章 昆虫病原细菌的利用Bacterial entomopathogens,1,细菌杀虫剂的特点（筛选生防菌的依据）,（1）有选择性。即对防治对象毒力高，而对植物、益虫以及哺乳动物等无毒，不污染环境；（2）稳定性高，易剂型化；（3）致病因子多样化，不易产生抗性；（4）可通过基因工程等手段改造菌株；（5）可结合其它防治手段进行综合管理；（6）可以大规模生产，成本低。,2,第一节 昆虫病原细菌的主要类群,一般生物学特征：真细菌：G+，G，支原体；主要集中在芽孢杆菌科、类芽孢杆菌科、肠杆菌科、奈瑟菌科等；三阶段：延滞期、指数生长、静止期亚种、菌株差异致病相关基因以基因族形式存在，毒素基因大多在质
2、粒上,3,感染、致病和传播,从口部进入：突破障碍（口部唾液、肠道围食膜、肠道菌群）引发毒血症和败血症早期症状：停止取食、麻痹、腹泻、呕吐等后期症状：组织坏死、体色变化、虫体变软变形、有恶臭液体流出,4,根据昆虫病原细菌的特性和致病所需条件可分为：一、专性病原细菌,Obligate entomopathogenic bacteria经口部至消化道感染专化性高，难以人工培养如天幕毛虫芽孢杆菌Clostridium malacosomae,5,二、兼性病原细菌（Facultative entomopathogenic bacteria ）,一类可在人工培养基上正常生长发育的细菌。包括产芽孢和不产孢的
3、杆菌。如蜡状芽孢杆菌寄主范围较广。细菌在寄主消化道内增殖，并侵入体腔内，造成寄主染病死亡。有些种类能产生毒素，如引起细菌性中毒病的苏云金杆菌以及能引起灵菌败血病的粘质沙雷氏菌等。,6,三、潜在病原菌（Potential entomopathogenic bacteria ）,多数为腐生菌，普遍存在于昆虫的消化道中。如铜绿假单胞菌由于毒素和酶的产生数量少，难以侵入体腔内给宿主造成危害。作为寄主的昆虫种类很多，不是特定昆虫种的病原体。能引起家蚕细菌性败血病和细菌性肠道病的一些细菌便属于这一类。,7,昆虫病原细菌的主要类群:,芽孢杆菌属（Bacillus）: Bt；金龟子芽孢杆菌；球形芽孢杆菌梭状芽
4、孢杆菌属（Clostridium）：天幕虫梭菌假单胞菌属（Pseudomonas）：铜绿假单胞菌赛氏杆菌属（Serratia）：灵杆菌变形杆菌属（Proteus）肠杆菌属（Enterobacter）沙门氏菌属（Salmonella）葡萄球菌属（Staphylococcus）,8,第二节 苏云金杆菌,苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称B.t.）最早发现于1901年，1938年世界上第一个苏云金芽孢杆菌制剂Sporeine在法国问世，1970年初开始商业化应用。使用广泛，例如，苏云金杆菌已经成为加拿大控制枞色卷蛾（spruce budworm）的主要手段。在其它国家
5、，苏云金杆菌运用于控制毛虫（caterpillar）、舞毒蛾（gypsy moths）等。目前，全世界约有苏云金芽孢杆菌杀虫剂100多个品种，年销售额近1亿美元。,9,一、基本特征,（一） G+的好气性芽孢杆菌生活史3个阶段1. 营养体以苏云金亚种为例，营养体大小1.2 1.83.0 5.0m，两端钝圆，周生鞭毛，能运动。 营养体横裂生殖，对数生殖期往往2、4、8个或更多的营养体连在一起成串状。营养体在芽孢出现前先停止繁殖，细胞质浓缩，出现液泡和微粒，并逐渐形成芽孢和伴孢晶体。,10,2. 芽孢囊期,在形成芽孢的同时，在菌体内的一端或两端能形成具蛋白质性质的一个、两个乃至多个菱形、方形、长方形
6、、椭圆形、镶嵌形或不规则形的伴孢晶体，是其主要的活性成分。伴孢晶体由不同分子量的多肽原毒素（protoxin）组成。,11,3. 芽孢和伴孢晶体的释放,芽孢囊到一定时间后破裂，释放出游离的芽孢（0.80.9m2.0m）和伴孢晶体（0.6m 2.0m ）。芽孢是细菌的休眠体，对高温、干燥等不良环境条件有较强的抵抗力，菌剂即以芽孢粉状态可以长期贮存。芽孢遇适宜条件可萌发成新的营养体。,12,13,（二）培养特征,可在多种培养基上生长菌落：蛋白胨琼脂平板上，30C培养24小时，形成针尖状黄色小点，边缘平滑。72小时后，圆盘状，直径1cm，表面干燥平坦，边缘不整齐，略显放射状皱纹。菌苔：凸突状，乳白色
7、或淡黄色，光滑或有皱纹，可产生可溶性褐色素,14,（三）生理特征,对营养要求不高碳源：淀粉、糊精、麦芽糖、葡萄糖氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米浆等无机盐：磷酸氢二钾、硫酸镁、碳酸钙温度：2732CpH：略偏碱，7.5需氧,15,（四）生态特征,土壤微生物，分布广（除了南极洲未发现）；在土壤优势种影响下，增殖停滞；土壤类似于Bt芽孢的存储空间；在昆虫体内环境下利于其遗传物质交换和增殖；有些菌株与寄主形成内共生关系，通过产生抗生物质帮助寄主抑制病原菌或分泌分解酶助消化；商用菌株多采自叶面死虫,16,（五）感病特征,Type I and II hosts are characterized by
8、 a fast onset of gut paralysis continuing in type I to a general paralysis correlating with an increase in the pH and potassium concentration in the hemolymphWhile both type I and II hosts are susceptible to crystal toxin alone, type III hosts do not develop paralysis and require the presence of spo
9、res for mortality.,17,二、类群分类,到目前为止，已发现苏云金芽胞杆菌的伴孢晶体蛋白至少对脊椎动物中4个门和节肢动物门中9个目的3000种有害生物有活性。根据营养细胞鞭毛抗原的血清学反应及其它特性，苏云金芽孢杆菌可划分为71个血清型86个亚种。鞭毛抗原血清型（H-血清型，H亚因子）：国际咨询中心编号酯酶型：无鞭毛菌株,18,19,苏云金杆菌不同亚种或菌株对昆虫的致病性和毒力的差异,苏云金杆菌的不同亚种对昆虫的毒力差异很大。属于不同血清型的亚种或具有相同血清型的不同亚种的寄主范围是不同的。毒力的大小与产生的毒素有关，也与细菌的致病机制和寄主昆虫的特异性有关。这对工业生产中有效
10、菌株的选择以及高毒力或其他特异性菌株的选育具有重要意义。,20,三、苏云金杆菌的毒素和致病机理,（一） 苏云金杆菌的毒素 苏云金杆菌产生的毒素分为两大类：一类是内毒素，即伴孢晶体内所含毒素；另一类是外毒素，是细菌在生长过程中分泌在菌体外的代谢产物。苏云金杆菌所产生的毒素主要是外毒素和内毒素。,21,1. 杀虫晶体蛋白丁体内毒素（-endotoxin）,是苏云金杆菌具有杀虫性能的主要毒素。通常又被称为：伴孢晶体（Parasporal crystal）、伴孢晶体包含体（ Parasporal crystal inclusion body）晶体蛋白（Crystal protein）、晶体毒素（Cry
11、stal toxin）、杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein，ICPs ）晶体蛋白须在昆虫中肠碱性条件下经蛋白酶的消化作用裂解为有作用部分和无作用部分，只有有作用的部分或核心才能算丁体内毒素。,22,晶体的形成与芽孢的形成有密切关系。,能抑制芽孢形成的化合物如醋酸氟也能抑制晶体的形成，特定情况下相对独立。如在低温（1415）培养条件下不能形成芽孢，但晶体仍能产生。形态各异：双锥形、球形、立方体型、扁矩形、不规则形、长菱形杀虫结晶蛋白基因表达产物，基因位于质粒(120个)上，部分在核染色体上，野生菌株一般含有多个编码ICP的基因,23,伴孢晶体的成分,B.t.的
12、伴孢晶体包涵体中含有一或多种杀虫晶体蛋白，按一定方式聚合成晶体结构， 晶体不溶于水和有机溶剂，可溶于碱性溶液。虽属热敏感毒素，但具有一定的耐热性，在65中可保持1h，80下20 min也不致破坏，80100下30 min可被破坏。 晶体由18种氨基酸组成，各亚种在氨基酸的组成上是相同的，其含量也相近，可见不同亚种对昆虫表现出的不同毒力可能存在于结构单位之中。,24,根据杀虫活性和基因同源性分为5类：,cry I：鳞翅目昆虫cry II：鳞翅目和双翅目昆虫cry III：鞘翅目昆虫cry IV：双翅目昆虫cyt：其它动物，27种基因,25,Bt Toxin Nomenclature Commit
13、tee website (http:/www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/),cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac杀虫毒力最高,26,2. 营养期杀虫蛋白VIP,截至2009年，共发现65个vip基因 甲体外毒素（-exotoxin） 是一种能被热破坏的（120，20min）蛋白质，在菌体培养对数期的后期，先于芽孢和晶体的形成产生。口服能使某些害虫中毒。,27,3.乙体外毒素（ -exotoxin）,又称苏云金素、热稳定外毒素、蝇毒素，能忍耐121(15min)的高温和对家蝇幼虫有毒性。外毒素是一种腺嘌呤核苷酸衍生物，相对分子
14、量约为700，它是苏云金芽孢杆菌在一定培养条件下所产生的细胞外毒素，可溶于水，苏云金素是广谱毒素，对较多目的昆虫有毒性。,28,4、几丁质酶chitinase,可溶性胞外蛋白质类杀虫活性物质一般作为杀虫剂的增效剂线形氨基多元醇类化合物可溶于水，对热敏感能抑制多种革兰氏阳性和阴性细菌的生长，对子囊菌和担子菌也有抑制作用,5、双效菌素ZwA,29,6. 免疫抑制因子A7. 自身诱导物抑制蛋白8. Bacteriocin-like 抑制因子：细菌素,30,（二）苏云金杆菌致病机理,B.t.对昆虫的致病作用是通过它所产生的毒素和芽孢而引起的。一般是伴孢晶体起作用使昆虫发生毒血症而死亡，即是由于晶体毒素
15、对中肠上皮细胞作用结果，肠壁受损，中肠的碱性、高渗内含物进入血腔，血淋巴pH升高从而导致感病幼虫麻痹死亡。芽孢的存在不仅可提高Bt.伴孢晶体对昆虫的致病力，芽孢在肠道中萌发及与菌体一道通过由晶体毒素损坏的中肠肠壁进入血腔，菌体的繁殖引起昆虫败血症的发生，这也是感病昆虫死亡的原因之一。,31,Bt晶体毒素引发疾病过程家蚕,0阶段：030 min 停止取食，活动正常，血淋巴pH和K+上升；I阶段：轻度迟钝，30120min，中肠麻痹；II阶段：极度迟钝，23h，不能自主活动；III阶段：全身麻痹，34h，心跳完全停止最后死亡,32,1. ICP的致病机理,五环节：昆虫肠道溶解，酶解活化，与受体结合
16、，膜孔形成，细胞裂解 1)当敏感昆虫摄食苏云金杆菌的伴孢晶体后，在中肠肠液碱性条件下打开二硫键溶解成原毒素，2)进而在肠道胰蛋白酶的作用下激活成抗原蛋白酶的毒素核心片断（toxic core fragment），3)才能与刷状缘（brush border）上特异性受体高亲和性地结合，4)快速而不可逆地插入细胞质膜，形成孔或损伤（lesion），并破坏钾、钠离子梯度，引起膜的非极性化，5) 细胞裂解，昆虫幼虫停止取食，最终导致死亡。,33,How do Cry toxins work?,34,ICP杀虫特异性与跟受体亲和力大小有关抗性的形成关于细胞裂解两种假说：质子崩溃假说渗透裂解假说,35,2
17、. 苏云金素的作用机理,是原核和真核生物DNA依赖的RNA聚合酶的特殊抑制剂，真核DNA依赖的RNA聚合酶比原核的更敏感不直接影响蛋白质和DNA生物合成途经影响合成核糖体RNA，对合成RNA的过程也有抑制作用与ATP分子做出有相似三维结构，可能与ATP竞争酶的结合位点，影响靶标生物的ATP代谢作用可干扰有关激素的合成，从而导致幼虫发育畸形或不能正常化蛹。,36,3. VIPs的作用机制,杀虫谱比ICP广与ICPs相类似的方式产生致病作用VIP3A只要pH低于7.5时即可溶解，与敏感昆虫中肠上皮细胞结合后诱发细胞凋亡，细胞核溶解，昆虫死亡,37,三、Bt的利用,1）构建基因工程菌克隆杀虫晶体蛋白
18、基因：cry1Ac，通过质粒转移或整合在染色体上通过重组基因和诱变基因提高杀虫活性（提高拷贝数和表达量，延长mRNA和蛋白的半衰期）和扩大杀虫谱；延长杀虫毒素的持效期（伴孢晶体包裹在胞内不释放）及改进释放性能；,38,2）含Bt.内毒素的转基因作物的利用B.t.基因已被成功地导入烟草、水稻、玉米、棉花、油菜、大豆等多种植物，以抗鳞翅目昆虫为主要目标，世界总共已获得了50多种转B.t.杀虫晶体蛋白基因植物。3) 利用Bt杀虫毒素基因改造其它生防菌（如白僵菌，利用昆虫病原真菌可直接从体壁侵入防治刺吸式口器害虫）,39,转基因作物的优点：（1）在植物体内可稳定地遗传与表达；（2）杀虫蛋白对昆虫的幼虫
19、特别有效，可实现虫害的早期防治；（3）可实现植物的整株保护，尤其是化学药剂喷施不到的部位的防治（如钻心虫）（4）对人、畜及非靶标动物群体无害，不会破坏生态平衡。由于毒蛋白存留在植物组织中，不会污染环境；（5）抗性持久，不易被环境因素所破坏。,40,四、制剂生产工艺和应用,生产工艺（1）液体发酵工艺,41,选种育种,砂土管保藏,斜面育种,种子罐,浓缩 干燥,发酵罐,剂型化,发酵,制剂,pH4.55.5膜浓缩、喷雾干燥、质量检测,通气培养30C 3010 h，pH为7,30C，96 h,菌剂产品活芽孢100亿/克,（2）固体发酵工艺克服液体发酵技术要求高、设备投入大、剂型成本高等缺点网盘薄层一步固
20、体发酵法：透气性好、发酵产热可控、生长快、不易污染；适合小企业流程：菌粉接种固体基质发酵培养，干燥粉碎包装,42,固体发酵四阶段：发酵初期（610h）芽孢(工业菌粉每克100亿活芽孢,1%接种)萌发，注意控温（30C）控湿（8090% RH）发酵高峰（1024h）对数生长期，注意降温（32C）保湿稳定期（2434h）形成芽孢，控温（2832C）降湿（30% RH）后熟期（34h后）升温（35C），通风产品含50100亿活孢子/克,43,生产中注意事项,噬菌体的危害产品标准化（稳定性问题）提高菌剂质量和降低成本,44,应用主要应用于防治下列害虫：（1）经济作物类：棉铃虫、红铃虫、造桥虫、烟青虫；
21、（2）蔬菜类：菜青虫、小菜蛾、菜螟；（3）粮食作物类：二化螟、三化螟、稻苞虫、稻纵卷叶螟，玉米螟等，（4）果树类：松毛虫、美国白蛾、桃小食心虫、尺蠖、大袋蛾，卷叶蛾等。（5）医学类：蚊子、蚋（6）仓储类：印度谷螟、粉斑螟（7）动物寄生虫类：线虫,45,使用方法 做到四看： 一看温度。使用B.t.的适宜温度在25以上，温度过低完全失去杀虫作用。在2530时使用，其防治效果比1015时高出12倍。温度低于20时最好不使用。 二看湿度。环境湿度越大，其防效发挥越好，因此宜在早晚有露水时喷施粉剂，利于菌剂粘附在茎叶上。较湿润的土壤有助于菌剂的吸附，从而提高杀虫效果。 三看阳光。为了避免阳光中紫外线对B
22、.t.的破坏作用，最好在阴天或晴天下午4时以后使用。如能在B.t.中加入粗糖蜜、玉米糖浆，其防效更佳。 四看雨水。中到大雨会冲刷喷洒在茎叶上的药液，降低防效。如果喷后5h下毛毛细雨有增加防效作用。,46,害虫对Bt的抗性,自20世纪90年代以来，在16种虫种中经50次以上反复B.t.处理而表现有选择抗性。经3120代后增高10倍。抗性机制： B.t.毒素与中肠上皮细胞刷状边膜结合力降低，在结合发生之前降低毒素在中肠内的溶解性或活化性，降低导致结合后的敏感性如膜插入和膜孔形成。 害虫对B.t.抗性的治理途径大致为： （1）毒素混用，害虫对混合毒素中每一组成都具抗性的情况少见； （2）应用增效剂，
23、如丝氨酸蛋白抑制剂对B.t.防治4种蛾类和马铃薯甲虫增效； （3）不同毒素轮换使用，但如对毒素间存在交叉抗性时轮换意义不大； （4）应用超高剂量，但此途径可行性较小。,47,第二节 金龟子乳状病芽孢杆菌,日本金龟子芽孢杆菌（B. popilliae）和缓死芽孢杆菌（B. lentimorbus）能引起日本金龟子等幼虫的乳状病（Milky disease）。,蛴螬,（B. popilliae）,48,侵染过程,1. 侵染 金龟子芽孢杆菌（B. popilliae）主要通过芽孢感染和传播，芽孢经口摄入。当幼虫吞食芽孢后，芽孢可以在中肠道萌发成杆状的营养细胞，营养细胞能够侵染中肠细胞，随后穿过肠壁进
24、入体腔，并大量繁殖，使幼虫的血淋巴呈乳状，死亡幼虫呈乳白色，故又称为乳状病。,49,2. 增殖 金龟子芽孢杆菌在体腔中的增殖经历4个时期：（1）芽孢萌发期，血淋巴透明，13周；（2）营养繁殖期，即90%是营养细胞，35天（3）芽孢形成期，65-70%是营养细胞，17%-28%是含芽孢的细胞， 510天（4）芽孢成熟期，即95%的细菌含芽孢，血液乳状。感染约10-14d后，被感染的昆虫幼虫死亡。幼虫的死亡原因还不是很清楚，一般认为是营养物质耗尽，或是存在稳定毒素，或是氧化酶代谢紊乱。,50,3. 培养繁殖 金龟子芽孢杆菌的芽孢能在寄主体外存活，营养体也能在人工培养基上生长繁殖，但在人工培养基上形
25、成芽孢少于30%，液体培养少于0.1%。 因此，商品制剂Doom、Japidemic和Milky Spore都是采用幼虫活体培养的方法制备的。一般每头幼虫可产生2-5109芽孢。 近年来，国外试图克隆编码金龟子芽孢杆菌的杀虫活性蛋白的基因，并将其导入其它受体菌中进行表达，这为进一步开发利用此菌提供了新的途径。,51,第三节 球性芽孢杆菌,球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus, Bs)是一种在自然界广泛分布的芽孢杆菌，大多数菌株对昆虫没有毒性，无毒菌株细胞壁外具有正方形对称有规则的结构蛋白(T层)但从中发掘出了一些对蚊幼虫有高毒力的菌株。它的毒效成分(毒素蛋白)在细胞内，不分泌到
26、细胞外的培养液中。因此，只有昆虫取食细胞后才显示毒性。,52,1. 球形芽孢杆菌的杀虫范围 球形芽孢杆菌的杀虫范围仅限于蚊虫的幼虫，它通过取食过程进行感染，蚊子的幼虫在取食812h后，即可发生死亡。幼虫吞入球状芽孢杆菌后，菌体在肠道中被消化，细胞壁破裂，菌体内的毒素释放出来(被胰蛋白酶和糜蛋白酶降解成毒性肽与胃盲囊和中肠后端结合)，从而杀死蚊虫的幼虫(毒性作用不明),53,2. 球形芽孢杆菌的毒素 球状芽孢杆菌有两类毒素：一种来自营养细胞，是一种在营养生长期产生的蛋白质Mtx，这种蛋白的基因已被克隆和作序列分析；另一种毒素来源于伴孢晶体，是分子量分别为42Ku和51Ku的蛋白质，并且只有当两种
27、蛋白质在一起时才产生毒性（二元毒素binary toxin）毒素基因位于染色体上，已成功克隆,54,3. 球状芽孢杆菌的利用 球状芽孢杆菌在昆虫死后，可以在虫尸中重新增殖，芽孢的数目增加。在环境中持效期较长，并有可能在环境中再循环。 野外应用效果受到杀虫剂剂型（片剂、丸剂、膜剂、粉剂、乳剂、可湿性粉剂）、田间植被、温度（夏季较佳）、降雨（稀释）、日照（光降解）、水体污染程度、竞争性幼虫食源和蚊幼虫摄食习性等因素的影响,55,4. 基因工程菌 杀蚊毒素蛋白基因多样、在表达水平上差异也大，另外，具有杀蚊谱窄，释放难等限制 如以质粒为载体，转入大肠杆菌等获得高表达的菌株；转入柄细菌，借助于其易分布于
28、水面接触蚊虫；灭蚊工程蓝藻，蓝藻本身为蚊虫食物,56,其它昆虫病原细菌,嗜虫黏质赛氏杆菌（Serratia marcescens），又称灵杆菌，常产红色素引起多种鳞翅目幼虫致病如玉米螟、黄地老虎、棉铃虫、舞毒蛾等体腔内增殖，导致宿主败血症，可在13d内致死，虫体呈鲜红色,57,作业,昆虫病原细菌的主要类群金龟子乳状病芽孢杆菌的作用特点和应用范围球形芽孢杆菌的防治对象和杀虫机制苏云金杆菌的形态和培养特征苏云金杆菌产生的毒素种类简述杀虫结晶蛋白ICP对鳞翅目幼虫的作用机制简述苏云金杆菌的制备流程,58,苏云金芽孢杆菌虽然有较强的杀虫能力，但它必须经吞食过程进入体内才能杀死昆虫。因此在实际应用中，将其与吸引昆虫的物质一起喷洒，可以增加昆虫吞食的可能性。,59,有些伴孢晶体由S层蛋白形成,60,
