1、本科毕业论文系列开题报告海洋生物资源与环境一株海水光合细菌的分离鉴定及在轮虫增养殖的应用一、选题的背景与意义光合细菌PHOTOSYNTHETICBACTERIA简称PSB，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物。光合细菌属于水圈微生物的一种，光合细菌广泛分布于地球生物圈的各处，无论是海洋、湖泊、江河，还是水田、池塘、沼泽、污泥、氧化池、硫磺泉、土壤、极地，甚至在90的温泉中、在300的盐湖里、在深达2000M的深海、在南极冰封的海岸上，都能找到其踪迹。光合细菌具有多种生理功能，代谢类型极为多样，有光能自养、异养和混养多种营养生长方式，具有光合、固碳、降解大分子有机物、固氮、脱氮、硝化
2、、反硝化、硫化物氧化等代谢方式，光合细菌进行光合作用一般是在厌氧光照条件下，以简单的有机物为供氢体，固定CO2进行光合磷酸化和光氧化还原反应。而在好氧黑暗条件下，光合色素的合成受到抑制，胞内缺少内质膜系统，则和好氧型微生物一样，通过氧化磷酸化获取能量，另外还可通过脱氮或发酵获得能量，光合细菌对简单碳化物代谢具有很大的多样性，它也许是自然界发现的营养代谢类型最丰富的微生物之一。因固氮酶的存在而具有固氮能力，光合细菌对氮源的利用较广，一般均可利用铵盐、氨基氮，少数种类还能利用硝酸盐和尿素。这种随着生长条件的变化而灵活地改变代谢类型的特性与其他光合生物一起构成了自然界生态系统的原始生产者，在自然界物
3、质转化和能量循环中起着重要的作用。在鱼类、甲壳类的人工育苗生产中,需供给动物性活饵料。我国自20世纪50年代后期开始，先后开展了轮虫、卤虫、双壳类的卵和幼体、糠虾等动物性饵料的培养和生产。其中轮虫作为鱼、虾、蟹等幼体的开口饵料，其适口性、可得性、营养价值及饲养效果均优于其他饵料，而且轮虫适应性强、生长快、繁殖迅速、培养成本低，极易在生产实践中推广应用。尽管人工微粒饵料的使用越来越多，但作为生物饵料，轮虫在控制水质、提高幼体成活率等方面具有明显的优势。影响轮虫高密度增殖的主要因素为饵料、氧、氨氮的积累和残饵、粪便等代谢产物。在轮虫培养中，随着种群密度的增大，轮虫分泌和水中有机质分解产生的氨将积累
4、到相当浓度，并产生明显的毒性，这些悬浮物有机质还会堵塞回收轮虫用的浮游生物网，不仅阻碍轮虫的回收和清洗，而且伴随着这些轮虫的投喂，还成为了仔、稚鱼疾病的病因。这些有机质更成为细菌的营养源而繁殖出大量的以弧菌、不动杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、霍乱菌、巴氏杆菌、水中产气单胞菌等为优势菌的菌群，严重影响了轮虫的培养，更使轮虫的品质下降。鉴于光合细菌的这些特性以及轮虫增养殖中存在的问题，通过选择合适的光合细菌和确定合适的菌液添加剂量，形成优势菌群，以消耗残饵、粪便等代谢产物，减少氨氮的产生并消耗产生的氨氮。并且在消耗这些阻碍轮虫培养的物质的同时，产生的菌体可以作为轮虫的优质饵料，以使轮虫培养过程中密度、生
5、产力和生产效率都有明显的提高。这一研究结合了当前水产养殖育苗业的发展现状，有助于解决一些实际问题，产生巨大的经济效益，对水产养殖业的发展有积极影响。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1光合细菌的分离纯化；2光合细菌基本特性研究；3光合细菌生理特性的研究；4光合细菌16SRDNA测序及其系统发育分析；5褶皱臂尾轮虫的实验室训化；6光合细菌对轮虫增养殖的影响研究；7光合细菌应用于轮虫培养的最佳配比探索；8光合细菌应用于轮虫增养殖的前景探讨。拟解决的主要问题通过本课题完成海水光合细菌的分离鉴定，得到其应用于轮虫增养殖的实际数据，为其在水产养殖育苗方面的应用理论依据。三、研究的方法与技术路线
6、一研究方法1光合细菌的富集样品的采集按照海洋调查规范国家海洋局,1975的要求进行。应用深水采样器采集养殖池海水。应用采泥器采集表层泥样，分别取水样1ML、泥样1G于螺口厌氧管中，加灭过菌的液体培养基至满，拧上螺口帽，混匀。带回实验室，放入32光照强度为30005000LUX的培养箱培养。光下培养约515天，待有红色、粉色、黄色或褐色生长物明显生长后，再连续转接多次以求培养液中光合细菌占优势，待进一步分离。泥样取自浙江宁波的象山、北仑、宁海等地的海水养殖塘，培养基为AT基础培养基。2光合细菌的纯化和鉴定21光合细菌纯化本次实验采用多种方法纯化菌种至DGGE检验出现单一稳定的条带，挑取单菌落接种
7、到扩繁培养基中扩大培养，视纯化效果多次分离纯化3代或更多代，镜检无异常方初步认为纯种。22DNA模板的制备传统法提DNA（LILETAL,1999）或者用基因组DNA快速提取法将收集的菌体细胞用无菌PCR用水悬浮，在沸水浴中煮1015MIN，随后离心，取上清液直接作为PCR扩增的DNA模板。23细菌16SRRNA基因V3区的PCR扩增采用对大多数细菌的16SRRNA基因V3区具有特异性的引物对（1）引物341FGC5CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTACGGGAGGCAGCAG3518R5ATTACCGCGGCTGCTGG3扩增产物长约230B
8、P用于DGGE分析。（2）PCR反应体系模板25NG；引物4MOL/L；DNTP200MOL/L；10BUFFER25L；MGC1215MMOL/L；DNA聚合酶075U；补双蒸水到25L。（3）PCR反应条件采用降落PCR，94预变性5MIN；前10个循环为9430S，656030S，7230S（其中每个循环后复性温度下降05）；后18个循环为9430S，6030S，7230S；最后72延伸5MIN。24琼脂糖凝胶电泳取5LPCR产物进行15的琼脂糖凝胶电泳，20MIN后观察结果，然后利用FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系统进行拍照。25变性梯度凝胶电泳与银染参照MUYZER（1993）
9、等人方法，PCR产物加入到10（WT/VOL）聚丙烯酰胺凝胶中，凝胶的变性范围为4065。利用BIORAD公司的DCODESYSTEM电泳仪，在55、180V条件下，采用1TAEBUFFER电泳300MIN，然后常规银染显色。2616SRDNA克隆文库的构建（1）将活化好的CP3菌液离心收集菌体。（2）用溶菌酶SDS裂解菌体细胞，再用酚氯仿提取DNA。（3）用细菌16SRDNA通用性引物27F和1541R对所提取得DNA进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后再进行切胶回收，用UNIQ10柱式通用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。（4）将回收后的扩增产物与PMD18载体相连接，然后转化入大肠杆菌中，
10、扩繁，在含有氨苄青霉素和XGAL的LB琼脂培养基上选择具有氨苄青霉素抗性的白色转化子。（5）随机挑取60个阳性克隆提取质粒，质粒提取参照文献SAITOUNETAL,1997。用341FGC与518R扩增，再用DGGE对扩增产物进行筛选，确定DGGE胶上不同带型的数量和代表性克隆。（6）将选取出来的代表性克隆送上海生工测序。3光合细菌培养条件的优化从碳源利用、氮源、无机电子供体利用、维生素需求、耐盐性、最佳酸碱度范围、生长速度等方面描述试验菌株。每个水平均做三个重复，在SPDJ系列水平净化工作台上接种，之后在RXZ300B人工气候箱内，282培养；OD值测定时以蒸馏水为空白对照，所测菌液以蒸馏水
11、稀释四倍，培养基同样以蒸馏水为空白对照测得OD值，最终实际OD值菌液OD值培养基的OD值。4饵料的准备小球藻取自宁波大学藻种室，用灭菌海水加小球藻3号营养液进行实验室培养；面包酵母取于高泥育苗场，用300目纱布过滤到烧杯（盛海水）中，取过滤得到的溶解液投喂轮虫。5褶皱臂尾轮虫的获得以及训化实验中用到的褶皱臂尾轮虫可采于宁波象山高泥育苗场，在实验室条件下用面包酵母和海水小球藻投喂，查阅相关书籍和文献，探索轮虫生长最佳条件，达到驯化的目的。6光合细菌应用于轮虫增养殖的研究取生长旺盛期的光合细菌培养液，8000R/MIN条件下常温离心3分钟，弃去上清液，保留菌体。把菌体加入轮虫培养液，观察轮虫生长情
12、况并技术。试验中添加不同剂量的光合细菌作为对照，相同剂量处理时设置平行，其他条件都相同。根据实验数据求得光合细菌最佳配比。二技术路线四、研究的总体安排与进度201011毕业论文选题。20101112制定研究计划和实验方案201012开题答辩与综述。20101220111实验相关仪器的采购，实验计划的进一步修改和完善。褶皱臂尾轮虫海水的过滤、消毒饵料（小球藻、酵母菌）的准备500ML锥形瓶中海水培养小球藻光合细菌选取及纯化培养轮虫定量接种于培养有定浓度小球藻的海水加入不同剂量的光合菌，设置对照观察培养，轮虫计数，增殖率，成活率数据整理，得到结论光合细菌培养条件的优化件的优化采集环境水样实验室训化
13、菌剂的推广应用环境中光合细菌的富集、分离及鉴定2011120114实验的具体操作以及两篇外文文献的翻译。201134数据和材料整理、分析。201145论文撰写、提交并答辩。五、主要参考文献1成永旭,蒋霞敏,张德民,等生物饵料培养学M中国农业出版社,20052孙东红,邹宁,赵红庆,李晓娜褶皱臂尾轮虫的培养研究中国水产,2005,471743张德民紫色非硫细菌多相分类及分子生态学研究M博士论文,19984MADIGANMT,ANDJGORMERODTAXONOMY,PHYSIOLOGYANDECOLOGYOFHELIOBACTERIA,INBLANKENSHIPROBERTE,MTMADIGANA
14、NDCEBAUER,ED,ANOXYGENICPHOTOSYNTHETICBACTERIAJ,KLUERACADEMICPUBLISHERS1995,217295魏玉利光合细菌的培养及应用J生命科学仪器,2007,327306王桂文,周兴,李海鹰光合细菌的应用现状与前景J广西科学院学报,1995,11116207崔战利光合细菌的基本特性及应用价值J黑龙江八一农垦大学学报,1999,11120258沈萍微生物学M北京高等教育出版社,20009HUGENHOLTZPHILIP,PITULLECHRISTIANETALNOVELDICISIONLEVELBACTERIALDIVERSITYINAYE
15、LLOWSTONEHOTSPRINGJBACTERIOL,1998,180236637610许兵,丁明宇,毛景华,徐怀恕光合细菌对褶皱臂尾轮虫的饵料价值海洋湖泽通报,199211王鉴,祝国芹不同浓度的光合细菌对轮虫繁殖的影响水产科学,200412WANGYOUZHI,WANGFENGJUN,BAOLITREATMENTOFCHINESETRADITIONALMEDICINEWASTEWATERBYPHOTOSYNTHETICBACTERIAJOURNALOFNORTHEASTAGRICULTURALUNIVERSITY2005,121374113刘勇,张德咏光合细菌PSB1菌株的分离鉴定及其生
16、物学特性的研究J生命科学研究,2000,4423363314施安辉,李桂杰,徐海燕,等光合细菌菌种的分离、富集培养、纯化和菌种鉴定及净化水质的研究J内陆水产,2002,10404115宋志文,席俊秀,张锡一株光合细菌的分离筛选及对污水的净化效果J青岛建筑工程学院学报,2004,254636616刘建红,张肇铭光合细菌处理垃圾渗滤液静态试验研究J太原师范学院学报,2003,23666817穆军,章非娟,黄翔峰等厌氧酸化好氧光合细菌法处理含硫酸盐高浓度有机废水J中国环境科学,2005,25330230518王玉芬,张肇铭等光合细菌球形红细菌厌氧降解氯代苯J中国环境科学,2007,271111115
17、19李乐,李兰生等固定化光合细菌降解氧化乐果J农业环境科学学报,2006,25增刊72172420史国富,张肖洪光合细菌与中药制药结合康强胶囊的应用研究J山西中医学院学报,2003,43151621王锦,刘清俊,张肖渺康强硒在恶性肿瘤治疗中的作用J山西医药杂志,1998,271767722罗源华，刘勇,张德咏等一株降解甲氰菊酯的光合细菌的分离鉴定及其降解酶初步分析J天津农业科学，200923吴向华,杨启银,刘五星,等一株沼泽红假单胞菌的分离与鉴定J环境与健康杂志,2004,21210110324黄志勇,王海胜,蒋培霞,等几株光合细菌的分离鉴定及在养殖罗非鱼中的应用J微生物学通报,2005,32
18、4727825陈繁忠，朱好根利用光合细菌处理养猪场污水的试验研究J环境工程,2000,1851012毕业论文文献综述海洋生物资源与环境光合细菌的研究概述摘要光合细菌是水环境中主要的微生物类群之一，是所在的环境物质循环和能量流动的主要参加者，在水产养殖业、环境治理、医疗保健、新能源开发利用等应用领域具有十分广阔的前景。本文主要介绍了光合细菌的分类、基本特性，以及光合细菌在生态上的作用及应用、其研究进展等方面内容。关键词光合细菌；基本特性；代谢类型；生态应用光合细菌PHOTOSYNTHETICBACTERIA简称PSB，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物1。光合细菌属于水圈微生物的一
19、种，光合细菌广泛分布于地球生物圈的各处，无论是海洋、湖泊、江河，还是水田、池塘、沼泽、污泥、氧化池、硫磺泉、土壤、极地，甚至在90的温泉中、在300的盐湖里、在深达2000M的深海、在南极冰封的海岸上，都能找到其踪迹。在自然界的淡水、海水中，通常每毫升含有103104个光合细菌2。PSB均为革兰氏阴性细菌，一般为球型、卵形、杆形、弧形、螺旋形、环形、半环形丝形，也可随培养条件和生长阶段而改变，大部分单个存在3。光合细菌具有固氮、固碳、脱氢、硫化物氧化等不同的生理生化功能，是所在的环境物质循环和能量流动的主要参加者，对于研究光合作用机制、光合作用起源与进化、固氮机理具有重要的理论意义45。光合细
20、菌在水产养殖、污水处理、饲料添加、保健品开发、药用、产氢、及农业增产等方面都得到广泛的应用。1光合细菌的分类光合细菌根据它们所含光合色素和电子供体的不同分为不产氧光合细菌（ANOXYPHOTOSYNTHETICBACTERIA）和产氧光合细菌（OXYPHOTOSYNTHETICBACTERIA），是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物6。产氧光合细菌即蓝细菌，能够像植物一样，利用光合作用产生氧气；不产氧光合细菌，即狭义光合细菌，包括厌氧光合细菌（ANAEROBICPHOTOSYNTHETICBACTERIA，APB）和最近提出的好氧不产氧光合细菌（AEROBICANOXYGENICP
21、HOTOSYNTHETICBACTERIA，AAPB）。根据伯杰氏细菌鉴定手册第九版，不产氧光合细菌被分成七大类群2,7着色菌科（CHROMATIACEAE）、外硫红螺菌科（ECTOTHIORHODOSPIRACEAE）、紫色非硫细菌（PURPLENONSULFURBACTERIA，简称PNSB）、绿硫细菌（CHLOROBIACEAE）、多细胞丝状绿细菌（MULTICELLULARFILAMENTOUS，又称绿色非硫细菌）、螺旋杆菌（HALIOBACTERIACEAE）、好氧不产氧光合细菌（AEROBICANOXYGENICPHOTOTROPHS）。2光合细菌的特性及生态作用21光合细菌分布广
22、泛，适应能力强光合细菌不同的种之间生理代谢丰富多样，而且同一种的生理代谢类型也有多种变化，以适应各种不同的自然环境，光合细菌有着光能自养、异养和混养多种营养生存方式。在光能辐射到的地方，利用氢气、硫化氢等同化CO2进行光能自养生长，又能利用小分子有机物如低级脂肪酸、醇类、糖类或氨基酸等作电子供体同化CO2进行光能异养生长，在两类电子供体同时存在时，则可进行光能混养生长，因此光合细菌环境适应性强，能够在一些不利于其他微生物生长的环境中发挥作用，广泛分布于海洋、湖泊、极地或温泉，以及高盐、高有机质含量等不同的等自然水环境中。22光合细菌代谢途径灵活多样光合细菌可利用多种碳源，通过光合作用，将无机态
23、的碳转化为有机态的碳，合成菌体自身物质，同时又能利用小分子有机物如低级脂肪酸、醇类、糖类或氨基酸等作电子供体进行光能异养生长。光合细菌的氮代谢也较复杂，几乎所有的PSB均能利用铵盐和氮气做氮源。在水田中当PSB与固氮菌共生时产生的固氮量，比任何一种菌单独的固氮量要多得多。所以光合细菌与固氮菌共生，可直接或间接地增加动植物可利用氮的量。一些PSB能利用还原型含硫化合物，如硫化物，硫代硫酸盐，将其氧化成硫酸盐。在硫的生物循环中起着重要的作用。光合细菌与发酵菌生长在一起可利用发酵菌产生的氢气。氮源不足时，在固氮酶的催化作用下释放氢气。在生物能源的生产中，该类群菌是重要的菌群。3光合细菌的生态应用31
24、光合细菌在水产养殖中的应用光合细菌菌体含蛋白质60以上，并富含B族维生素、氨基酸和促生长因子，是优质安全的营养型饲料添加剂，光合细菌能释放胰蛋白等，激活虾体免疫系统，增强抗病力，促进新陈代谢，从而提高饲料效能。此外，光合细菌可使养殖水体中益生藻类群体大量繁殖生长，使菌相和藻相平衡，产生优势藻种群，抑制病原微生物的生长，保持池水肥、活、嫩、爽；同时具有增加水体中溶氧量，调节水体PH值等作用810。王桂文等测定了池塘水中溶氧、PH、氨氮、亚硝酸盐氮和COD的变化情况，池水中的PH、溶氧不受光合细菌的影响；对水中氨氮、亚硝态氮有降低作用，降级率分别为45一52、33一43，对有机物COD也有降低作用
25、，但不明显。由于水体中氨氮、亚硝酸盐氮等含量超过一定量时对养殖动物产生毒害作用，并使易受病原微生物的感染，而光合细菌对改善水质起到一定作用，维持水体生态平衡，使鱼类能在优良的环境中生长，提高了成活率，无论是成活率还是产量和质量上都有显著提高4。PSB菌体无毒，营养非常丰富，是一类营养成分高且种类比较全的微生物，作为水产养殖生物的饲料添加剂，具有明显的增产效果5。轮虫在以一定浓度的小球藻为饵培养时，在恒温25的条件下，光合细菌添加浓度为250PPM时轮虫的日平均增殖率最高11。32光合细菌在处理有机废水方面的应用由于光合细菌能利用光能和有机废物合成自身菌体蛋白和其他无害物质变有害物质为无害物质，
26、所以光合细菌是当今世界上最具发展前景的净化环境的生物制剂。现在，PSB已广泛用于大型垃圾场，生活垃圾的现场处理及人粪尿、畜禽粪尿的集中处理和综合利用1216。穆军等采用抑制硫酸盐还原地厌氧酸化工艺与两级好氧光合细菌工艺组合技术处理含硫酸盐高浓度有机废水，最终CODCR去除率达990，总氮去除率675，并且硫酸盐还原被完全抑制17；王玉芬等采用光合细菌球形红细菌（RHODOBACTERSPHAEROIDES）在厌氧光照条件下对氯代苯进行生物降解结果表明氯代苯只能以共代谢的方式被降解，当以苹果酸为碳源的时候，氯代苯的去除率可达903718；李乐，李兰生等考察固定化光合细菌对氧化乐果农药的降解，结果
27、表明，光合细菌可以在浓度小于10G/L的氧化乐果中正常生长，24H降解率达6302，最终可达到907919。33光合细菌在其他方面的应用医药保健方面，日本成功研制了具有延缓衰老的作用的PSB饮料，而且这种饮料还能有效防止心脏病、脑梗死、癌症等疾病的发生。国内，也已经研制出了多种富硒PSB制剂，并申请了国家专利，通过试验表明，富硒PSB制剂具有延缓衰老、抑制肿瘤、免疫调节等多种功效20，21。光合细菌还在种植业、畜牧业、新能源开发利用等应用领域具有十分广阔的前景。4光合细菌的研究进展目前应用领域研究较多的是红假单胞菌（RHODOPSEUDOMONASPALUSTRIS），罗源华等从某农药厂污泥中
28、筛选分离出一株高效降解甲氰菊酯（FENPROPATHRIN）的光合细菌，经鉴定为红假单胞菌属RHODOPSEUDOMONASSP22。吴向华等分离与鉴定了一株具有较高降解黄泔水能力的光合细菌，结论初步确定筛选出的菌种为沼泽红假单胞菌RHODOPSEUDOMONASPALUSTERIS23。黄志勇等从渔场底泥样品中分离纯化得到5株紫色非硫光合细菌，经鉴定5个分离株分别属于沼泽红假单胞菌RHODOPSEUDOMONASPALUSTERIS和类球红细菌RHODOBACTERSPHEROIDES，利用它们的纯培养物及混合培养物进行的水产养殖试验表明,光合细菌可以明显提高养殖鱼的成活率以及生长速度242
29、5。两株紫色非硫细菌沼泽红假单胞菌RHODOPSEUDOMONASPALUSTERIS和类球红细菌RHODOBACTERSPHEROIDES的全基因序列图谱已经全部完成从根本上加强人们对光合细菌独特的生理生化特性,多种多样的代谢类型以及基因调控机理的深入了解和认识（黄志勇等，2005）。沼泽红假单胞菌含有较高浓度的类胡萝卜素和营养物质，可以作为提取类胡萝卜素的原料、鱼类等饲养业的原料，而且还能用来处理废水，有很高的利用价值。参考文献26张德民紫色非硫细菌多相分类及分子生态学研究M博士论文,199827MADIGANMT,ANDJGORMERODTAXONOMY,PHYSIOLOGYANDECO
30、LOGYOFHELIOBACTERIA,INBLANKENSHIPROBERTE,MTMADIGANANDCEBAUER,ED,ANOXYGENICPHOTOSYNTHETICBACTERIAJ,KLUERACADEMICPUBLISHERS1995,2172928魏玉利光合细菌的培养及应用J生命科学仪器,2007,3273029王桂文,周兴,李海鹰光合细菌的应用现状与前景J广西科学院学报,1995,111162030崔战利光合细菌的基本特性及应用价值J黑龙江八一农垦大学学报,1999,111202531沈萍微生物学M北京高等教育出版社,200032HUGENHOLTZPHILIP,PITUL
31、LECHRISTIANETALNOVELDICISIONLEVELBACTERIALDIVERSITYINAYELLOWSTONEHOTSPRINGJBACTERIOL,1998,180236637633成永旭,蒋霞敏,张德民,等生物饵料培养学M中国农业出版社,200534孙东红,邹宁,赵红庆,李晓娜褶皱臂尾轮虫的培养研究中国水产,2005,4717435许兵,丁明宇,毛景华,徐怀恕光合细菌对褶皱臂尾轮虫的饵料价值海洋湖泽通报,199236王鉴,祝国芹不同浓度的光合细菌对轮虫繁殖的影响水产科学,200437WANGYOUZHI,WANGFENGJUN,BAOLITREATMENTOFCHINE
32、SETRADITIONALMEDICINEWASTEWATERBYPHOTOSYNTHETICBACTERIAJOURNALOFNORTHEASTAGRICULTURALUNIVERSITY2005,121374138刘勇,张德咏光合细菌PSB1菌株的分离鉴定及其生物学特性的研究J生命科学研究,2000,4423363339施安辉,李桂杰,徐海燕,等光合细菌菌种的分离、富集培养、纯化和菌种鉴定及净化水质的研究J内陆水产,2002,10404140宋志文,席俊秀,张锡一株光合细菌的分离筛选及对污水的净化效果J青岛建筑工程学院学报,2004,254636641刘建红,张肇铭光合细菌处理垃圾渗滤液静
33、态试验研究J太原师范学院学报,2003,23666842穆军,章非娟,黄翔峰等厌氧酸化好氧光合细菌法处理含硫酸盐高浓度有机废水J中国环境科学,2005,25330230543王玉芬,张肇铭等光合细菌球形红细菌厌氧降解氯代苯J中国环境科学,2007,27111111544李乐,李兰生等固定化光合细菌降解氧化乐果J农业环境科学学报,2006,25增刊72172445史国富,张肖洪光合细菌与中药制药结合康强胶囊的应用研究J山西中医学院学报,2003,43151646王锦,刘清俊,张肖渺康强硒在恶性肿瘤治疗中的作用J山西医药杂志,1998,271767747罗源华,刘勇,张德咏等一株降解甲氰菊酯的光合
34、细菌的分离鉴定及其降解酶初步分析J天津农业科学，200948吴向华,杨启银,刘五星,等一株沼泽红假单胞菌的分离与鉴定J环境与健康杂志,2004,21210110349黄志勇,王海胜,蒋培霞,等几株光合细菌的分离鉴定及在养殖罗非鱼中的应用J微生物学通报,2005,324727850陈繁忠,朱好根利用光合细菌处理养猪场污水的试验研究J环境工程,2000,1851012本科毕业设计（20_届）株海水光合细菌的分离鉴定及在轮虫增养殖中的应用目录1引言12材料与方法121材料1211样品来源1212培养基与试剂2213仪器设备322方法3221培养物颜色和菌体形态观察3222活细胞吸收光谱的测定3223
35、16SRRNA基因序列分析3224生理特性研究5225海水光合细菌对褶皱臂尾轮虫增养殖的研究63结果与分析731菌体及菌落形态特征732活细胞吸收光谱733菌株CP3的分子鉴定934菌株CP3的生理生化特性9341碳源利用9342氮源利用9343初始PH值对所分离菌株生长的影响10344盐度对菌株生长的影响11345光照与氧气对菌株生长的影响11346生长因子利用11347无机电子供体12348生长曲线的测定1235菌株CP3在褶皱臂尾轮虫增养殖的应用13351轮虫形态特征13352菌株CP3投放实验134讨论1441菌株的单菌落分离1442菌株的生理生化特性1443关于影响菌株的条件1544
36、关于菌种鉴定1545关于海水光合细菌在轮虫增养殖中的应用15致谢16参考文献16摘要我们从浙江宁海东坝养殖场海水养殖塘的泥样中分离到一株海水光合细菌，实验室编号为菌株CP3，我们对菌株CP3做了生物学特性的研究，分析了它的分离纯化、细胞形态、培养特征、活细胞吸收光谱、生理生化特性和16SRRNA基因测序及系统学分析等一系列生物学特性，同时研究了其作用于轮虫培养时对轮虫增养殖的影响。研究结果表明CP3为革兰氏阴性菌，它具有较广的适盐性和耐酸碱特性，厌氧比好氧条件下更适合其生长，菌株CP3的细胞为卵圆形，大小为1015M2229M,厌氧下液体培养物呈红色，最适生长PH60，最适盐度2，CP3能利用
37、S、NA2S、NA2S2O3作为硫电子供体。16SRRNA基因序列测定结果表明菌株CP3与ECTOTHIORHODOSPIRASHAPOSHNIKOVII的相似性水平达997，但是某些形态及生理特征与其不符，可能是新种。在轮虫培养液中，用一定量光合细菌离心后的菌体作为添加剂，发现菌株CP3能在24天内增加轮虫增殖率。因此，在轮虫培养的特定时期加入光合细菌，有助于轮虫的高密度增养殖的实现。关键词光合细菌；革兰氏阴性菌；16SRRNA；轮虫；增养殖ABSTRACTWEISOLATEDONESTRAINOFMARINEPHOTOSYNTHESISBACTERIUMFROMSEDIMENTOFPOND
38、SINDONGBAFARMINNINGHAI,ZHEJIANGPROVINCEWECALLITSTRAINCP3THEARTICLESTUDIEDITSPURIFICATION,MORPHOLOGICAL,CULTURALCHARACTERISTICS,ABSORPTIONSPECTRA,PHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALCHARACTERISTICS,16SRRNAGENESEQUENCEANDITSAPPLICATIONINPROLIFERATIONOFROTIFERTHERESULTSHOWSSTRAINCP3ISGRAMNEGATIVEBACTERIUM,ANDPO
39、SSESSESCOMPARATIVELYEXTENSIVESALTANDPHADAPTABILITYGROWTHOCCURSBETTERANAEROBICALLYTHANAEROBICALLYSTRAINCP3ISOVOIDINSHAPE,10M15M22M29MINSIZEITSANAEROBICCULTURESISREDITGROWSWITHPHOPTIMUMAT60ANDNACLCONCENTRATIONSOPTIMUMAT2STRAINCP3CANUTILIZES,NA2S,NA2S2O3ASSULFIDEELECTRONDONORS16SRRNAGENESEQUENCEANALYSI
40、SSUGGESTEDTHATSTRAINCP3HASTHESEQUENCEIDENTITYOF997WITHECTOTHIORHODOSPIRASHAPOSHNIKOVIIHOWEVER,SOMEMORPHOLOGICAL,PHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALCHARACTERISTICSOFCP3STRAINDONOTAGREEWITHIT,STRAINCP3MAYBEANEWSPECIESWEADDACERTAINMOUNTOFPHOTOSYNTHESISBACTERIAAFTERCENTRIFUGATIONTOTHECULTUREMEDIUMOFROTIFERANDFI
41、NDTHATSTRAINCP3CANINCREASEPROLIFERATIONRATEOFROTIFERIN24DAYSTHEREFORE,BYADDINGPHOTOSYNTHESISBACTERIUMDURINGASPECIFICPERIODOFROTIFERCULTURINGCANHELPTOACHIEVEHIGHDENSITYPROLIFERATIONOFROTIFERKEYWORDSPHOTOSYNTHETICBACTERIUMGRAMNEGATIVEBACTERIUM16SRRNAROTIFERPROLIFERATION1引言光合细菌简称PSB，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系
42、的原核生物1。光合细菌属于水圈微生物的一种，光合细菌广泛分布于地球生物圈的各处，无论是海洋、湖泊、江河，还是水田、池塘、沼泽、污泥、氧化池、硫磺泉、土壤、极地，甚至在90的温泉中、在300的盐湖里、在深达2000M的深海、在南极冰封的海岸上，都能找到其踪迹。他们在全球水系统中的广泛分布突出了他们在水生食物链和生物地球化学元素循环以及与环境间共同进化中的角色2。PSB均为革兰氏阴性细菌，一般为球型、卵形、杆形、弧形、螺旋形、环形、半环形丝形，也可随培养条件和生长阶段而改变，大部分单个存在3。光合细菌根据它们所含光合色素和电子供体的不同分为不产氧光合细菌（ANOXYPHOTOSYNTHETICBA
43、CTERIA）和产氧光合细菌（OXYPHOTOSYNTHETICBACTERIA），是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物4。产氧光合细菌即蓝细菌，能够像植物一样，利用光合作用产生氧气；不产氧光合细菌，即狭义光合细菌，包括厌氧光合细菌（ANAEROBICPHOTOSYNTHETICBACTERIA，APB）和最近提出的好氧不产氧光合细菌（AEROBICANOXYGENICPHOTOSYNTHETICBACTERIA，AAPB）。根据伯杰氏细菌鉴定手册第九版，不产氧光合细菌被分成七大类群2,5着色菌科（CHROMATIACEAE）、外硫红螺菌科（ECTOTHIORHODOSPIRACE
44、AE）、紫色非硫细菌（PURPLENONSULFURBACTERIA，简称PNSB）、绿硫细菌（CHLOROBIACEAE）、多细胞丝状绿细菌（MULTICELLULARFILAMENTOUS，又称绿色非硫细菌）、螺旋杆菌（HALIOBACTERIACEAE）、好氧不产氧光合细菌（AEROBICANOXYGENICPHOTOTROPHS）。光合细菌菌体蛋白质含量在60以上，而且富含B族维生素、氨基酸和促生长因子，是优质的营养型饲料添加剂6,7；光合细菌可以直接用来处理高浓度有机废水，不产生污泥处理问题，所需费用较低8,9；光合细菌既是一种优质的生物肥料，又能增强植物的抗病能力10；同时在保健食
45、品方面，光合细菌也有很多的应用11,12；PSB菌体无毒，营养非常丰富，是一类营养成分高且种类比较全的微生物，作为水产养殖生物的饲料添加剂，具有明显的增产效果13。轮虫在以一定浓度的小球藻为饵培养时，在恒温25的条件下，光合细菌添加浓度为250PPM时轮虫的日平均增殖率最高14。褶皱臂尾轮虫是一种半咸水的滤食性浮游动物，多以细菌、浮游藻类及小型原生动物和有机碎屑为食。作为鱼、虾类幼体的开口饵料，其适口性、可得性、营养价值及饲养效果均优于其它饵料，而且适应力强，生长快，繁殖迅速，培养成本低，极易在生产实践中推广利用。褶皱臂尾轮虫的高密度培养是水产养殖鱼、虾育苗成功与否的关键。褶皱臂尾轮虫的大规模
46、、高密度培养的环境条件要求与褶皱臂尾轮虫的生理需求相一致，否则培养的褶皱臂尾轮虫将会增殖不良、密度低、营养价值低、甚至逐渐死亡。本文对一株海水光合细菌的细胞形态、培养特征、活细胞吸收光谱、生理生化特性以及16SRRNA基因序列等进行分析。针对目前国内的研究情况以及生产上的需要，利用微生物制剂在科学领域方面获得的巨大成效，从轮虫培养中的残饵、粪便等代谢产物出发，进行研究，充分利用本来想方设法要去除的有害物质，变废为宝，把海水光合细菌应用于褶皱臂尾轮虫的增养殖，希望为水产养殖业的发展提供有价值的材料及理论依据。2材料与方法21材料211样品来源菌种CP3来自宁波大学生命科学与生物工程学院“应用海洋
47、生物技术”教育部重点实验室光合细菌资源（浙江宁海东坝养殖场海水养殖塘的泥样中得到）。实验用到的褶皱臂尾轮虫采于宁波象山高泥育苗场。样品的采集按照海洋调查规范15的要求进行。应用采泥器采集表层泥样，取泥样1G于螺口厌氧管中，加灭过菌的液体培养基至满，拧上螺口帽，混匀。带回实验室，放入32光照强度30005000LUX的培养箱培养。光下培养约515天，待有红色、粉色、黄色或褐色生长物明显生长后，再连续转接多次以求培养液中光合细菌占优势，待进一步分离。212培养基与试剂AAT基础培养基（表1），稍作修改（参照IMHOFFJF1992）表1AT基础培养基配方TAB1ATBASALMEDIUMFORMU
48、LATION成分数量成分数量乙酸钠10GFESO47H2O18MG丁酸钠10G维生素溶液10ML氯化钠NACL10G微量元素溶液（SLA）10MLMGCL26H2O025G氯化铵NH4CL10G氯化钙CACL2005G（50MG）酵母膏02G磷酸缓冲液母液5ML加蒸馏水至1L注（1）维生素母液成分（MG/100ML）生物素BIOTIN10，烟酸NIACIN35，盐酸硫胺素THIAMINEDICHLORIDE30，对氨基苯甲酸AMINOBENZOACID20，盐酸吡哆胺PYRIDOXOLIUMHYDROCHLORIDE10，泛酸钙CAPANTHOTHENATE10，VITAMINB125。（2）
49、微量元素母液成分（MG/L）FECL24H2O1800，COCL26H2O250，NICL26H2O10，CUCL22H2O10，MNCL24H2O70，ZNCL2100，H3BO3500，NA2MOO42H2O30，NA2SEO35H2O10。（3）磷酸缓冲液成分（G/L）KH2PO468,K2HPO4114。磷酸缓冲液需单独灭菌，用前加，以免高温灭菌时产生沉淀。（4）半固体加4G琼脂。（5）AT基础培养基加入253的氯化钠，用于培养海水样品。BDNA提取试剂（1）1TE溶液（PH80）；（2）50MG/ML溶菌酶；（3）20SDS溶液（十二烷基硫酸钠）；（4）酚/氯仿/异戊醇溶液（25241,V/V）；（5）氯仿/异戊醇溶液（241，V/V）；（6）70乙醇溶液；（7）3MOL/LNAAC溶液；（8）异丙醇。CPCR相关试剂超纯水；10PCRBUFFER；DNTP；TAQ酶（TAKARA）；模板DNA。D琼脂糖胶回收DNA试剂BINDINGBUFFER；WASHSOLUTION；无菌水。213仪器设备A设备SPDJ系列水平净化工作台；HVE50型高压灭菌锅；RXZ300B人工气候箱；UV2102PC型紫外可见分光光度计（UNICO）；FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系
