1、本科毕业论文系列开题报告生物技术紫菜生物肥的研制一、选题的背景与意义紫菜是一个具有良好社会效益、生态效益的海水养殖种类，主要集中在中国、日本、韩国、朝鲜。中国的主要养殖品种分为条斑紫菜（集中在江苏、山东等北方海域）与坛紫菜（集中在浙江、福建等南方海域）。实际上，坛紫菜也是我国特有的紫菜品种，产量占紫菜总产量的三分之二左右。目前，虽然我国与世界先进国家在总产量的差距已经缩小，但在人均产量、产值和产品质量、市场开发等方面还存在很大差距，没有结合国内的紫菜的品种和特点，将发展与创新的目光转移到我国特有的坛紫菜的生产和加工上来。现在国内坛紫菜产业的开发存在着众多的问题。中国传统的紫菜食用形式过于单调，
2、常见的只有干紫菜、即食紫菜等，销售价格在每公斤2030元，因此产品附加值无法得到提高。因此，无论从营养的利用率、普及率而言，都未得到实质性提高，这将直接影响到我国紫菜业的健康、稳定和可持续发展。因此，我国迫切需要将紫菜产业发展的关键步骤转移到紫菜养殖后的产品形式改变、产品的附加值提高，紫菜的价格上升，农民的养殖热情提高等方面。紫菜是一种海洋蔬菜，从营养成分的角度来看，紫菜是一类全营养的典型的高蛋白、低脂肪、高纤维、高矿物质的健康天然绿色植物。紫菜中富含蛋白质、碳水化合物、维生素等营养成分以及碘、硒、铁、镁等微量元素。紫菜细胞壁中的多糖具有的保水特性能够提高植物的耐旱能力，对于普通养殖的农业植物
3、或沙漠地带的绿化植物都有很好的保水功能；另外，还有保护细胞膜的作用，能够防止渗透压对植物造成的破坏，从而提高植物的抗盐碱的能力；而近年来，许多研究指出，寡糖是许多植物甚至动物的防御机制的重要分子，当动植物遭受病虫害攻击时，会出现某些寡糖的含量增高，这些寡糖能够刺激动植物提高体内的活性氧，引发体内一系列的防御信号，从而起到抗菌、抗病虫害等作用。所以，紫菜多糖和多糖的降解产物寡糖经处理后，能够向绿色农药方向发展，成为生物肥的另一重要来源。另外也有很多关于海藻生物肥方面的报道，海藻肥含有丰富的营养，含有大量的非含氮有机物，有陆生植物列法比拟的K、CA、MG、FE、ZN、I等40余种矿物质元素和丰富的
4、维生素，特别含有海藻中所特有的海藻多糖、藻朊酸、高度不饱和脂肪酸和多种天然植物生长调节剂，如植物生长素、赤霉素、类细胞分裂素、多酚化合物及抗生素类物质等，具有很高的生物活性，可刺激植物体内非特异性活性因子的产生和调节内源激素的平衡。海藻肥中的有效组分经过特殊处理后，呈极易被植物吸收的活性状态，在施用后2一3H进入植物体内，并具有很快的吸收传导速度。海藻肥中含有天然植物生长调节剂如生长素、细胞分裂素类物质和赤霉素等，具有很高的生物活性，各种物质的比例与天然植物中各激素比例相近。海藻肥是一种天然生物制剂，可与植物一土壤生态系统和谐的起作用。它含有的天然化合物如藻朊酸钠是天然土壤调整剂，能促进土壤团
5、粒结构的形成，改善土壤内部孔隙空间，协调土壤中固、液、气三者比例，恢复由于土壤负担过重和化学污染而失去的天然胶质平衡，增加土壤生物活动，增加速效养分的释放，有利于根系生长，提高作物的抗逆性。这种肥料属纯天然物质，不会造成环境、人畜的损伤。这样不仅减少了紫菜的浪费，另一方面也会极大的提高它的经经济效益，也增加了制备生物肥的资源，为我们的农业作出贡献，降低化学肥料对农业所遭成的污染。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1、发酵液的制备设计不同的发酵条件和时间，得到不同的发酵液；2、降解液浸泡种子把不同条件下得到的降解液配制成不同的浓度，用于浸泡种子，然后观察种子的发芽速度和发芽率，筛选出种
6、子发芽速度和发芽率最佳的一个浓度。3、降解液用于植物叶面喷洒把不同条件下得到的降解液配制成不同的浓度，喷洒于植物的叶面，水作为空白对照，筛选出对植物叶绿素含量影响最佳的一个浓度。4、降解液对植物抗逆的作用把不同条件下得到的降解液配制成不同的浓度，对大豆的子叶进行处理，测定大豆的植保素的含量，筛选出一个对植物抗逆作用最佳的浓度。拟解决的主要问题摸索出一个琼脂菌降解紫菜（粉）的最佳降解条件，并筛选出对植物生长、抗逆最有利的浓度。三、研究的方法与技术路线研究方法1、用琼脂菌对已粉碎的紫菜进行不同的时间段降解，得到降解液；2、把降解液配制成不同的溶度，使其以不同的方式对植物进行处理；3、测定各项指标，
7、筛选出最佳的溶度。技术路线1）琼胶降解菌的培养、发酵；2）菌对紫菜的降解研究，包括降解条件的摸索、降解物的获取；3）植物的培养，以不同方式施用降解物，检测植物的发芽、生长情况、叶绿素水平、呼吸能力等指标。四、研究的总体安排与进度2010年03月到2010年04月查阅文献、资料，准备实验中要用的材料和仪器。2010年05月到2011年01月进行实验和外文文献的翻译。菌的活化制备发酵液紫菜粉上清液反应条件的优化，包括反应时间，所用的发酵液和紫菜的量浸泡种子不浸泡种子喷洒叶面不喷洒叶面观察植物的发芽率，生长速度，叶片大小及颜色，气孔大小，呼吸情况，叶绿素含量2011年01月到2011年03月完成毕业
8、论文。2011年05月准备毕业论文答辩。五、主要参考文献1秦青,张文举,张涛海藻有机肥的研究进展J中国农学通报，2001，17146492ILSEFOISSNER,DAVIDWENDEHENNE,CHRISTIANLANGEBARTELSETALINVIVOIMAGINGOFANELICITORINDUCEDNITRICOXIDEBURSTINTOBACCOJCROPPROTECTION,2000,2368178243许加超,单俊伟,刘铁玲,等海藻精肥的生产工艺中国发明专利CN1513815A4刘庆年,李红梅,曹洪涛阿卡迪安海藻对马铃薯幼苗生长和薯块产量的影响J中国蔬菜2008,231325马
9、英杰，钟鸣株芘降解菌的培养条件优化及特性研究J现代农业科学,2008,15337396袁华芳,周刚雷力海藻肥在大棚番茄上的应用试验J上海蔬菜,20103627王冠宙,宋国通“明月”海藻肥在黄瓜生产的应用效果试验J蔬菜，2001，1024258马莲菊,卜宁L,马纯艳,等褐藻胶寡糖对豌豆种子萌发和幼苗的某些生理特性的影响J植物生理学通讯,2007,436109711009郭艳玲,乔振杰,郭昌春,等海藻肥对蔬菜种子萌发的影响J安徽农学通报，,2008,14146869,14810张付云,赵小明,白雪芳,等壳寡糖诱导植物抗病性研究进展J中国生物防治,2008,24217417811肖志强美奇天然海藻肥
10、在大豆上应用效果J现代化农业，2010,51412陆若辉海藻肥的应用方法和效果J农业新技术肥料与农药，2004,3363713岳宏忠,侯栋,刘明军,等海藻肥对黄瓜种子萌发盐胁迫伤害的缓解作用J中国蔬菜，2005，6242514陶龙红,王友好,房传胜新型海藻叶面肥在作物上的应用效果J安徽农业科学，2006,34153755375615刘子会,郭秀林,王刚,等干旱胁迫与ABA的信号转导J植物学通报,2004,21222823416JOSEPHKUCDEVELOPMENTANDFUTUREDIRECTIONOFINDUCEDSYSTEMICRESISTANCEINPLANTSJTHEPLANTJOU
11、RNAL,2000,1985986117李国庭海藻生物肥的研制J河北工业科技，2009，26537037218姜学玲,王荣,孙亮,等“爱吉富”海藻肥在甜樱桃上的应用J烟台果树，2009，12519隋战鹰海藻肥料的应用前景J生物学通报，2006,4111192020孙锦,于庆文5种海藻肥在黄瓜上的施用效果比较试验J甘肃农业科技,20052444621孙锦,韩丽君,于庆文海藻肥对番茄抗旱性的影响J北方园艺,20053646622陈灵芝,孙锦海藻肥在辣椒上的应用效果J辣椒杂志,20052222323赵秀芬,李俊良海藻肥在蔬菜生产上的应用研究J安徽农业科学，2009，3762610，261624韩丽君
12、,范晓,房国明海藻提取物对蔬菜种子萌芽的影响J海洋科学，2000，24（11）81025TAYLOUJSTHEEFFECTOFASEADWEEDEXTRACTCOUTAIOLOGEYVHINIOONTHEGROWTHANDYIELDOFBURLEYJCANJPLANTSCI,1990,701163116726TAYSAINDENTIFIEATIONOFCYTOHININGLUEOSIDESINSEAWEEDEXTRACTJJPLANTGROWTHREGULATION,1987513313827吴江海藻肥的开发及市场前景J世界农业,2003,346毕业论文文献综述生物技术海藻肥的研究现状及发展前
13、景摘要海藻肥是以海藻为原料，经过加工破碎细胞释放内容物加工，保留了海藻天然活性成分的一种新型肥料，具有促生、增产、改良土壤、抗病等特点，适用于各种作物，在国外广泛应用。国内一些蔬菜研究所也用海藻肥对黄瓜、番茄、辣椒等进行试验，也具有不同程度的增产效果。海藻肥对农业的可持续发展有着重要的作用。关键词海藻肥；应用；研究现状；前景0引言海藻生物肥被科技界誉为当今世界上唯一的人和植物能“喝”的金津玉液，具有显著的生物功效，同时具备了目前最先进肥料的特征。用作肥料的海藻一般是大型经济藻类，如巨藻MACROEYSTIS，泡叶藻ASEOPHYLLUM，海囊藻NEREOCYSTIS，昆布ECKIONIA等1。
14、其核心物质是纯天然海藻提取物，主要原料选自天然海藻，经过特殊生化工艺处理，提取海藻中的精华物质，极大地保留了天然活性组份，含有大量的非含氮有机物，有陆生植物无法比拟的K、CA、MG、FE、ZN、I等40余种矿物质元素和丰富的维生素，特别含有海藻中所特有的海藻多糖、藻酝酸、高度不饱和脂肪酸和多种天然植物生长调节剂，具有很高的生物活性，可刺激植物体内非特异性活性因子的产生和调节内源激素的平衡1,2。1海藻肥的应用及研究现状据文献记载,16世纪英国人就开始利用海藻制作肥料,17世纪法国政府推广在沿海地区利用海藻为土壤肥料,并明文规定采集海藻的条件、收割时间以及海域等，1880年有人第1次进行施用海藻
15、肥的实验,表明海藻肥具有明显的效应。上世纪五十年代，英国的第一代、第二代海藻肥就已相继问世，并投入使用。20世纪80年代,挪威、英国、法国、新西兰等国家利用海藻制造出海藻精1。1993年，美国PHOENIX250海藻肥还被美国农业部正式确定为美国本土农业专用肥。我国起初都是直接引进国外的海藻肥产品或生产技术，在1995年才提出研究海藻肥的公关课题，由中国科学院海洋研究所承担，并在韩丽君、范晓等专家的带领下，着手开展“海藻抗逆植物生长剂”的研究工作，2003年，项目组取得重大突破，首次在国际上使用“二级混合制备技术”研制成功了我国具有自主知识产权的海藻肥，打破了自1950年以来外国垄断生产海藻肥
16、的历史。2003年9月，由甘肃省农科院蔬菜所研制的新型肥料海藻肥获得鉴定验收，该项目首次采用细胞破碎技术，有针对性的提取技术制备海藻肥，研制开发出蔬菜、中药材、马铃薯、花卉等作物及抗旱、抗病毒、保花保果专用型海藻肥。2004年中国海洋大学的许加超等人发表了海藻精肥的生产工艺路线3。目前国内生产的海藻肥产品较少，主要有90年代初,北京雷力集团研制出以海洋速生褐藻为主要原料的海藻肥4，青岛明月海藻工业有限公司生产的明月海藻肥，中外合资青岛金秋农业科技有限公司生产的美奇海藻肥等5。近年来针对海藻肥的在各种作物上的应用效果，我国开展了许多的研究。袁华芳,周刚在上海长征园艺实验场，利用北京雷力农用化学有
17、限公司提供的雷力海藻肥，以三元复合肥为对照研究海藻肥在大棚番茄上的应用，实验结果表明雷力海藻肥处理区番茄生长势强，茎粗、根系发达，耐寒性强，叶肉厚，叶色浓，病虫害轻，特别是生长中后期肥效尤其明显6。王冠宙等人利用中科院海洋所与青岛胶南“明月”海藻工业公司联合研制开发“明月”海藻肥探索海藻肥在黄瓜生产上的应用效果，实验结果表明海藻肥在黄瓜上施用有明显的增产效果，用量以80100G/667M2为好，施用方法以浓度8001200倍浸种或喷施为宜7。2006年中国海洋大学的翟学彦等人利用青岛明月海藻集团有限公司提供的海藻肥对小白菜和菠菜进行实验，结果发现喷施叶面肥处理的小白菜和菠菜的含量明显高于未经叶
18、面肥处理的小白菜和菠菜，另外还发现海藻肥明显减少久效磷和乐果两种有机磷农药在小白菜和菠菜中的残留量,且时间越长,残留量越少,降解效果越明显8。郭艳玲等人用青岛明月海藻集团的海藻液肥，并稀释200、400、600、800、1000倍配制海藻肥溶液，以清水为对照研究海藻肥对蔬菜种子萌发的影响，实验结果显示黄瓜、番茄在不同温度下（在一定温度范围内）经海藻肥浸种后，都能促进发芽，促进幼苗特别是根系的生长，在较低温度下效果更为显著，并针对所用的海藻肥，筛选出番茄、黄瓜的使用浓度都以稀释600倍左右为宜9。徐秀娟,赵志强等人利用中外合资青岛金秋农业科技有限公司生产的美奇天然海藻肥研究海藻肥在有机食品花生上
19、应用，研究结果表明美奇天然海藻肥用于花生生产,既防病又增产,防病增产效果优于参试的其他增产剂,而且无毒无残留,是生产有机食品的理想制剂10。肖志强用中美合资青岛金秋农业科技有限公司生产的美奇天然海藻肥于2008年在黑龙江省农垦科学院院内试验地中进行海藻肥在大豆上应用效果的研究，研究结果表明美奇天然海藻叶面肥对大豆增产作用明显,使用方法方便,对产量构成因素有促进作用,效益较为明显11。浙江省农业厅土肥站的陆若辉对直接食用藻类（如海带、紫菜等）和非直接食用藻类（如江蓠、麒麟菜、马尾藻等）进行发酵、浸提、脱水处理得到海藻肥。使其作用于油菜、春大豆、秋大豆、西瓜等农作物，结果发现施用海藻肥能够明显增加
20、油菜籽产量，与习惯施肥相比，加喷海藻肥可使油菜籽的颗粒饱满程度大大提高；施用过海藻肥的春大豆的单粒荚数量大大下降，豆荚的性状明显得到改良，在单价上具有明显优势，同时增产效果十分显著；喷施海藻肥的秋大豆的生物性状有明显改善，其中植株明显增高、分枝数增多、百荚重提高、出豆米的比率也有所上升等；施用海藻肥对西瓜的品质改良尤为显著，西瓜糖度明显提高，与习惯施肥相比较，增加了15度左右，增产效果也较为明显12。2003年岳宏忠等人利用上海同天实业发展有限公司提供的海藻肥KELPAK，研究海藻肥对黄瓜种子萌发盐胁迫伤害的缓解作用，结果表明，盐胁迫环境下的黄瓜种子在浸种与催芽期间分别给予01海藻肥处理均有缓
21、解伤害的作用，持续处理缓解作用更显著，这对盐渍土及连作地块上的蔬菜生产有很大的实际意义13。陶龙红,王友好等人利用安徽省农科院土壤肥料研究所研制,暂定名为海藻肥一号、二号的海藻肥研究了海藻叶面肥在黄瓜、苞菜、番茄、水稻、棉花、黄豆等作物上的应用效果，实验结果表明海藻叶面肥有利于作物根系生长,提高作物的抗逆性,使作物提早成熟和改善品质，可使作物增产103014。韩晓弟等人利用海带采收、加工过程产生的废料固着器俗称海带根为主要原料及自行研制的2种海带提取液,研究其对中药圆叶牵牛种子萌发及幼苗生长的影响，结果表明海带提取液能显著提高种子的萌发率；促进牵牛根系的生长发育,增加根系体积、鲜重与干重；促进
22、地上部分的生长,其干重、鲜重明显提高15。现阶段国外的海藻肥料产品为了尽可能地保留海藻天然的有机成分，同时便于运输和不受时间的限制，用不同的方法将海藻提取液制成液体肥料。其生产过程大致为筛选适宜的海藻品种，通过各种技术手段使细胞壁破碎，内容物释放，浓缩形成海藻精浓缩液，极大地保留海藻的天然活性成分。海藻肥中的有机活性因子对刺激植物生长起着重要的作用，集营养成分、抗生物质、植物激素于一体1,16。国内生物肥的制备一般是以褐藻为原料，通过化学方法或酶解方法获得，如河北科技大学化学与制药工程学院的李国庭以天然海藻为主要原料，配以少量的氢氧化钾，在高压下进行水解，经固液分离等步骤制得天然、有机、高效、
23、多功能海藻生物肥产品17；德国诺美制药股份有限公司自主研发的高科技产品“爱吉富”海藻肥，以大西洋泡叶藻为主要原料，采用世界领先的常温酶解提取工艺浓缩而成，所得到的生物肥富含微量元素、维生素、酶、氨基酸、多糖、植物生长调节剂等，提高了大樱桃的坐果率，还能够减轻或消除多种中微量元素缺素症18。2海藻肥在我国的发展前景海藻肥现已在世界上许多国家大面积推广应用，取得了十分显著的经济效益、社会效益与生态效益。海藻肥是继农家有机肥、化肥、生物肥之后的第4代肥料，其具有农家肥提供的全面的营养成分，不污染环境，还能培肥地力改良土壤；同时具有化肥的速效性，具有生物肥料促进作物生长发育，提高产量，改善品质与活化土
24、壤等作用；另外还能驱虫、防病、治病、提高作物抗旱和抗寒等功效19。目前海藻肥在黄瓜20、番茄21、辣椒22、菠菜23、大白菜24等蔬菜作物上的应用效果已有报道。孙锦等人利用中国科学院海洋研究所提供的海藻抗逆专用型增产素抗旱专用海藻肥研究海藻肥对番茄抗旱性的影响，在番茄苗期用不同浓度的海藻肥处理番茄幼株,结果表明对所选用的海藻肥而言，20G/L克/升的海藻肥可显著提高番茄幼株的抗旱性,在土壤含水量为106的水分胁迫下,用20G/L克/升的海藻肥处理日光温室番茄植株,可使番茄最大节水率达到22621。2002年2003年陈灵芝等人利用兰州陇丰农产品有限公司提供KELPAK海藻肥研究海藻肥在辣椒上的
25、应用效果，结果表明不同浓度的海藻肥对辣椒都有促进早熟、提高产量的作用，但以1000倍效果最佳22。多项研究证实海藻肥对农作物提早成熟、提高产量和改善品质以及在水果保鲜和抵抗病虫害等方面均产生了明显的作用，果蔬保存时间也明显延长25,26。目前海藻液体肥因具有促进作物根系发育，提高作物光合效率，促进作物根系和主茎生长，提高作物产量和品质，增强作物对不良环境的抵抗能力，促进果实早熟等优点3，在一定程度上能替代化学肥料，能够扼制化肥持续使用对土地资源的破坏和加速植被生长，对我国保护耕地、保护山林、防治土地荒漠化等诸多方面有着深远的意义，对我国乃至世界的可持续发展有着不可估量的重大作用。我国有着丰富的
26、海藻资源，海藻的产量和资源都居世界第一，对海藻肥的开发也提供了较不便利的条件。3小结当前世界市场上应用最多的海藻肥来源于欧洲的泡叶藻干粉，还有一些产品是由墨角藻、昆布、马尾藻等褐藻制成，还未曾见有关紫菜生物肥方面的报道。在提取工艺上，澳大利亚、新西兰和挪威的大部分厂家通过热水对干的或湿的海藻进行萃取，有时还要添加碳酸钠或氢氧化钾进行水解27。但碱水解法、高温或高压脱水、超低温临界萃取等，可能会破坏新鲜海藻的一些活性成分或者降低其中有效成分的含量。本实验意在用紫菜作为生物肥的材料来源，用微粉碎法对紫菜进行前期处理，然后用细胞壁降解菌对紫菜进行前处理，以获得海藻肥。由于用的是细胞壁降解菌，所以不会
27、对海藻的活性成分遭成破坏，最大程度的保留了海藻的有效成分。这样不仅减少了紫菜的浪费，提高它的经经济效益，也增加了制备生物肥的资源，对降低化学肥料对农业所遭成的污染也有一定的意义。参考文献1秦青,张文举,张涛海藻有机肥的研究进展J中国农学通报,2001,17146492CASSANL,ETALBOTMAR1992,354374393许加超,单俊伟,刘铁玲,等海藻精肥的生产工艺中国发明专利CN1513815A4刘庆年,李红梅,曹洪涛阿卡迪安海藻对马铃薯幼苗生长和薯块产量的影响J中国蔬菜2008,231325陈秋雪,苏壮新型肥料一海藻肥J土壤肥料,20062416袁华芳,周刚雷力海藻肥在大棚番茄上的
28、应用试验J上海蔬菜,20103627王冠宙,宋国通“明月”海藻肥在黄瓜生产的应用效果试验J蔬菜,2001,1024258翟学彦,汪东风,等复合海藻肥对小白菜与菠菜产量及农药残留的影响J山东农业科学,2007,383849郭艳玲,乔振杰,郭昌春,等海藻肥对蔬菜种子萌发的影响J安徽农学通报,2008,14146869,14810徐秀娟,赵志强,卢钰,等美奇海藻肥在有机食品花生上的应用试验示范J山东农业科学,2005,1575811肖志强美奇天然海藻肥在大豆上应用效果J现代化农业,2010,51412陆若辉海藻肥的应用方法和效果J农业新技术肥料与农药,2004,3363713岳宏忠,侯栋,刘明军,等
29、海藻肥对黄瓜种子萌发盐胁迫伤害的缓解作用J中国蔬菜,2005,6242514陶龙红,王友好,房传胜新型海藻叶面肥在作物上的应用效果J安徽农业科学,2006,34153755375615韩晓弟,赵宏,武冬雪海带提取液对圆叶牵牛种子萌发与幼苗生长的影响J特产研究,2008,2293216JEANNINI,ETALBTOMAR1989,3446947317李国庭海藻生物肥的研制J河北工业科技,2009,26537037218姜学玲,王荣,孙亮,等“爱吉富”海藻肥在甜樱桃上的应用J烟台果树,2009,12519隋战鹰海藻肥料的应用前景J生物学通报,2006,4111192020孙锦,于庆文5种海藻肥在
30、黄瓜上的施用效果比较试验J甘肃农业科技,20052444621孙锦,韩丽君,于庆文海藻肥对番茄抗旱性的影响J北方园艺,20053646622陈灵芝,孙锦海藻肥在辣椒上的应用效果J辣椒杂志,20052222323赵秀芬,李俊良海藻肥在蔬菜生产上的应用研究J安徽农业科学,2009,3762610,261624韩丽君,范晓,房国明海藻提取物对蔬菜种子萌芽的影响J海洋科学,2000,241181025NELSONWR,JVANSTADENJPLANTPHYSIOL,1984A,11543343726NELSONWR,JVANSTADENHORTSCIENCE,1984B,19818227吴江海藻肥的开
31、发及市场前景J世界农业,2003,346本科毕业设计（20_届）紫菜生物肥的研制目录摘要1引言111海藻肥的应用价值112海藻肥的应用前景113海藻肥的研究现状12材料与仪器221实验材料222实验仪器23实验方法231菌的培养232紫菜的降解233不同降解液中的还原糖含量234浸泡种子235植物叶面喷洒336降解液对植物抗逆的作用337数据的处理34结果341不同降解液中还原糖的含量342对种子的发芽率和发芽速度影响最大的浓度筛选443降解液对植物茎长、叶绿素含量的影响5431降解液对植物茎长的影响5432降解液对植物叶绿素含量的影响644降解液对植物抗逆性的影响7441气孔闭合度观察744
32、2植保素含量的测定85讨论9参考文献11摘要目的摸索出琼脂菌降解紫菜（粉）获得生物肥的最佳降解条件，并筛选出对植物生长、抗逆最有利的样品及浓度。方法经活化的琼脂菌作用于紫菜（粉）对其进行不同时间的降解，所得到的降解液以不同的浓度、不同的方式作用于农作物，通过测定农作物的发芽速率、气孔大小、叶绿素含量及植保素含量等指标，筛选出一个最佳降解条件。结果第一次发酵24H，第二次发酵36H的溶液经稀释30倍后，对植物的发芽率有较好的效果，在发芽初期，经浸泡的种子的发芽势比没浸泡过的种子的发芽势高出50；第一次发酵24H,第二次发酵36H的溶液经稀释50倍后，能显著提高植物叶片中叶绿素的含量（P001）；
33、第一次发酵24H，第二次发酵36H的溶液经稀释50倍后，作用于大豆，大豆的植保素含量也显著增高（P001）。经这种琼胶降解菌破碎紫菜的细胞壁，不仅释放出了细胞内容物，保留了海藻天然活性成分，同时获得有促植物抗逆作用的琼胶寡糖，具有促生、增产、改良土壤、抗病等特点，适用于各种作物，这种生物肥对农业的可持续发展有着重要的作用。关键词琼脂菌；降解紫菜；生物肥ABSTRACTAIMTOEXPLORETHEBESTDEGRADATIONCONDITIONSFORTHEPORPHYRAFERTILIZER,ANDTOSCREENOUTTHEBESTSAMPLESANDCONCENTRATIONSFORPL
34、ANTGROWTHANDRESISTANCEMETHODSACTIVATEDBACTERIAWEREUSEDTDEGRADESEAWEEDPOWDER,ANDTHENTHERECEIVEDDEGRADATIONSOLUTIONWASACTEDONTHECROPSINDIFFERENTCONCENTRATIONSANDDIFFERENTWAYSSELECTONEOFTHEBESTDEGRADATIONCONDITIONSBYMEASURINGTHEGERMINATIONRATEOFCROPS,STOMATALSIZE,CHLOROPHYLLCONTENTANDPHYTOALEXINCONTENT
35、ANDOTHERINDICATORSRESULTSTHEPORPHYRAPOWDERWASFERMENTEDFORTWICE,THESOLUTIONFROMFIRSTOF24HANDSECONDOF36HFERMENTATIONTIMEWITH30TIMESDILUTIONSHOWEDHIGHESTGERMINATIONRATEFORPLANTS,THEGERMINATIONRATIOWAS50HIGHERTHANCONTROLTHISSOLUTIONDILUTEDFOR50TIMESCOULDSIGNIFICANTLYINCREASETHECHLOROPHYLLCONTENTOFPLANTS
36、P001USINGTHESAMESOLUTIONDILUTEDFOR50TIMESTOTREATSOYBEAN,RESULTSSHOWEDTHATTHEPHYTOALEXINOFSOYBEANWASSIGNIFICANTLYINCREASEDP001INCONCLUSION,USINGAGARDEGRADINGBACTERIATODISRUPTTHECELLWALLOFPORPHYRANOTONLYINCREASEDTHERELEASEOFNATURALACTIVEINGREDIENTSINCELLS,PRESERVEDLOSSOFTHESEINGREDIENTS,BUTALSOOBTAINE
37、DAGAROLIGOSACCHARIDESWHICHCANPROMOTETHESTRESSTOLERANCEOFPLANTSRESULTSINDICATETHATTHEPRODUCTWEOBTAINEDHASGROWTHPROMOTING,IMPROVESOILDISEASERESISTANCEANDOTHERCHARACTERISTICS,ANDTHISBIOFERTILIZERISSUITABLEFORVARIOUSCROPSKEYWORDSAGARDEGRADINGBACTERIAPORPHYRAFERTILIZER1引言11海藻肥的应用价值海藻肥是有机肥、化肥、生物肥之后的第4代新型肥
38、料，它能提供的全面的营养成分，不产生环境污染，还能改善土壤的性质；同时还具有化肥的速效性，增加产量，改良品质与活化土壤等相关作用；另外还能防病、治病、加强作物抗旱和抗寒等功效19。海藻生物肥被科技界誉为当今世界上唯一的人和植物都能“喝”的金津玉液，具有显著的生物功效，同时具备了目前最先进肥料的特征。其主要作用物质是天然海藻提取物，核心原料来自天然海藻，采用特殊生化工艺处理后，从海藻中提取的精华物质很好地保留了天然活性成份，具有大量的非含氮有机物，含有40余种矿物质元素以及丰富的维生素，还具有海藻中所特有的海藻多糖、高度不饱和脂肪酸和多种天然植物生长调节剂，可以刺激植物体内非特异性活性因子的产生
39、以及调节内源激素的相对平衡1,2。这种肥料属纯天然物质，不会造成环境、人畜的损伤。海藻肥不仅减少了海洋藻类物质的浪费，另一方面也会极大的提高它们的经济效益，同时也增加了制备农作物肥料的资源，为我们的农业作出贡献，降低化学肥料对农业所遭成的污染。12海藻肥的应用前景现在在世界上许多国家都大面积推广应用海藻肥，取得了巨大的经济效益、生态效益与社会效益。目前海藻肥在黄瓜20、番茄21、辣椒22、菠菜23、大白菜24等蔬菜作物上的应用效果已有报道。孙锦等人利用中国科学院海洋研究所提供的海藻抗逆专用型增产素抗旱专用海藻肥研究海藻肥对番茄抗旱性的影响，在番茄苗期用不同浓度的海藻肥处理番茄幼株,结果表明对所
40、选用的海藻肥而言，20G/L（克/升）的海藻肥可显著提高番茄幼株的抗旱性,在土壤含水量为106的水分胁迫下，用20G/L（克/升）的海藻肥处理日光温室番茄植株，可使番茄最大节水率达到22621。2002年2003年陈灵芝等人利用兰州陇丰农产品有限公司提供KELPAK海藻肥研究海藻肥在辣椒上的应用效果，结果表明不同浓度的海藻肥对辣椒都有促进早熟、提高产量的作用，但以1000倍效果最佳22。多项研究证实海藻肥对农作物早熟、增加产量和改善品质以及在抵抗病虫害和水果保鲜等方面都具有明显的应用效果，果蔬的保存时间也得到明显延长25,26。目前海藻液体肥因具有促进作物根系发育，提高作物光合效率，促进作物根
41、系和主茎生长，提高作物产量和品质，增强作物对不良环境的抵抗能力，促进果实早熟等优点3，在一定程度上能取代化学肥料，能够保持环境和生态的稳定，对我国很多环境方面都有着深远的意义。我国有着丰富的海藻资源，海藻的产量和资源都居世界第一，对海藻肥的开发也提供了较为便利的条件。13海藻肥的研究现状中国拥有丰富的海藻资源，但在国内海藻肥的研制仅仅起始于上世纪90年代后期，起步比较晚，但目前发展速度很快。目前有多种形态但是目前市场上主要是以液体跟粉末为主，还有很少一部分是颗粒状态。海藻肥中含有的有机活性因子对刺激植物生长起着至关重要的作用，集营养成分、抗生物质、植物激素于一体1,16。目前国内生产的海藻肥产
42、品还不是很多，现阶段国外生产的海藻肥产品为了尽可能地保留海藻天然的有机成分，同时为了方便运输，采用不同的方法将海藻提取剂制成液体肥料。目前国内生产的海藻肥产品较少，主要有90年代初，北京雷力集团研制出以海洋速生褐藻为主要原料的海藻肥4，青岛明月海藻工业有限公司生产的明月海藻肥，中外合资青岛金秋农业科技有限公司生产的美奇海藻肥等5。近年来针对海藻肥的在各种作物上的应用效果，我国开展了许多的研究。国内生物肥的制备一般是以褐藻为原料，通过化学方法或酶解方法获得，目前还未曾见有关于紫菜生物肥方面的报道。2材料与仪器21实验材料绿豆（购于路林市场）；大豆（购于路林市场）；紫菜（粉）；琼脂菌；2216E培
43、养基；陈海水；TRISHCL缓冲液；纯丙酮；CACO3；石英砂；DNS试剂。22实验仪器摇床；离心机；W201D恒温水浴锅上海申顺生物科技有限公司；高压蒸汽灭菌锅；电子式可调电炉南通金石实验仪器有限公司）；MULTIKEMMK3酶标仪THERMOLABSYSTEM公司；电子天平；恒温培养箱；超净工作台；振荡仪；电子显微镜。3实验方法31菌的培养按2216E培养基配方（酵母菌1G；蛋白胨5G；柠檬酸铁01G；琼脂05G；陈海水1000ML）配制培养基。并分装到两个500ML三角瓶（标记号瓶，号瓶），四个50ML三角瓶中，同时配制5个固体斜面培养基。从7冰箱中取出琼脂菌接种于斜面培养基上，并放于2
44、8恒温箱中活化。活化24H后，将斜面上的菌接种在50ML三角瓶中进行摇床培养（28，120R/PPM）。24H后移到500ML三角瓶中继续摇床培养（28，120R/PPM）。32紫菜的降解琼脂菌在500ML的三角瓶中培养24H后，往号瓶中按150的比例加入经微粉碎的紫菜粉；48H后往号瓶按同样的比例加入紫菜粉。，号瓶加入紫菜后继续摇床培养（35，120R/PPM）。培养24H后，把，号瓶取出并煮沸灭菌，然后抽滤，弃沉淀留上清，然后把两瓶上清分装（,）,并对分装后的溶液进行高压蒸汽灭菌。按上述菌活化的方法再活化一批菌，用于对所得到的上清进行二次发酵，发酵时间如下、12H；、24H；、36H。二次
45、发酵后，对溶液中的菌进行灭活，这时得到的降解液就是所要的紫菜生物肥，保存在4冰箱待用。33不同降解液中的还原糖含量用DNS比色法测其还原糖含量，具体操作如下取待测样品和对照（蒸馏水）各1ML，分别加入3ML的DNS试剂，沸水煮沸15分钟显色，冷却后用蒸馏水稀释至25ML，用72型分光光度计比色（550NM），以对照液调零点。用预先以葡萄糖做好的标准曲线即可计算出样品中糖的含量。34浸泡种子把上述不同条件下得到的降解液配制成不同的浓度，用于浸泡种子，然后观察种子的发芽速度和发芽率，筛选出对种子发芽速度和发芽率效果最佳的一个浓度用绿豆做为实验材料，将不同条件下得到的降解液配制成不同浓度的溶液，将处
46、理过的绿豆种子浸泡于溶液中24H，然后将绿豆种子移植到土壤中（由于绿豆本身也较好发芽，放在培养皿中催芽没有明显效果，所以本实验中是把种子放在溶液中浸泡24H，而后移植到土壤中，观察其出土速度）；用蚕豆作实验材料，将所得到的降解溶液配制成10100倍的浓度，然后把处理好的蚕豆种子浸泡于各溶液中24H，到时间后，把经浸泡的种子移到放有脱籽棉的培养皿中，置于25的培养箱中催芽。35植物叶面喷洒植物的培养外界温度下，在曹光虝科技楼顶种植绿豆，早晚各浇水一次，待用。将上述不同条件下得到的降解液稀释成0100倍的溶液，喷洒于已长出两片真叶的植物，用蒸馏水喷洒作为空白对照，一周后进行第二次喷洒，二次喷洒7天
47、后测量各植株茎长和并测定各植株的叶绿素含量，对其进行比较，进而筛选出对植物生长、叶绿素含量影响最佳的一个浓度。植物的茎长的测量在二次喷洒植物7天后用测量尺测量每株植物的茎长度，求其平均值。叶绿素测定方法取新鲜叶片，剪去粗大的叶脉并剪成碎块，称取05G，放入研钵中加纯丙酮5ML，少许CACO3和石英砂，研磨成匀浆，再加入80丙酮5ML，将匀浆转入离心管，并用适量80丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃去沉淀，上清液用80丙酮定容到10ML。取上述色素提取液05ML,加80丙酮45ML，稀释后转入比色杯中，以80丙酮为对照，分别测663NM，645NM处的光密度值。36降解液对植物抗逆的作用本实
48、验通过观察绿豆叶片气孔的闭合度和大豆的植保素含量来筛选出对植物抗逆性能影响较好的降解液浓度。具体方法如下取叶片，用蒸馏水洗净，撕下表皮，洗去叶肉细胞后，切成5MM长的表皮条，培养在TRIS缓冲液（10MMOL/LTRIS,50MMOL/LKCL,PH61）中，在23下光照2H，使气孔完全张开。从缓冲液中取出表皮条，置于不同浓度的溶液中培养45小时，在显微镜下观察气孔的闭合程度，每个处理3个表皮条，每个表皮条取3个视野，测3个气孔开度，每个重复3次。植保素测定方法先用大量蒸馏水冲洗大豆表面，用于清除掉杂质和灰尘，接着用1高锰酸钾浸泡处理2030MIN进行灭菌，再用无菌水冲洗大豆表面至干净为止，在
49、暗室下震荡24H，倒出无菌水，将吸涨的种子铺在有滤纸的搪瓷盘中，将湿纱布与滤纸和水相连，25下培养，光照为10H/D，当大豆展出两片真叶（大概8天时间）后即可用子叶进行生物活性测定。测定时剪下子叶，用1高锰酸钾灭菌610MIN，用无菌水冲洗3次，用灭过菌的滤纸将子叶表面的水分吸干，在下表皮用无菌刀片在超净工作台中切下16MM的子叶表皮，无菌水浸泡20S，吸干水分，放在铺滤纸的培养皿中，每个放10片作为一组，将样品（100UL滴加在伤口上，于黑暗条件在25培养,24H后将10个子叶转移到含有10ML去离子水的大试管中震荡30S，然后测定溶液在286NM的吸光值，用其吸光值来表示其诱导产生植保素的相对含量。37数据的处理以上实验均重复做3次，所有数据以均值标准差（XS）表示。组间比较用T检验，以P005为显著差异，P001为极其显著差异4结果41不同降解液中还原糖的含量用DNS比色法求出的所得不同降解液中的还原糖含量如下表1不同降解条件下所得降解液的还原糖含量发酵条件一次发酵24H（）一次发酵36H（）二次发酵12H（）二次发酵24H（）二次发酵36H（）二次发酵12H（）二次发酵24H（）二
