1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全费菜提取液抑菌效果和抗氧化研究一、选题的背景与意义费菜俗称“土人参”，又名土三七、救心菜，属景天科多年生草本植物。费菜主要分布于我国长江以南各地，不论在平原、丘陵地带还是高原山区费菜均能生长。它含有齐墩果酸、谷甾醇、生物碱、景天庚糖、黄酮类、有机酸、维生素E等多种成份，费菜中的这些成份使得它具有抑菌、抗氧化、增强免疫、扩张脑血管、改善冠状动脉循环等途径，达到降血压、防中风、防心脏病降血脂、抗肿瘤等功效，有很高的食用价值和医疗保健功能。随着人们对生活水平的不断提高，对身体保健也越来越重视，近年来世界上掀起了植物药及保健品的开发热潮。通过对费菜提取液抑菌和抗氧
2、化效果的研究，可以提高费菜的使用价值，有助于生产出具有治疗和预防多种疾病的药品和天然保健品，为费菜的综合利用开辟新途径，创造更大的社会效益和经济效益。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1研究费菜提取液对大肠杆菌的抑制效果2研究金黄色葡萄球菌的抑制效果3研究枯草芽孢杆菌的抑制效果4测提取液中总黄酮的浓度5研究费菜提取液还原力的测定6研究费菜提取液对羟自由基的清除能力7研究对DPPH自由基的清除率三、研究的方法与技术路线1费菜提取液制取取新鲜费菜叶在70烘干24H，然后用药物粉碎机粉粉碎并过80目筛，得到的叶粉备用，在提取之前将叶粉在105烘干2H左右。称取5G干粉，置于150ML锥形瓶
3、中，按照料液比150加入浓度为70的乙醇，超声提取50MIN，60水浴浸提6H，趁热抽滤，得到滤液。将粗提液用旋转蒸发仪在4550下浓缩至适量后，加入34倍体积的95乙醇以沉淀多糖6H以上，再将粗提液用旋转蒸发仪在4550下浓缩至适量，备用。2抑菌圈法测定抑菌效果提前3天把大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌进行活化，接种斜面上备用。制备营养琼脂培养基,营养肉汤用于细菌的液体培养。把所要用的培养基、培养皿、移液枪头、无菌水等灭菌备用。首先做每个菌不同梯度浓度的菌悬液。然后选择一种浓度的菌液用涂布的方法在培养皿中做好平板。用在酒精灯上烧过的6MM的打孔器在每个平板上打3个孔，正三角形均匀分散放
4、置在平皿中央，每两个孔之间距离30MM以上，每个菌种做三组平行。并用灭菌的镊子夹掉打孔后的琼脂，分别取50L的费菜提取液、硫酸庆大霉素和水注入3个孔内。硫酸庆大霉素做阳性对照，水做阴性对照。最后测每种菌菌落总数，基本保证做抑菌圈时各种菌的浓度一样（106108个/ML）。暗室培养细菌37/24H。测定抑菌圈直径，取平均值。3费菜提取液最低抑菌浓度MIC和最低杀菌浓度（MBC）的测定采用二倍稀释法，以水为溶剂，配制一系列梯度浓度的费菜提取液溶液，将不同梯度浓度的费菜提取液溶液1ML加入到1ML已灭菌的液体培养基中，混合均匀，使培养基中费菜提取液的浓度分别为原提取液的12，14，18，116，13
5、2，164，再在每管中加入01ML的菌液。暗室培养细菌37/24H，每一与对照组（不加菌）比较，是否变浑浊，以不变浑浊管费菜提取液浓度为其最低抑菌浓度MIC，MINIMUMINHIBITORYCONCENTRATION。分别吸取1ML以上管中的液体到40度左右的营养琼脂培养基，测是否长菌。不长菌的最小费菜提取液浓度就是MBC。4测费菜提取液中总黄酮的浓度用芦丁做标准曲线，精密量取芦丁取液010ML、020ML、030ML、040ML、050ML、060ML，费菜提取液05ML、10ML、15ML、2ML、25ML分置25ML量瓶中，各加水至6ML；分别加5NANO2溶液1ML，摇匀，放置6MI
6、N；分别加10ALN033溶液1ML，摇匀，放置6MIN；然后分别加4NAOH溶液1OML，并分别加水至刻度，摇匀，静置15MIN，在510NM测定吸收度，以芦丁浓度CMGML对吸光度A作标准曲线，费菜提取液吸光度根据标准曲线算出浓度。5还原力测定取25ML不同浓度的费菜提取液于试管中，依次加人25ML02MOLLPBSPH66、5ML1K3FECN6溶液，于5O保温20MIN后快速冷却，再加入25ML10三氯乙酸溶液，3000RMIN离心10MIN，取上清液25ML，依次加入25ML蒸馏水、05ML01FEC1，溶液，充分混匀，静置10MIN，测定吸光值（以蒸馏水为参比溶液，吸光度值越高还原
7、力越强，作成曲线。6羟自由基清除率测定按照SMIRNOF1989的方法，利用H2O2与FESO4混合产生OH，在体系内加入水杨酸捕捉OH并产生有色物质，该物质在510NM处有最大吸收。于10ML容量瓶中依次加入2MMOLLFESO42ML，6MMOLLH2O22ML，6MMOLL水杨酸一乙醇6ML，于37水浴中保温15MIN后取出，以蒸馏水为参比，510NM下测其吸光度A。，然后再加入04ML被测定样品，摇匀，37水浴中保温15MIN后取出，以蒸馏水为参比，510NM下测其吸光度AX。考虑到色素本身的吸光度值，做了对照试验于25ML容量瓶中依次加入2MMOLLFESO42ML，蒸馏水5ML，6
8、MMOLL水杨酸一乙醇6ML，于37水浴中保温15MIN，然后加入04ML被测定样品，摇匀，于37水浴中保温15MIN后取出，以蒸馏水为参比，510NM下测其吸光度清除率计算公式为清除率A0AXAX0/A0式中AO为空白对照液的吸光度；AX为加入色素溶液后的吸光度；AXO为不加显色剂H202色素溶液本底的吸光度。7对DPPH自由基清除率的测定取不同浓度费菜提取液2ML及浓度为2104MOL/L的DPPH溶液2ML先后加入同一具塞试管中，避光30MIN后以样品提取溶剂为空白调零测定其吸光度AI；测定2ML浓度为2104MOL/L的DPPH溶液与2ML无水乙醇混合液的吸光度AE；再测定2ML黄酮提
9、取液与2M1无水乙醇混合液的吸光度AJ，重复5次，求其平均值。根据下列公式计算沙枣黄酮提取液对DPPH的抑制率，即抑制率1AIAJ/AE100,做标准曲线。四、研究的总体安排与进度201010201011查阅文献，设计初步实验方案；201011200812实验设计，开题报告；201102201104实验操作；201104201105数据处理，撰写论文。五、主要参考文献1袁婷,钟学稳常见中草药的体外抑菌试验J试验研究,2009,923242郑瑞生,封辉植物中抗氧化活性成分研究进展J中国震学通提2010，26985903张连琴自由基与疾病J天津医科大学学报,1997,3285884陈月明,王水明植
10、物提取物的抗菌作用J饲料研究,2010,538395吴万传,杜小凤,王伟中等植物源抑菌活性成分研究进展J淮阴工学院学报,2004,13328356曲中堂,项昭保,赵志强等橄榄总黄酮抑茵作用研究J中国酿造,2010,462637刘卫今,葛婷,刘胜贵等羊耳菊黄酮类化合物的提取与抑菌作用J湖北农业科学,2010,49（2）4264298ENZOATOSI,EDMUNDORE,MARTAEORTEGAFOODPRESERVATIVEBASEDONPROPOLISBACTERIOSTATICACTIVITYOFPROPOLISPOLYPHENOLSANDFLAVONOIDSUPONESCHERICHIA
11、COLIFOODCHEMISTRY2007,104102510299徐金瑞,郭志成,罗燕琴等番石榴叶对食品中几种常见细菌的抑菌作用J食品研究与开发,2010,31（3）17317510李翠芳,王芳,麻浩等新疆紫草毛状根提取物的抑菌活性研究J河北农业大学学报,2010,33（3）929611严汉彬,林岚岚,丁力行等肉桂提取物抗菌及抗氧化的研究J中国调味品,2010,7,35414412魏朝良黄酮类化合物及清除自由基机制的探讨J中成药,2005,2223924113SIEUNLEE,HYUNJINHWANG,JUNGSUNHAETALSCREENINGOFMEDICINALPLANTEXTRACT
12、SFORANTIOXIDANTACTIVITYJLIFESCIENCES,2003,7316717914赵军黄酮类化合物的抗氧化机制J华北煤炭医学院学报,2003,5（3）30630715张桂芝,耿莎,杨海燕等植物抗氧化成分的研究进展J食品科学，2007,281255155316陈蕉，黎云祥，陈光登，等两种岩白菜属植物根茎黄酮和多糖的提取及抗氧化活性研究J食品工业科技,2009,3039810117樊金玲,丁霄霖沙棘籽提取物抗氧化活性与酚类组成的研究J天然产物研究与开发,2OO6,1852953418李海云,王秀丽,潘英明等罗汉果不同溶剂提取物抗氧化及清除活性氧自由基作用J广西植物,20082
13、8569870219张改平,朱华泽,杨建雄等甘草提取物的体外抗氧化活性J生物加工过程,2010,83535720吴新安,花日茂,岳永德等植物源抗菌、杀菌活性物质研究进展J安徽农业大学学报,2002,29324524921张燕宁,雷敏,孙伟等56种植物对植物病原菌的生物活性J农药,2010,49429029222任顺成,范永超,李翠翠等30种中草药提取物对食品细菌的影响J安徽农业科学,2010,38147529755623王锋鹏生物碱化学M北京化工出版社,2008151924张培成黄酮化学M北京化学工业出版社,200927338225谢明勇,聂少平天然产物活性多糖结构与功能研究进展J中国食品学报
14、,2010,10211126谢笔钧银杏叶提取物黄酮的热加工与保健饮料生产技术J农村实用技术与信息,2005,152927张英,沈建福,俞卓裕等竹叶黄酮作为抗衰老护肤因子的应用基础研究J林产化学与工业,2004,2419510028李崇高,黄建初,黄泳梅等魔芋多糖仿生食品工艺的研究J西南大学学报自然科学版,2008,30111912529岳宗翠,周广田岩藻多糖啤酒生产工艺的研究J中国酿造,2010,114815030张丽莉,信维平枸杞多糖风味酱油的工艺研究J中国调味品,2009,1347577毕业论文文献综述食品质量与安全一些植物提取液抑菌效果和抗氧化研究进展摘要在人民生活水平提高的同时，崇尚自
15、然、健康已越来越被大众所接受。从以上种种可以得出开发天然高效、安全无毒、性能稳定、广谱的天然抑菌剂和抗氧化剂已成为研究和应用的一个热点。通过对植物提取液成份及其功能的研究，可以提高植物有效成分应用的新价值，有助于生产出具有治疗和预防多种疾病的药品、天然保健品和功能性食品，为植物的综合利用开辟新途径，创造更大的社会效益和经济效益。关键词提取液抑菌抗氧化1前言抗生素1的开发及应用表现的是临床治疗细菌感染性疾病的划时代标志，其抗菌作用不容置疑，但其过敏反应、二重感染及细菌的耐药性等毒副作用使其应用受到一定的限制；食品安全保藏历来都是食品工业面临的难题之一,为了防止食品的腐败变质，延长食品的储存期，一
16、般多采用冷藏、杀菌、密封包装、添加防腐剂等手段，但一些合成的防腐剂往往对身体有害；植物病害是农业生产的大敌，但由于化学农药潜在的对人类健康的危害、对环境的污染、对非靶标生物的影响、植物病原菌抗性的发展及人类健康、环保意识的增强，使得化学农药的发展受到了来自各方面的限制。根据英国HARMAN的自由基学说23，活性氧自由基REACTIVEOXYGENSPECIES，ROS攻击生命大分子，导致蛋白质损伤、酶失活、膜脂过氧化、碳水化合物和核酸损伤是引起机体衰老的根本原因，也是诱发肿瘤等恶性疾病的重要原因。常见的癌症、动脉硬化、糖尿病、白内障、心血管病、老年痴呆、关节炎等，这些疾病都被认为与自由基相关。
17、在人民生活水平提高的同时，崇尚自然、健康已越来越被大众所接受。从以上种种可以得出开发天然高效、安全无毒、性能稳定、广谱的天然抑菌剂和抗氧化剂已成为研究和应用的一个热点。2植物提取液抑菌效果21植物提取液的抑菌作用目前，植物提取液的抑菌作用机制仍没有彻底明了。由于提取液所用的种类繁多，其活性成分也很多，因此，提取液抑菌机制可能有多种机制。这些作用机制包括4，1破坏/降解细胞壁。2破坏细胞质膜。3破坏细胞膜蛋白质结构。4使细胞内容物泄露。5使细胞质凝聚。6减弱质子运动力。需要说明的是，所提出的几种作用机制并非都是独立的，可能会相互影响，一种机制的反应可能会受另一种反应物或生成物的影响。22植物提取
18、液抑菌活性成分近年来，国内外对植物提取液抑菌剂的研究倍受重视，并取得了较大的进展，发现了很多具有开发潜力的抑菌、杀菌或抗菌的化学成分，其结构类型涉及萜类、生物碱类、黄酮类、苷类、皂甙、醌类、香豆素、木脂素、芪类、酯类、酚类、醛类、醇类、甾类、有机酸及精油类等化合物5。其中国内外关于黄酮类的抑菌研究很多，黄酮的抑菌效果也很明显68。另外一些蒽甙和植物中的木质素、植保素及一些蛋白质如抗真菌蛋白AFP亦有抑菌抗病活性。23近年一些植物提取液的抑菌作用的研究徐金瑞9等分别用水提和醇提法对番石榴叶的提取液进行抑菌实验，结果得出番石榴叶水提物、乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌均
19、有一定的抑菌活性。总体上，水提取物抑菌活性优于乙醇提取物，水提取物的抑菌效果是金黄色葡萄球菌沙门氏菌大肠杆菌枯草芽孢杆菌。李翠芳10等，以甜瓜叶斑病、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、棉花枯萎病菌和棉花黄萎病菌5种菌为供试菌，对新疆紫草毛状根紫草素粗提物及多糖进行抑菌活性研究。结果表明乙醇提取物对3种细菌均具有抑制作用；丙酮提取物仪对甜瓜叶斑病菌有抑制作用，其抑制作用较乙醇提取物高265。乙酸乙酯和石油醚提取物对3种细菌均兀抑制作用；4种溶剂提取物对2种真菌均有抑制作用，且对棉花黄萎病菌的抑制率均高于枯萎病菌。严汉彬11等用肉桂醇提液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉、酿酒酵母进行试验，结果表明肉桂醇
20、提液对对细菌、霉菌和酵母均有很强的抑制作用。3植物提取液抗氧化研究1231植物提取液清除自由基作用自由基系含有未成对电子的原子、原子团或分子，生物内自由基的形成与需氧细胞的正常代谢有关。细胞的生长会消耗大量氧，结果导致大量氧自由基的产生，这种现象即“氧化压力”。细胞氧化过程中产生的自由基有单线态氧（1O2）、超过氧化物阴离子（O2）、羟自由基（OH）以及过氧自由基（ROO等13。清除自由基的原理有以下几点14（1）作用于自由基有关的酶。（2）阻断自由基链的传递过程。（3）与诱导氧化的过渡金属离子络合。32植物提取液抗氧化活性成分水果、蔬菜，药用植物中均含有许多抗氧化成分。植物提取物的抗氧化活性
21、成分主要有黄酮类化合物、多酚类化合物、维生素C、E及其衍生物、皂苷类、生物碱类、多糖类等。一些番茄红素、叶黄素等也有较强的抗氧化能力15。另外，天然抗氧化剂多种多样，有些植物提取物可能含有两种或多种的抗氧化成分，并非单一因素在起作用16。33近年一些植物提取液的抗菌作用的研究樊金玲等17采用卵磷脂脂质体体系比较了沙棘籽不同溶剂提取物的抗氧化活性，对其中的抗氧化活性成分进行了分析。试验结果表明70丙酮提取物具有最强的抗氧化活性、清除DPPH自由基能力和还原力。李海云等18以水、甲醇、乙醇和乙酸乙酯为溶剂，对罗汉果干果进行提取，分别采用磷钼酸铵体系、邻苯三酚自氧化体系、FENTON反应体系和卵黄脂
22、质过氧化体系测定各种提取物的总抗氧化性能、超氧阴离子自由基和羟基自由基清除性能及其抗脂质过氧化作用。结果表明，四种溶剂提取物均具较强的抗氧化性和活性氧自由基清除性能，其能力的大小顺序为乙酸乙酯提取物水提物甲醇提取物乙醇提取物。张改平19等制制取了甘草粗提物和用60乙醇回流提取的甘草提取液，发现两者能有效清除02、DPPH和OH，具有良好的总抗氧化能力和还原能力，而且后者比前者好。4植物提取液的研究展望抑菌剂在医疗、食品和农业等方面有着广泛的应用。由于抗生素、防腐剂、农药等不断有负面效果的出现，研究新型的抑菌剂已非常必要。通过历年大规模药用植物调查，已发现我国药用植物有8000种左右，而作过抑菌
23、活性研究的植物仅仅涉及菊科、唇形科等十多个科植物20。但是张燕宁21等研究了56种植物对植物病原菌的生物活性，任顺成22等研究了30种中草药提取物对食品细菌的影响，表明了我们具有丰富的抑菌植物资源有待研究与开发。抗氧化剂在食品和医疗等领域有广泛的应用，由于天然抗氧化剂具有来源广泛、提取率高、抗氧化活性强、与机体亲和力强和安全性高等优点具有取代合成抗氧化剂趋势，是今后的研究重点。5植物提取液的新应用植物提取液中有很多有效的生物活性成分。比如生物碱具有抗肿瘤活性，保护心血管系统，对神经系统具有镇痛和止痛作用，还具有抑菌效果23；黄酮类可扩张心脑血管，促进血液循环；齐墩果酸还可保护肝脏，起到延缓老年
24、性肝组织纤维化的作用，经常服用能有益健康、延年益寿24；多糖在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等方面有显著效果等25。目前对这方面已有一些研究，从不同植物中提取黄酮和多糖等成分开发不同的产品。例如银杏叶黄酮饮料26、竹叶黄酮美容护肤品27；大豆异黄酮胶囊；魔芋多糖仿生食品28；岩藻多糖啤酒29；枸杞多糖风味酱油30等。今天，天然产物研究与开发利用已成为世界潮流的，通过对植物提取液成份及其功能的研究，可以提高植物有效成分应用的新价值，有助于生产出具有治疗和预防多种疾病的药品、天然保健品和功能性食品，为植物的综合利用开辟新途径，创造更大的社会效益和经济效益。把他们应用于医疗、农业、食品等领
25、域，应用前景较为广阔。参考文献1袁婷,钟学稳常见中草药的体外抑菌试验J试验研究,2009,923242郑瑞生,封辉植物中抗氧化活性成分研究进展J中国震学通提2010，26985903张连琴自由基与疾病J天津医科大学学报,1997,3285884陈月明,王水明植物提取物的抗菌作用J饲料研究,2010,538395吴万传,杜小凤,王伟中等植物源抑菌活性成分研究进展J淮阴工学院学报,2004,13328356曲中堂,项昭保,赵志强等橄榄总黄酮抑茵作用研究J中国酿造,2010,462637刘卫今,葛婷,刘胜贵等羊耳菊黄酮类化合物的提取与抑菌作用J湖北农业科学,2010,49（2）4264298ENZO
26、ATOSI,EDMUNDORE,MARTAEORTEGAFOODPRESERVATIVEBASEDONPROPOLISBACTERIOSTATICACTIVITYOFPROPOLISPOLYPHENOLSANDFLAVONOIDSUPONESCHERICHIACOLIFOODCHEMISTRY2007,104102510299徐金瑞,郭志成,罗燕琴等番石榴叶对食品中几种常见细菌的抑菌作用J食品研究与开发,2010,31（3）17317510李翠芳,王芳,麻浩等新疆紫草毛状根提取物的抑菌活性研究J河北农业大学学报,2010,33（3）929611严汉彬,林岚岚,丁力行等肉桂提取物抗菌及抗氧化的研
27、究J中国调味品,2010,7,35414412魏朝良黄酮类化合物及清除自由基机制的探讨J中成药,2005,2223924113SIEUNLEE,HYUNJINHWANG,JUNGSUNHAETALSCREENINGOFMEDICINALPLANTEXTRACTSFORANTIOXIDANTACTIVITYJLIFESCIENCES,2003,7316717914赵军黄酮类化合物的抗氧化机制J华北煤炭医学院学报,2003,5（3）30630715张桂芝,耿莎,杨海燕等植物抗氧化成分的研究进展J食品科学，2007,281255155316陈蕉，黎云祥，陈光登，等两种岩白菜属植物根茎黄酮和多糖的提取
28、及抗氧化活性研究J食品工业科技,2009,3039810117樊金玲,丁霄霖沙棘籽提取物抗氧化活性与酚类组成的研究J天然产物研究与开发,2OO6,1852953418李海云,王秀丽,潘英明等罗汉果不同溶剂提取物抗氧化及清除活性氧自由基作用J广西植物,200828569870219张改平,朱华泽,杨建雄等甘草提取物的体外抗氧化活性J生物加工过程,2010,83535720吴新安,花日茂,岳永德等植物源抗菌、杀菌活性物质研究进展J安徽农业大学学报,2002,29324524921张燕宁,雷敏,孙伟等56种植物对植物病原菌的生物活性J农药,2010,49429029222任顺成,范永超,李翠翠等30
29、种中草药提取物对食品细菌的影响J安徽农业科学,2010,38147529755623王锋鹏生物碱化学M北京化工出版社,2008151924唐浩国黄酮类化学物研究M北京科学出版社,200927338225谢明勇,聂少平天然产物活性多糖结构与功能研究进展J中国食品学报,2010,10211126谢笔钧银杏叶提取物黄酮的热加工与保健饮料生产技术J农村实用技术与信息,2005,152927张英,沈建福,俞卓裕等竹叶黄酮作为抗衰老护肤因子的应用基础研究J林产化学与工业,2004,2419510028李崇高,黄建初,黄泳梅等魔芋多糖仿生食品工艺的研究J西南大学学报自然科学版,2008,3011191252
30、9岳宗翠,周广田岩藻多糖啤酒生产工艺的研究J中国酿造,2010,114815030张丽莉,信维平枸杞多糖风味酱油的工艺研究J中国调味品,2009,1347577本科毕业设计（20_届）费菜提取液抑菌效果和抗氧化研究目录1引言错误未定义书签。2材料与方法1421材料与试剂14211原料15212试验菌种15213试剂2214主要仪器222实验方法16221实验路线16222测定方法32221费菜提取液中黄酮浓度测定32222菌种的预处理错误未定义书签。2223费菜提取液抑菌圈测定42224费菜提取液最低抑菌浓度（MIC）测定52225费菜提取液最低杀菌浓度（MB）测定52226费菜提取液还原力测
31、定52227费菜提取液羟自由基清除率测定52228费菜提取液DPPH清除能力测定63结果与分析631费菜提取液总黄酮含量632费菜提取液的抑菌效果733不同浓度的费菜提取液对细菌的抑制效果934不同浓度的费菜提取液的灭菌效果935费菜提取液的还原能力1036费菜提取液清除羟基自由基的能力1037费菜提取液清除DPPH的能力114小结1241费菜提取液的抑菌效果1242费菜提取液的抗氧化效果12致谢13参考文献错误未定义书签。附录15【摘要】费菜，俗称养心草、救心菜、三七等，属景天科多年生草本植物。费菜是一种集食用、药用和观赏为一体的经济农作物。本文通过测定抑菌圈、MIC、MBC等方法对费菜提取
32、液进行抑菌效果研究，结果发现其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有明显的抑菌效果，而且抑菌效果随着费菜提取液浓度的增加而加强；用还原力、羟自由基清除率和DPPH自由基清除率测定抗氧化能力表明具有较强的抗氧化能力。通过此研究可以提高费菜有效成分的应用新价值，有助于生产天然保健品和出具有治疗和预防多种疾病的药品，为费菜的综合利用开辟新途径，创造更大的社会效益和经济效益。【关键词】费菜抑菌抗氧化【ABSTRACT】AIZOONSTONECROPHERB,COMMONLYKNOWNASYANGXINGRASS,SAVEHEARTGRASS,NOTOGINSENGETCITISBELONGTOST
33、ONECROPHERBPERENNIALHERBACEOUSPLANTSAIZOONSTONECROPHERBISANECONOMICCROPSAGGREGATEEDIBLE、MEDICINALANDORNAMENTALFUNCTIONS,THISARTICLEUSESDETERMINATIONBACTERIOSTATICCIRCLE,MIC,MBCMETHODSTORESEARCHTHEBACTERIOSTATICEFFECTOFAIZOONSTONECROPHERBEXTRACTFOUNDINGTHATITSHASOBVIOUSBACTERIOSTATICEFFECTTOESCHERICH
34、IACOLI,STAPHYLOCOCCUSAUREUSANDBACILLUSSUBTILIS,ANDTHATTHEBACTERIOSTATICEFFECTASAIZOONSTONECROPHERBEXTRACTCONCENTRATIONANDSTRENGTHENTHEINCREASEUSEINGREDUCTIONFORCE,HYDROXYLRADICALSCLEARANCEANDDPPHFREERADICALSCLEARANCETODETERMINATANTIOXIDANTCAPACITYINDICATESANDINDICATETHATITHASSTRONGANTIOXIDANTCAPACIT
35、YTHISRESEARCHCANIMPROVETHEAPPLICATIONOFNEWVALUEABOUTAIZOONSTONECROPHERBSEFFECTIVEINGREDIENTS,WHICHHELPSTOPRODUCEHEALTHCAREPRODUCTSANDDRUGSWITHTREATMENTANDPREVENTVARIOUSDISEASES,OPENINGANEWAVENUEFORAIZOONSTONECROPHERBSCOMPREHENSIVEUTILIZATION,CREATINGGREATERSOCIALBENEFITSANDECONOMICBENEFITS【KEYWORD】A
36、IZOONSTONECROPHERBBACTERIOSTATANTIOXIDATI1引言费菜，俗称养心草、救心菜、三七、土三七等，属景天科多年生草本植物。株高2550厘米，丛生，分蘖力强。肉质根较肥大，叶匙形，对生，翠绿，肥厚多汁，叶缘锯齿状；花黄色，星芸状集生顶部，成片状分布，花期69月；果熟期810月，种子细小。费菜始载于救荒本草，具体很好的营养价值，据研究测定1，每L00G鲜食部位含蛋白质2LG、碳水化台物8G、脂肪07G粗纤维15G、胡萝卜素28MG、维生素B005MG、维生素B03LMG，维生素C95MG、烟酸09MG，钙315MG，磷39MG、铁32MG。除了营养方面的价值，费菜还
37、有不菲的药用价值，它含有生物碱、谷甾醇、黄酮类、齐敦果酸、景天庚糖，果糖等药物成分。费菜中的生物碱具有抗肿瘤活性，保护心血管系统，对神经系统具有镇痛和止痛作用，还具有抑菌效果2；谷甾醇能阻止人体对胆固醇的吸收，降血脂，防止血管硬化；黄酮类可扩张心脑血管，促进血液循环；齐墩果酸还可保护肝脏，起到延缓老年性肝组织纤维化的作用，经常服用能有益健康、延年益寿3。费菜几乎无病虫危害，栽培过程不施农药，无污染，无农药残留，是一种绿色食品，受到广大人们的喜爱。费菜主要食用嫩茎叶，无异味。采下洗净可直接素炒，配肉、蛋、食用菌炒，火锅、炖食、清蒸、浇汤，久煮不烂4。费菜药用功能主要有消肿、定痛、止血、化瘀、治吐
38、血、衄血、便血、尿血、崩漏、乳痈、跌打损伤等，也是治疗心脏病的良药。费菜具有群体整齐，颜色鲜绿，覆盖率高，花色鲜艳，花期较长的特点。费菜在栽培过程中不生虫、无病害，这是它的一大优点，能在贫瘠的土壤里长势强壮，所以无需喷洒农药，避免了化肥污染；加之其易种、易管、产量高，一般栽培条件下，每667M2产量可达5000KG以上，所以是园林花坛、草坪绿化难得的好品种，又是农业产业结构调整和发展无公害绿色蔬菜的理想品种之一。家庭栽培几盆费菜，既有药用价值，又能美化环境，净化空气，陶冶情操，增添乐趣5。费菜经萎凋脱水1520，摇青35分钟，渥堆6小时，220240OC杀青56分钟、揉捻、烘干可制得色香味俱佳
39、的方便饮品养心茶6，泡出的茶水色、香、味俱佳，饮用后可高效抑制失眠、心悸、烦闷等症，加糖饮用13味更佳；除降血压外，还可解除酒醉头痛。除主治心脑血管疾病外，而且对吐血、咯血、烦躁失眠、惊悸癔症、跌打损伤有疗效。目前已有很多研究，从不同植物中提取黄酮和生物碱开发不同的产品78。比如竹叶黄酮饮料、啤酒、保健胶囊、抗氧化剂、美容护肤品；银杏黄酮饮料、啤酒、保健胶囊、美容护肤品；大豆异黄酮胶囊；生物碱的镇咳止痛抗肿瘤等。费菜含有大量的黄酮类和生物碱，目前对费菜的研究基本还停留在其药用价值、培养和繁殖阶段，没有对费菜进一步的开发，今后费菜的研究方向可以转向费菜的生物活性成份。2材料与方法21材料与仪器2
40、11材料原料费菜，产于宁波慈溪。试验菌种大肠杆菌ESCHERICHIACOLI；金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS；枯草芽孢杆菌（BACILLUSSUBTILIS）212试剂无水乙醇芦丁芸香叶苷）BR，含量95，国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠分析纯，宜兴市第二化学试剂开发中心；硝酸铝分析纯，天津市永大化学试剂开发中心；氢氧化钠分析纯，杭州高晶精细化工有限公司；三氯乙酸分析纯，国药集团化学试剂有限公司；铁氰化钾分析纯，北京化工厂；三氯化铁分析纯，宜兴市第二化学试剂厂；磷酸二氢钠分析纯，汕头全砂化工厂；磷酸氢二钠分析纯，天津市巨星圣源化学试剂有限公司；硫酸亚铁分析纯，上海展
41、云化工有限公司；抗坏血酸（VC）分析纯，杭州化学试剂有限公司；水杨酸分析纯，国药集团化学试剂有限公司；冰醋酸分析纯，国药集团化学试剂有限公司；无水醋酸钠分析纯，上海试剂四厂；双氧水、盐酸、无水乙醇（均为国产分析纯）；蒸馏水。细菌用营养琼脂培养基BR，成分为蛋白胨10G，牛肉膏3G，氯化钠5G，琼脂20G，取38G加蒸馏水至1000ML，PH7274，国药集团化学试剂有限公司；LB肉汤BR，成份为蛋白胨10G，酵母粉5G，氯化钠5G，葡萄糖1G，取21加蒸馏水至1000ML，中国进出口商品检验技术研究所。213主要仪器电热恒温水浴锅DKS22型，上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发仪SENCOR2
42、01型，上海申顺生物科技有限公司；循环水真空泵SHZD型，巩义市英峪予华仪器厂；湿热灭菌锅电热鼓风干燥箱CS1011AB型，中国重庆银河实验仪器有限公司；酸度计PHS25型，上海理达仪器厂；可见分光光度计7200型，尤尼柯（上海）仪器有限公司；高速台式离心机H1650型，长沙湘仪离心机仪器有限公司；电子天平BP221D型，SARTORIUS。气浴恒温振荡器SHZ82型，金坛市科析仪器有限公司；22实验方法221实验路线实验主要分为三部分，原料准备、抑菌能力和抗氧化能力测定。原料准备包括原料的预处理和费菜提取液粗提取。原料预处理取新鲜费菜叶在70烘干24H，然后用药物粉碎机粉粉碎并过80目筛，得
43、到的叶粉备用，在提取之前将叶粉在105烘干2H左右。费菜提取液粗提取过程910称取5G干粉，置于500ML锥形瓶中，按照料液比150加入浓度为90的乙醇，超声提取50MIN，60水浴浸提6H，趁热抽滤，得到滤液。将粗提液用旋转蒸发仪在4550下浓缩至适量后，加入2倍体积的95乙醇以沉淀多糖，放入冰箱6H，过滤，再将提液用旋转蒸发仪在4550下浓缩至适量后待用。抑菌能力测定包括费菜提取液中黄酮浓度、抑菌圈大小、MIC（最低抑菌浓度）和MBC（最低杀菌浓度）的测定。抗氧化能力测定包括费菜提取液还原力、费菜提取液羟自由基清除率和费菜提取液DPPH清除能力的测定。222测定方法2221费菜提取液中总黄
44、酮浓度测定标准溶液的制备1112。精密称取120干燥至恒重的芦丁90MG，置50ML量瓶中，加30乙醇适量，置水浴上微热使其溶解、冷却，加30乙醇至刻度，摇匀，量取上述试液100ML，置100ML量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀即得标准溶液。每1ML含芦丁0018MG。精密量取上述标准溶液10ML、15ML、20ML、25ML、30ML、35ML，分置25ML量瓶中，各加水至6ML；分别加5NANO2溶液1ML，摇匀，放置6MIN；分别加10ALN033溶液1ML，摇匀，放置6MIN；然后分别加4NAOH溶液10ML，并分别加水至刻度，摇匀，静置15MIN，在510NM测定吸收度，以30乙醇溶
45、液代替芦丁溶液做空白对照。以浓度CMG/ML对吸光度A作标准曲线绘制标准曲线如图1所示。由图1得到回归方程Y12353X00022，R209997。0100102030405060708090001002003004005006007芦丁浓度MG/MLA图1芦丁标准曲线FIG1THESTANDARDCURVEOFRUTIN费菜提取液中总黄酮含量测定。把制得的费菜提取液取1ML稀释100倍，分别吸取05ML、10ML、15ML、20ML、25ML稀释液代替芦丁溶液，按照制作标准曲线相同的方法测吸光值。2222菌种的预处理13首先制作九管无菌的营养琼脂培养基斜面，并标记好菌种和时间，第一天用三管斜
46、面分别接种三种细菌，在37OC培养24H；第二天以培养好的细菌为菌种，分别接种一管，继续在在37OC培养24H；第三天以第二天培养的细菌为菌种，分别接种一管，在在37OC培养24H，备用。在无菌条件下，取一环大肠杆菌放入09的无菌生理盐水中，充分震荡混匀后，制成101的均匀稀释液。大概使菌悬液的浓度为106、107CFU/ML（之前做几次预实验）。领取5支9ML无菌生理盐水试管，分别标记大肠杆菌和102、103、104、105、106。用1ML灭菌移液枪吸取101稀释菌液1ML，沿着管壁徐徐注入标有102试管的灭菌生理盐水中（注意移液枪头不要触及管内稀释液），然后另换1个1ML移液枪头插入10
47、2试管中反复吹吸菌悬液10余次，充分混合均匀（吹吸菌液时不要过猛太快，吸时将枪头插入液面下面一点，吹时将吸管提到接近液面以下），制成102稀释液。按上述操作顺序，制成103、104、105、106系列稀释菌液（每递增稀释一次，即换用一个枪头，否则稀释不准）。2223提取液的抑菌圈测定先将灭菌的营养琼脂培养基融化后，在无菌室中趁热导入无菌平板中，冷却后分别做好标记。用移液枪取106试管中的菌液01ML，对号接种于106的平板中（每个编号设两个重复），再用无菌玻璃涂布棒（用酒精棉擦拭并灼烧灭菌）将菌液涂布均匀，平放于实验台上2030MIN，使菌液渗入培养基内。按照上述方法制作101、104、105
48、菌液的平板，104、105菌液各两个，101菌液6个平板。104、105、106菌液做菌落总数计数用，101菌液做抑菌圈用。把直径为6MM的打孔器（用酒精棉擦拭并在酒精灯上灼烧灭菌），在每个101菌液平板上打3个孔，每个孔之间相差30MM以上，并用无菌镊子（酒精棉擦拭并在酒精灯上灼烧灭菌）把平板上打孔后的琼脂拿掉。取出一个平板，分别在里面的三个孔中注入50L的无菌水、硫酸庆大霉素溶液、费菜提取液，做3个平行。取出另一个平板，分别在里面的三个孔中注入50L的费菜提取液、01山梨酸钾、05山梨酸钾溶液，同样做三个平行。以上操作完后，菌落计数的几个平板倒置于37OC培养箱中培养24H，做抑菌圈的几个
49、平板正放于37OC培养箱中培养24H后观察。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌也做以上相同的操作，但用山梨酸钾做对照的只做大肠杆菌。2224费菜提取液最低抑菌浓度（MIC）的测定1415总黄酮采用二倍稀释法配成各种浓度，其方法取6支试管分别加入2ML液体培养基，2ML提取液于第1支试管中，混匀后取2ML入第2管，然后依次取2ML移入下一管，到笫6管时弃去2ML，即将提取原液1G/ML用提取相应的溶剂按照12、14、18、116、116、132的比例进行倍半稀释，得6个浓度的稀释提取液。在这6管中分别加入01RNL大肠杆菌101菌液，另取7支试管不加菌液作为空白对照。将其放于培养箱中，37培养24H，观察记录澄清不长菌的最高稀释度就是最低抑菌浓度MIC，每个样品设2个平行组，结果以平均值计。金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌也做以上相同的操作。2225费菜提取液最低杀菌浓度（MBC）的测定1617取若干个无菌平皿做好标记，将MIC测定中未生长细菌的肉汤用倾注平板法接种于营养琼脂平板上，37OC培养24H，观察结果，以仍无细菌生长的管内的费菜提取液的浓度，为最低杀菌浓度。2226费菜提取液还原力测定原理18抗氧化剂的还原力与其抗
