1、蛙的催青和人工授精 一、目的要求 通过本实验，掌握中国虎纹蛙的催青及人工授精的操作技术，了解蛙从受精卵到变态阶段的外形变化，进一步树立蛙胚发育中动态和立体的概念。 二、仪器药品 注射器、培养皿、解剖剪、解剖镊子、解剖镜、显微镜、塑料桶、 1000ml 的广口瓶、吸管、放大镜、采集网。 LRH-A3（促黄体）、 HCG（商品名：多情素） 。 三、材料 虎纹蛙（ Rana tigrina rugulosa） 四、方法 催青及人工授精 1催青 把刚从野外捕捉到的蛙，选择雌蛙体长大于 75mm 和雄蛙体长大于 70mm 的性成熟的个体，放于水缸中。首先提高水温达到 18 20C。取雌蛙，在腹腔注射 L
2、RH-A（注射量每只 3 5g左右）， hCG(注射量每只 20 30国际单位 /ml)，雄蛙的注射量可酌减一半。 具体配置方法： LRH-A（ 100 g 每支） 3 支加水配成 40ml 溶液，雌蛙剂量为 0.5ml，雄蛙减半； HCG（每支 10000国际单位） 1支加水配成 500ml溶液，雌蛙剂量 1ml，雄蛙减半。 将注射后的虎纹蛙分成 3桶， A桶 10只雄蛙， B桶 10只雌蛙， C桶 5对雌雄。桶里放少量水，将纸皮箱剪开洞口后盖住桶口，以重物压上，留出透气口的同时防 止蛙逃窜。 2人工授精 精子悬浮液的制备：先用剪刀将雄蛙腹中线剖开，露出黄色或褐色的精巢，用剪刀剪下精巢，放入
3、培养皿或研钵中。用弯头剪刀将精巢剪碎或用研钵轻轻研磨，再加适量生理盐水，用玻璃棒搅拌均匀，即可制得精子悬浮液。 用左手握住催青后即将产卵的雌蛙，腹部向上，用右手拇指和食指由前向后轻轻挤压腹部，卵即可由泄殖孔流出。把挤出的卵，收集在培养缸内，加入已制备好的精子悬浮液摇匀，使精液和卵充分均匀接触， 1015min 后更换净水，洗去多余精子，经几次换水后，加入足量清水，以保证受精卵正常发育。 （三）胚胎发 育的观察 取少许卵块，放在滤纸上轻轻滚动，以清除卵外之胶膜，再置于盛有清水的培养皿中，用吸管将需要观察的受精卵，移入另一培养皿中，在解剖镜下，观察各发育时期的外部形态的变化。下表为虎纹蛙正常胚胎发
4、育时期表 虎纹蛙（ Rana tigrina rugulosa）正常发育时期表 发育时间 由受精时所需的时间（ h） 此时期耗时（ h） 水温（ ） 该时期特点 备注 第一时期 受精卵 0.63h 26.0 动物极朝上，棕黑色；植物极朝下，乳白色 室温为 26.0 第二时期 2细胞期 0.63h 0.13 h 经裂，卵裂沟贯穿动植物极 第三时期 4细胞期 0.76 h 0.83 h 经裂，卵裂沟垂直于第一次 第四时期 8细胞期 1.59 h 0.08 h 经裂，两条卵裂沟 第五时期 16细胞期 1.67 h 0.35 h 纬裂，动物半球略小于植物半球 第六时期 32细胞期 2.02 h 0.1
5、5 h 经裂 第七时期 囊胚早期 2.17 h 0.53 h 动物半球卵裂速度大于植物半球，卵裂不同不同规则 第八时期 囊胚中期 2.70 h 0.8 h 动物极隆起 第九时期 囊胚晚期 3.5 h 1.58 h 细胞边界不明显 第十时期 原肠胚早期 5.08 h 0.97 h 赤道板上方，偏向动物极的地方，部分细胞内陷及卷入 第十一时期 原肠胚中期 6.05 h 2.05 h 下包卵黄达 2/3 第十二时期 原肠胚晚期 8.1 h 1.83 h 30.7 卵黄栓出现 此时观察地点转移到宿舍，室温为 30.7，错过神经板期 第十三时期 神经板期 胚孔封闭，胚体纵轴开始伸长，背部变平坦 第十四时
6、期 神经褶期 9.93 h 2.1 h 30.5 神经 板从前端两侧开始隆起并向后延伸形成神经褶，中间凹陷形成神经沟 纤毛出现期较难判断，故错过 第十五时期 纤毛出现期 (胚胎的转动 ) 两侧神经褶逐渐向中间合拢 , 神经沟变深而窄，然后成线状裂缝 第十六时期 神经管期 12.03 h 0.83 h 29.6 神经褶完全愈合形成神经管 第十七时期 尾芽期 12.86 h 11.3 h 28.9 尾芽明显翘起并伸长 这段时期由于发生在深夜，故错过，孵化指幼体出膜，在下面发育个时期中无图片 第十八时期 肌肉效应期 胚体受机械刺激，躯干及尾会左右 扭动 第十九时期 孵化 第二十时期 心跳期 咽部腹面
7、可见心脏微微搏动 第二十一时期 鳃血循环期 24.16 h 4.3 h 28.2 鳃丝内见血球作间歇性脉冲流动，口窝加深 第二十二时期 开口期 28.46 h 1.35 h 30.0 口窝内的口板膜穿通，口呈裂缝状 第二十三时期 尾血循环期 29.81 h 10.1 h 30.1 尾部与腹部交界之处可见到微 弱的血液循环 第二十四时期 鳃盖褶初期 39.91 h 9.9 h 30.8 每侧外鳃基部出现皮肤褶，并 逐渐向腹面会合形成一条完整的肤褶 第二十五时期 右鳃盖闭合期 49.81 h 11.7 h 29.8 右侧外鳃丝逐渐缩短，直至被鳃盖褶所遮盖，左侧鳃丝仍大部分暴露 第二十六时期 鳃盖封
8、闭期 61.51 h 30.9 左侧外鳃完全被鳃盖褶所封盖 从受精卵到鳃盖封闭期总共耗时 61.51h。 五、虎纹蛙胚胎发育各时期 1.受精卵； 2.二 细胞期； 3.四 细胞期； 4.八 细胞期； 5.十六 细胞期； 6.三十二 细胞期； 7.囊胚早期； 8.囊胚中期； 9.囊胚晚期； 10.原肠胚早期； 11.原肠胚中期； 12.原肠胚晚期； 13.神经板期； 14.神经褶期； 15.纤毛出现期 (胚胎的转动 )； 16.神经管期； 17.尾芽期； 18.肌肉效应期； 19.心跳期； 20.鳃血循环期； 21.开口期； 22.尾血循环期； 23.鳃盖褶初期； 24.右鳃盖闭合期 25.角质
9、颌期； 26.鳃盖封闭期 六、讨论： 1.在给亲蛙注射催产时，可采用皮下注射法。具体操作是：两人配 合，一人抓住青蛙，另一人抓起蛙背部尾椎骨两侧的皮肤，将针头插进皮下，用手指按住注射口，打完后轻轻将催产素推开，以防从伤口溢出。 2.由于整个实验过程中分在两个地方进行，在实验室维持在水温 26.0，而在宿舍则处于 2931的波动范围内，整个实验从受精卵发育到鳃盖封闭期共耗时 61.51小时，对照刘丽的泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙早期胚胎发育比较研究 （ 1） 的时间为泰国虎纹蛙发育时间总计70.4 小时，中国虎纹蛙时间总计 92.5 小时（水温（ 25 1），而本次实验材料为中国虎纹蛙，证明较高温度能加快虎纹蛙胚胎发育的速 度。
