1、1本科毕业论文系列开题报告生物工程三疣梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析一、选题的背景与意义海水养殖塘是一种人工生态系统，微生物特别是细菌对这种生态系统的稳定和平衡起着很关键的作用，对养殖动物健康、生长也有着非常重要的影响。在这个生态系统中，细菌群落组成处于一种相对稳定的状态，此时，有益菌和有害菌包括一些潜在的致病菌）共同存在于环境中，二者的相互制约使得养殖动物处在一个相对稳定的环境中，但一旦微生物群落组成发生了变化，将会导致其生态功能多样性发生较大改变，因此而产生的一系列后果，包括水质的恶化和病害的爆发等，都可能会严重影响水产动物的生长、健康。因此，对养殖环境中的细菌群落组成及其变化进行研究分
2、析是非常有必要的。越来越多的证据表明，由于受到现有条件和技术的限制，目前人们还无法纯培养自然界中绝大部分的微生物，1982年，人们提出了“不可培养活）微生物”的概念徐怀恕等，1982），由于不可培养微生物的物种类群及新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着丰富的多样性和新颖性，因而比起以往的可培养微生物就具有更加多样和丰富的可以供给人类进行开发和利用的生物资源。本研究从三疣梭子蟹养殖塘水样中直接提取细菌总DNA，然后通过构建16SRDNA克隆文库的方法来分析水体中微生物的群落结构差异性，从而更为全面的了解不同养殖阶段养殖水体中微生物的群落组成及变化。三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBE
3、RCULATUS），俗称梭子蟹、白蟹，属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。三疣梭子蟹的渔汛一年有春秋两次，渔期长，产量高，体大肉多，味鲜美，营养丰富，尤其是卵巢和肝脏。卵巢可供作上等调味品。肉除鲜食外,还可制作罐头,畅销国内外。壳可作药材用，又可提取甲壳质，广泛用于多种工业。黄海和东海年产量各有12万吨上下。为中国最重要的海产蟹，经济意义重大。近似种南海和东海还有远海梭子蟹PPELAGICUS和红星梭子蟹PSANGUINOLENTUS，在南海为常见经济种1。随着梭子蟹养殖业的快速发展，养殖规模不断扩大，养殖密度不
4、断提高，梭子蟹的病害2日益严重，并成为制约其健康发展的重要因素。能否有效控制疾病的发生和流行，关系到梭子蟹产业化养殖的健康、持续发展24。国内外许多学者对海洋细菌的生态分布、对虾养成期间水体和虾体中的异养细菌进行了大量的研究但对梭子蟹养殖环境及生物体内的细菌学研究至今很少报道。国外的主要有KMUROGA,KSSZUIK,KISHIMARU5对三疣梭子蟹弧菌LARVICULTURE，国内主要是张恒庆等对于三疣梭子蟹水体细菌多样性的研究6和张德民等对三疣梭子蟹养殖塘底泥进行DGGE分析细菌多样性7。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1通过克隆文库和PCRDGGE的方法确定梭子蟹养殖
5、塘水体中细菌的多样性；2通过测序和系统发育分析确定细菌的系统发育关系。拟解决的问题确定三疣梭子蟹养殖塘水体中细菌的多样性，并分析其在不同养殖阶段的群落差异。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1样品的采集我们对宁海县明港东坝的三疣梭子蟹养殖塘进行为期两个月的跟踪调查。调查期间分批次的采集水样，采样间隔为2030D。采样时间为上午11001300，水样的采集方法遵照海洋调查规范第6部分海洋生物调查GB/T1276362007）的要求进行，应用深水采样器采集水样，采样前，开动水车30分钟，以使水体充分混匀，从深度约05M处取水，采样量为5L，共采样3次。样品采集后立即置于黑暗、4的环境保存,采集
6、4H内进行后续实验。2菌体收集采用MILLIPORE过滤浓缩系统收集水样中的菌体，用1M的微孔滤膜进行预过滤，去除水中漂浮的杂质和一些较大的真核单细胞浮游生物。过滤水样的体积为2L，收集滤液，将滤液经过022M的微孔滤膜再次过滤，菌体被截留在滤膜上。在无菌操作条件下，将滤膜剪碎后，置于50ML无菌聚乙烯离心管中待用。3样品总DNA提取31试剂溶菌酶缓冲液340MMEDTA，PH8050MMTRISCL，PH8010M/V）蔗糖用022M的过滤器过滤除菌，4保存。STE缓冲液10MMEDTA，PH8025MMTRISCL，PH8050MM葡萄糖121灭菌20MIN，4保存。1工作液，PH801M
7、MEDTA，PH8010MMTRISCL，PH80TE缓冲液100MMTRISCL，PH8010MMEDTA，PH8010贮存液，PH80分装后121灭菌20MIN，室温保存。32SDS煮沸法提取DNA向M1管中加入5MLSTE缓冲液，在漩涡混合器上进行充分振荡；加1/10体积的20的SDS溶液约500L），混匀后，用沸水浴25MIN，将裂解液转移至新的无菌离心管中，20，10MIN；室温离心，10000RPM，10MIN，弃去上清液；用600L的1TE缓冲液溶解沉淀，然后将溶液转移至15MLEPPENDORF管中；加等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液25241，V/V），用手轻轻混匀。离心，100
8、00RPM，4MIN；收集上清液，然后再加入等体积的氯仿/异戊醇溶液241，V/V）混匀，离心，10000RPM，4MIN；收集上清液，然后加入1/10体积的3M的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀，室温沉淀10MIN，离心，10000RPM，10MIN；4用70乙醇洗涤，然后再次离心，弃去上清液，自然风干，加1TE溶液或无菌双蒸水溶解DNA，置于20保存；4PCR扩增16SRDNA全序列选用细菌通用性引物对27F/1541R，扩增细菌16SRDNA的全序列，其中引物序列见表1。表1扩增不同16SRDNA片段所用引物列表TAB1PRIMERSFOR16SRDNAAMPLIFICATION引物名称
9、引物序列（53）扩增片段片段大小27FAGAPTTTGATCCTGGCTCAG16SRDNA全序列约1500BP1541RACGGCTACCTTGTTACGACT50L的PCR反应体系组成为10BUFFER（含MG2）5L正向及反向引物4MOL/LDNTP200MOL/LTAQDNA聚合酶1U模板DNA50NG补双蒸水至50L。为获得较好的特异性产物，采用降落PCR对反应体系进行扩增。PCR反应程序（适用于引物对GC341F和518R）94，5MIN；94，1MIN，60，1MIN，降落梯度为0510个循环72，05MIN；94，1MIN，55，1MIN，18个循环72，05MIN；72，3M
10、IN。5PCR产物采用15W/V琼脂糖凝胶（含有05G/ML溴化乙锭）电泳进行检测，点样量为45L。516SRDNA克隆文库的构建及测序琼脂糖凝胶电泳后，将PCR产物对应的条带切下，用UNIQ10柱式通用DNA纯化试剂盒上海生工）进行纯化回收DNA，将产物连接到PMD18TVECTORTAKARA）上，连接反应的体系及反应条件应参考试剂盒厂家推荐的方法，然后根据实际情况进行适当的调整。6基于16SRDNA的系统发育学分析运用CHECKCHIMERA程序在RDP数据库中对得到的序列进行嵌合体检验，排除质量较差的序列。用FASTGROUPIIHTTP/BIOMESDSUEDU/FASTGROUP/
11、FG_TOOLSHTM）程序对每个克隆文库的序列进行分组，并将相似性大于98的菌株作为一个OUT，即可操作分类单元，其中每个OUT中选择一株菌作为代表菌株，并用BLAST进行同源性搜索，然后选取与其同源性较高的菌株的16SRDNA序列作为参比对象。将得到的序列进行进一步的系统发育分析，利用MEGA4软件进行多重序列比对，并采用邻接法构建系统发育树。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度2010220103毕业论文选题62010320105进行文献查阅和资料收集，制定具体研究计划和试验方案。2010520106采购必要材料和实验需要的器材2010720109去养殖塘采样根据实验方法测定细菌多样性
12、201012开题答辩与综述。2011420115完成2篇外文翻译，论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1薛俊增，中国三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUSMIERS的研究，东海海洋，1977,15（4）2许文军,金海卫,丁跃平,等秋冬季三疣梭子蟹PORTUNSTRTUBERCULATUSMIES暂养常见疾病及防治措施J现代渔业信息，2004，19（7）22254李卢，三疣梭子蟹的常见病及其防治J水产科技情报，2005，3262692715魏育红，薛仁宇，朱越雄蟹类的病毒性和细菌性疾病研究进展J内陆水产，2001，26242436KMUROGA,KSSZUIK,KISHIMA
13、RUVIBRIOSISOFSWIMMINGCRABPORTUNUSTRITUBERCULATUSINLARVICULTURE，JOURNALOFTHEWORLD，19947张恒庆,初航,温丹，张德民三疣梭子蟹养殖池塘水体中异养细菌菌群特征的研究辽宁师范大学学报自然科学版,2008,3022202247毕业论文文献综述生物工程三疣梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析摘要三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）是我国海产经济蟹类，近年来浙江省沿海的三疣梭子蟹养殖业发展非常迅速，但是病害发生频繁，成为其稳产、高产的主要限制瓶颈。由于养殖水体中微生物的多样性特别是异养细菌的菌群结构及其
14、演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义。关键词三疣梭子蟹；海水养殖塘；微生物群落；弧菌1三疣梭子蟹简介11养殖情况三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS），俗称梭子蟹、白蟹，属于甲壳纲、十足目、9梭之间，最适子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。梭子蟹一般在35米深海底生活及繁殖，冬天移居到1030米的深海，喜在泥沙底部穴居。其适应盐度为1635，水温在434，PH值在79盐度为2632之间，最适温度在2228。水质要求清新、高溶氧，当环境不适应或脱壳不遂时有自切步足现象，步足切断后能再生1。12营养价值三疣梭子蟹产量高，体大肉多，味鲜美，营养丰富，尤其是
15、卵巢和肝脏。卵巢可供作上等调味品。肉除鲜食外,还可制作罐头,畅销国内外。壳可作药材用，又可提取甲壳质，广泛用于多种工业。13养殖存在的问题病害的发生是梭子蟹、病源菌和环境相互作用的结果，其中环境中的理化因子变化可改变养殖水体及底泥中微生物的群落结构，当管理不当，水质恶化，再遇上天气的急剧变化（急剧降温、暴风雨侵袭、连续阴雨天等）时，有益有害微生物之间的平衡被打破，条件致病菌大量繁殖，导致梭子蟹疾病的发生，因此研究养殖水体中微生物的多样性特别是异养细菌的群落结构及其演替规律对于探明梭子蟹发病原因及制定病害防治措施具有重要意义25。14养殖塘水质调节养殖管理正常的养殖管理同养虾基本相似，但还要根据
16、蟹的不同习性，采取相应的不同管理措施。添换水前期添水，至水位升高后换水，根据水质情况调节换水量，高温季节高潮时尽量换水，日换水量。进入月交尾期后，要保持最高水位，并增加换8水6。养殖塘菌种菌落对养殖塘水质则起到了自然调节的作用，对于减少三疣梭子蟹养殖过程中疾病发病率等方面起主要作用7122分子生物学方法在微生物生态上的应用受技术的限制，目前自然界中的绝大部分微生物人们还无法对其进行纯培养（见表11）。1982年，人们提出了“不可培养（活）微生物”（VIABLEBUTNONCULTURABLEMICROORGANISMS，VBNCMICROORGANISMS）的概念（徐怀恕等，1982），即指利
17、用迄今所采用的分离培养方法还未获得纯培养的微生物。由于不可培养微生物不论其类群，还是其新陈代谢途径、生理生化反应、产物等都存在着新颖性和多样性，因而比以往的可培养微生物具有更为丰富多样的可供人们开发利用的生物资源。表11几个环境样品中可培养细菌的比率TAB11PERCENTAGEOFCULTIVATEDBACTERIAINSOMEENVIRONMENTALSAMPLES环境样品可培养率（）海水（SEAWATER）001010淡水（FRESHWATER）025湖水（MESOTROPHICLAKE）0110无污染的河口水样（UNPOLLUTEDESTUARINEWATERS）0130活性污泥（AC
18、TIVATEDSLUDGE）115沉淀物（SEDIMENT）025土壤（SOIL）03注可培养的细菌是以菌落生成单位（CFU）来计算的（引自AMANNETAL，1995）目前应用最多的是以PCR技术为基础的研究方法，这些研究方法的最初步骤都是通过PCR反应扩增目标序列，可操作性强，并且可以根据不同的分类水平（菌株、种、属等）使用不同的引物。21变性梯度凝胶电泳（DENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESIS，DGGE）1993年MUYZER首次证实变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术在揭示自然界微生物区系的遗传多样性和种群差异方面具有独特的优越性。近年来，该方法已被广泛地
19、应用于各种环境微生态的研究中，主要是对微生物多样性进行定性或半定量的评估。DGGE的原理是大小相同但碱基序列不同的DNA片段在含有变性剂的凝胶中电泳时，由于其解链时需要不同的变性剂浓度，所以会在各自相应的变性剂浓度下变性，从而滞9留于凝胶的不同位置。通过DGGE图谱，可以判断环境微生物群落中优势类群或独特种群的遗传多样性。某些情况下，为了得到更详细的信息，可以通过DGGE指纹与特定的寡核苷酸探针杂交或对切下的DGGE条带序列分析来进一步鉴定菌落成员1314。2216SRDNA文库构建目前，构建16SRDNA克隆文库是微生物分子生态学中用来调查环境中原核微生物组成的常用方法之一。其过程是提取环境
20、样品中的DNA；PCR扩增16SRDNA序列并建立基因文库；扩增每个克隆中16SRDNA片段后进行测序；最后将所测得的序列与现有数据库中（GENEBANK或EMBL）的已知序列进行比对分析，从而总结分析出关于微生物群落多样性的信息。文库中的序列信息不但可以用来分析样品中物种的丰度与多样性，还可以作为其他分子研究方法的基础，例如，用于设计荧光原位杂交（FISH）的探针或变性梯度凝胶电泳（DGGE）所使用的引物。GIOVANNONI（1990）等人最早使用该法研究了藻海（SARGASSOSEA）中浮游细菌的多样性15。此后，很多学者都采用该方法对微生物多样性进行了类似研究（FUHRMANETAL，
21、1993）。克隆文库法虽然可以获得较多的微生物群落多样性的信息，但其对分析的克隆数目有要求，只有在克隆数目足够的情况下才可以较为完整的认识种群组成的情况。为了使结果更具有代表性，通常利用物种丰富度的覆盖率评估来估算不同样品所要选取的克隆数目。此外，排除核酸提取、PCR及克隆过程产生的偏差，该方法的问题还在于如何能准确的评估出群落的多样性。为此，许多专家（COLWELLETAL，2004；SINGLETONETAL，2001）提出使用参数或非参数的方法对种群的多样性进行评估16。在多样性丰富的生态系统中，针对该方法工作量较大、测序费用较高的问题，测序前通常要进行序列筛选以剔除重复序列而仅将代表序
22、列进行测序。序列筛选一般采用前面所述的DNA指纹技术（如DGGE、SSCP、RFLP等）。以PCR技术为基础的其他研究方法还有温度梯度凝胶电泳法（TEMPERATUREGRADIENTGELELECTROPHORESIS，TGGE）、核糖体基因间隔序列分析（RIBOSOMALINTERGENICSPACERANALYSIS，RISA）、随机扩增多态性DNA分析（RANDOMAMPLIFIEDPOLYMORPHIC，RAPD）等1719。3研究现状31国内外研究现状近年来，国内外已有很多养殖环境微生物群落结构研究方面的相关报道。从研究方法来看，已由传统的培养方法逐渐向各种分子手段转变，研究对象也
23、集中在几类致病菌或某些功能微生物上。李秋芬等（2002）报道了虾池生态系统中几类细菌10的季节性变化，他们发现在养殖中后期弧菌和硝酸盐还原菌数量增长很快且数量较高23；高尚德等（1994）、郭平等（1994）的研究均发现养虾池中细菌的数量和变化规律同温度、PH值及虾病有密切关系2022；王晓颖等（2006）研究了虾池沉积环境中若干功能菌及弧菌的时空变化。近几年，以PCRDGGE为代表的DNA指纹图谱技术以及荧光原位杂交等分子手段常用于微生物群落的分析。MATTHEW等应用PCRDGGE技术以及构建16SRDNA克隆文库的方法研究了南美白对虾育苗池微生物群落的多样性，结果发现不同分析方法所得出的
24、结果之间存在着差异（MATTHEW等，2006）。从研究内容来看，微生物群落所处的环境也变得多种多样，包括网箱养殖区、养殖池塘、滩涂等，所处的微环境（生境）也各不相同，包括养殖水体、沉积物，乃至养殖动物体内。国内外许多学者对海洋细菌的生态分布、对虾养成期间水体和虾体中的异养细菌进行了大量的研究但对梭子蟹养殖环境及生物体内的细菌学研究至今很少报道。国外的主要有KMUROGA,KSSZUIK,KISHIMARU对三疣梭子蟹弧菌LARVICULTURE，国内主要是张恒庆等对于三疣梭子蟹水体细菌多样性的研究和张德民等对三疣梭子蟹养殖塘底泥进行DGGE分析细菌多样性2325。32本实验室研究基础本实验室
25、对宁海县明港东坝三疣梭子蟹养殖塘水体中的可培养细菌进行了为期3个月（7、8、9月份）的跟踪调查，每个月采一次样，共分离纯化198株异养细菌，根据其菌落形态特征分为15个类群；DGGE带型和16SRDNA基因序列分析表明，198株异养细菌分属于4个门，5个纲，16个科，26个属，56个种，81个发育型，主要属于变形杆菌纲GAMMAPROTEOBACTERIA，130株，631和芽孢杆菌纲BACILLI，47株，228。通过比较7、8、9月份的异养细菌群落组成发现水体中的异养细菌群落类群演替规律如下（1）81个发育型中没有一个种或发育型同时出现在3个月份；（2）同个种或发育型在2个月份中同时出现的
26、有7个科8个属，其余9个科18个属仅在一个月份中出现。综上所述，微生物群落结构的组成及变化与海水养殖的关系十分密切，在养殖池塘的物质循环、能量流动、元素转化、生态平衡及环境净化等方面起着十分重要的作用。了解养殖环境中细菌群落的组成、功能及其多样性，有助于了解养殖池塘生态系的特性，并对病害起到早期的预警作用。4展望尽管国内外许多学者对海洋细菌的生态分布、对虾养成期间水体和虾体中的异养细菌进11行了大量的研究但对梭子蟹养殖环境及生物体内的细菌学研究至今很少报道。因此对于三疣梭子蟹养殖塘水体中的免培养细菌多样性还需要系统研究，从而为三疣梭子蟹的生态养殖提供保障。参考文献1薛俊增，中国三疣梭子蟹POR
27、TUNUSTRITUBERCULATUSMIERS的研究J东海海洋，1977,15（4）2陈梅，李筠，徐怀恕梭子蟹及牡蛎中致病性弧菌的研究J广西预防医学，2002，841931963阎斌伦,梁利国,张晓君三疣梭子蟹主要病害研究进展J水产科技情报2010，3714王国花，钱彩源，李伟方微生物制剂在水产养殖中的应用J中国水产，2006，21783845林克文，三疣梭子蟹养殖及病害防治J科学养鱼，2002,324256王浦东，三疣梭子蟹养殖技术J海洋科学，1996,20157薛超波，王世意，童国忠梭子蟹养殖环境及生物体内细菌的数量动态及区系组成J中国水产，2005，241218208姜华，李爽，张德
28、民，等对虾池中紫色非硫细菌的分离及初步鉴定J辽宁师范大学学报自然科学版，2007，3022202229黄毅，陶平，陈仕明，等深圳大鹏湾南澳养殖区主要环境因子分布规律的研究口J辽宁师范大学学报自然科学版，2005，28110310610张恒庆,初航,温丹，张德民三疣梭子蟹养殖池塘水体中异养细菌菌群特征的研究J辽宁师范大学学报自然科学版,2008,30222022411石亚素，童国忠，薛超波，等舟山市三疣梭子蟹养殖环境及生物体内细菌学研究J中国卫生检验杂志，20057101312魏育红，薛仁宇，朱越雄蟹类的病毒性和细菌性疾病研究进展J内陆水产，2001，262424313付琳林，李海星，曹郁生，利
29、用变性梯度凝胶电泳分析微生物的多样性，生物技术通报J20042384014GMUYZER,TBRINKHOFF,UNBEL,DENATURINGGRADIENTGELELECTROPHORESISDGGEINMICROBIALECOLOGY1998KLUWERACADEMICPUBLISHERS15SJGIOVANNONI,TBBRITSCHGI,CLMOYERGENETICDIVERSITYINSARGASSOSEABACTERIOPLANKTON,1990NATURECOM16COLWELL,CODDINGTON,QUANTIFYINGBIODIVERSITYPROCEDURESANDPI
30、TFALLSINTHEMEASUREMENTANDCOMPARISONOFSPECIESRICHNESS2001WILEYONLINELIBRARY17马悦欣,变性梯度凝胶电泳DGGE中的应用J生态学报,2003,237156115691218郑雪松，杨虹一，李道棠等，基因间隔序列ITS在细菌分类鉴定和种群分析中的应用J应用与环境生物学报，2003，9667868419叶明亮，袁著忻，李晓娣等，细菌随机扩增多态性DNA分析中模板提取方法的优化J军事医学科学院刊，200125（2）10010620李秋芬，陈碧鹃，曲克明等，鱼虾混养生态系中细菌动态变化的研究J应用生态学报，2002,13（6）73
31、173422高尚德,中国对虾养成期间虾池水体和底质中细菌含量的变化J水产学报，1994，18（2）13814223郭平等，对虾养殖池水域环境细菌的动态变化J海洋与湖沼，1994，25（6）62563024HAMASAKIK，FUKUNAGAK，KITADASBATCHFECUNDITYOFTHEWIMMINGCRABPORTUNUSTNTUBERCULATUSBROCHUREPORTUNIDAEJAQUACULTURE，2006，2535936525钱丽君，张德民，徐小红,应用DGGE分析三疣梭子蟹养殖塘底泥细菌的多样性J水产学报2007，31（2）20421013本科毕业设计（20_届）三疣
32、梭子蟹养殖塘免培养细菌多样性分析目录141前言162材料与方法1621样品的采集16211样品总DNA的提取16213DNA提取1722PCR扩增16SRDNA全序列182316SRDNA克隆文库的构建及测序18231PCR产物的纯化、回收与连接18232ECOIL感受态细胞的制备18233连接产物的转化1824基于16SRDNA的系统发育学分析183结果与分析1931七月份克隆文库分析19311PCRDGGE分析19312系统发育学分析2332八月份克隆文库分析25321PCRDGGE分析25321系统发育学分析294讨论325结论34致谢错误未定义书签。参考文献3515摘要本文采用免培养微
33、生物学技术分析三疣梭子蟹养殖塘水体细菌多样性。通过构建16SRDNA克隆文库的方法，调查三疣梭子蟹养殖塘水体7、8月份微生物群落结构。构建2个16SRDNA克隆文库，总共得到131条有效序列。结果显示，比较于培养法，2个文库中细菌更加多样化，不但蓝细菌纲和变形杆菌纲变更成优势种群，获得了CYANOBACTERIA等培养法没有获得的类群，共分为5个门（变形菌门（PROTEOBACTERIA）、蓝藻门（CYANOBACTERIA）、放线菌门（ACTINOBACTERIA）、CFB类群（CYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDES）以及厚壁菌门（FIRMICUTES），所以免
34、培养法可以更加完整的反映养殖塘水体菌落组成。关键词三疣梭子蟹；养殖塘水体；16SRDNA；微生物群ABSTRACTINTHISPAPER,USECULTIVATIONINDEPENDENTOFBACTERIALDIVERSAITYINPORTUNUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDHEMETHODDEPENDINGONMOLECULARBIOLOGYTECHNIQUES16SRDNACLONELIBRARYCONSTRUCTION,WASALSOUSEDTOINVESTIGATEBACTERIALCOMMUNITYSTRUCTUREINTHESAMEWATEROFPORTU
35、NUSTRITUBERCULATUSREARINGPONDINJULYANDAUGUSTBYTHECONSTRUCTIONOFTWO16SRDNACLONELIBRARY,131EFFECTIVESEQUENCESHASBEENOBTAINEDTHERESULTSSHOWEDTHAT,RELATIVETOTHEMETHODOFMICROBIOLOGICALCULTURE,THEDIVERSITYOFBACTERIAINTWOCLONELIBRARYWASRICHER,NOTONLYASTHEDOMINANTGROUPSOFBACTERIATURNEDINTOCYANOBACTERIAANDPR
36、OTEOBACTERIABUTALSOOBTAINEDSOMEGROUPOFBACTERIASUCHASCYANOBACTERIAWHICHDIDNTOBTAINEDWITHTHEMETHODOFMICROBIOLOGICALCULTUREALLOFTHEBACTERIACOULDBEATTRIBUTEDTOFIVEPHYLUMSPROTEOBACTERIA,CYANOBACTERIA,ACTINOBACTERIA,CFBGROUPCYTOPHAGAFLAVOBACTERIUMBACTEROIDESANDFIRMICUTESTHEDOMINANTGROUPSOFBACTERIAWERECYAN
37、OBACTERIAANDPROTEOBACTERIASOITISOBVIOUSLYTHATBYUSINGTHEMETHODDEPENDINGONMOLECULARBIOLOGYTECHNIQUES,WITHOUTMICROBIOLOGICALCULTURECOULDREFLECTTHECOMMUNITYSTRUCTUREOFBACTERIAINWATEROFREARINGPONDSMORECOMPREHENSIVEKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSAQUACULTUREPOND16SRDNAMICROBIALCOMMUNITY1611前言近年来，三疣梭子蟹PORTU
38、NUSTRITUBERCULATUSMIERS病害频发，患病率和死亡率均较高，严重制约了梭子蟹养殖业的持续健康发展。水产养殖塘作为一种人工的生态系统，微生物中的细菌对这种系统的稳定起着关键作用，对养殖水体中的海产动物的生长、健康有着非常重要的作用。在这种有益菌和有害菌共同存在的生态系统中，构成群落的细菌相对比较稳定的状态，给养殖在水体中的动物提供了一个相对稳定的环境，如果构成稳定系统的某几种微生物发生变化，从而会导致细菌多样性失衡，结果引发一系列严重后果，进而使水质严重恶化并伴随一系列病害的爆发，最终对水产动物的生长和健康构成严重影响而导致经济损失1。三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBE
39、RCULATUS），俗称梭子蟹、白蟹，属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。伴随梭子蟹养殖业的高速发展，养殖规模进一步扩大，以及不断提高的养殖密度，梭子蟹养殖中的病害危机日趋严峻，严重制约梭子蟹养殖产业的健康发展。只有坚决控制疾病的发生，才能使梭子蟹产业化养殖健康、持续发展。所以，对于养殖水体的菌落构成及变化的分析研究变得非常必要。大量的研究显示，在现有条件和技术情况下，当前我们只能完全培养自然界中很小一部分微生物，绝大部分都无法培养。我国的学者在1982年首先提出了“不可培养微生物”的理念25。因为免培养微生物在
40、种群类别以及新陈代谢途径、理化反应、生长过程产物等各方面都表现出多样性，相当于传统的可培养方法会有更加丰富的生物资源供学者研究和利用68。本研究以三疣梭子蟹养殖塘为研究对象，运用克隆文库和PCRDGGE的方法确定梭子蟹养殖塘水体中细菌的多样性911，并初步研究并确定三疣梭子蟹养殖塘水体中细菌的多样性，并分析其在不同养殖阶段的群落差异。22材料与方法2121样品的采集分别在2010年7月13日、8月5日，宁海县港东坝的三疣梭子蟹养殖塘做跟踪调查。在此期间，分不同批次进行水样采集，以2030天为间隔。采样时间选在上午11001200，水样的采集方法遵照海洋调查规范第6部分海洋生物调查GB/T127
41、6362007）的要求进行，应用深水采样器采集水样，采样前，开动水车30分钟，以使水体充分混匀，从深度约05M处取水，采样量为5L，采样3次。采集的样品置于黑暗、4的环境保存,采集4H内进行后续实验。211211样品总DNA的提取溶菌酶缓冲液40MMEDTA，PH8050MMTRISCL，PH801710M/V）蔗糖用022M的过滤器过滤除菌，4保存。TE缓冲液100MMTRISCL，PH8010MMEDTA，PH8010贮存液，PH80分装后121灭菌20MIN，室温保存。STE缓冲液10MMEDTA，PH8025MMTRISCL，PH8050MM葡萄糖121灭菌20MIN，4保存。1工作液
42、，PH801MMEDTA，PH8010MMTRISCL，PH802111212菌体收集采用MILLIPORE过滤浓缩系统收集采集水样中的菌体，使用1M的微孔滤膜预过滤，除去一些较大的真核单细胞浮游生物和水中漂浮的杂质。过滤水样的体积为2L，收集滤液，将滤液经过022M的微孔滤膜再次过滤，菌体被截留在滤膜上。在无菌操作条件下，剪碎滤膜后，将其置于50ML无菌聚乙烯离心管中待用。212213DNA提取SDS煮沸法向M1管中加入5MLSTE缓冲液，在漩涡混合器上进行充分振荡；加1/10体积的20的SDS溶液约500L），混匀后，用沸水浴25MIN，将裂解液转移至新的无菌离心管中，20，10MIN；室
43、温离心，10000RPM，10MIN，弃去上清液；用600L的1TE缓冲液溶解沉淀，然后将溶液转移至15MLEPPENDORF管中；加等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液25241，V/V），用手轻轻混匀。离心，10000RPM，4MIN；收集上清液，然后再加入等体积的氯仿/异戊醇溶液241，V/V）混匀，离心，10000RPM，4MIN；收集上清液，然后加入1/10体积的3M的醋酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀，室温沉淀10MIN，离心，10000RPM，10MIN；用70乙醇洗涤，然后再次离心，弃去上清液，自然风干，加1TE溶液或无菌双蒸水溶解DNA，置于20保存；182222PCR扩增16SRDN
44、A全序列选用细菌通用性引物对27F/1541R，扩增细菌16SRDNA的全序列，其中引物序列、PCR反应体系和PCR反应程序。反应结束后，PCR产物用08W/V的琼脂糖凝胶电泳进行检验1215。232316SRDNA克隆文库的构建及测序231231PCR产物的纯化、回收与连接完成琼脂糖凝胶电泳后，将PCR产物对应的条带切下，用UNIQ10柱式通用DNA纯化试剂盒上海生工）进行纯化回收DNA，将产物连接到PMD18TVECTORTAKARA）上。10L反应体系的组成16SRDNA45LLIGATIONMIX内含连接酶）5LT载体50NG/L）05L将上述各成分混匀后，进行低速离心，使管壁无残留液
45、滴，然后在4条件下连接1624H。232232ECOIL感受态细胞的制备采用传统的CACL2法制备大肠杆菌感受态细胞，具体步骤将ECOILDH5接种在LB平板上，37，12H，然后挑取大肠杆菌单菌落接种在100ML无菌的LB液体培养基中，37，200R/MIN，振荡培养68H，至OD60005左右为止；取两个50ML无菌离心管置冰上预冷，将上述培养液转入离心管中，每管50ML，冰上放置10MIN，4，离心，4000RPM，10MIN；弃上清夜，取用冰预冷过的01MOL/LCACL2溶液10ML，轻轻悬浮细胞，然后放置冰上2MIN，4离心，4000RPM，10MIN；重复步骤一次，弃上清夜，取1
46、3ML用冰预冷过的01MOL/L的甘油CACL2溶液轻轻悬浮细胞，放置冰上3MIN，即成为感受态细胞；将感受态细胞悬液进行分装，并贮存于70冰箱中；233233连接产物的转化向上述10L连接产物中加入100L感受态细胞，轻轻混合后，置冰上20MIN，然后用42的水浴热激15MIN，之后进行冰浴25MIN，再加入800L的液体LB培养基，37振荡培养45MIN；然后取200L菌液，涂布在含有AMP的LB平板上，37连续培养12H。之后挑取白色转化子构建菌株16SRDNA全序列克隆文库，并送上海生工测序1618。2424基于16SRDNA的系统发育学分析19运用CHECKCHIMERA程序在RDP
47、数据库中对得到的序列进行嵌合体检验，排除质量较差的序列。用FASTGROUPIIHTTP/BIOMESDSUEDU/FASTGROUP/FG_TOOLSHTM）程序对每个克隆文库的序列进行分组，并将相似性大于98的菌株作为一个OUT，即可操作分类单元，其中每个OUT中选择一株菌作为代表菌株，并用BLAST程序HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/）进行同源性搜索，然后选取与其同源性较高的菌株的16SRDNA序列作为参比对象。将得到的序列进行进一步的系统发育分析，利用MEGA4软件进行多重序列比对，并采用邻接法构建系统发育树，根据公式1计算每个克隆文库的覆盖率COVERAGE，
48、C）GOOD，1953）；使用FASTGROUPII程序分析文库的多样性指数SHANNONWEINER、物种的丰富度指数及SIMPSON指数D。覆盖率C）的计算公式C1NL/N公式1）其中N代表16SRDNA文库总克隆数，NL代表在文库中仅出现一次的OTU的数量。SHANNONWIENER指数H1LNSIIIHPP公式2）EVENNESS指数JSHJLN公式3）SIMPSON指数D211ISIDP公式4）定义不同种的序列作为不同分类单元，以上各式中S为样品中的OUT数目，PI为属于OTU第I个种在全部种中的比例（PINI/N），为第I种的个体数，N为个体总数。J取值范围在01之间，反映了种间个
49、体分布的均匀度；D值是种类的优势度。33结果与分析3131七月份克隆文库分析311311PCRDGGE分析从三疣梭子蟹养殖塘水体样品中共选取125个克隆编号为A1A125），有2个克隆在分离过程中死亡（A15和A79）。我们将123个克隆分为47种不同带型表31，图31）。这些不同带型中又以A7为代表带型数量最（20个，占到总数的163），其余的以A7和A84的数量较多（分别为10个和5个，占总数的122和81）。20表317月份克隆文库的DGGE带型统计TAB31DGGETYPESTATISTICALRESULTSOFCLONELIBRARIESBACTERIAOFWATERSAMPLESREARINGPONDINJULY21相同克隆数量A50A3，6，24330A36A52160A43A172160A28A31，34，38，40，496490A1无1080A4无1080A23无1080A25无1080A42无1080A52
