1、本科毕业论文系列开题报告食品质量与安全组胺降解菌PSYCHROBACTERSP的生理生化与分子鉴定一、选题的背景与意义在水产品的加工保藏过程中，组胺一经形成，高温、冷冻等加工手段都不能将其分解，因此其控制技术研究主要集中于加工前、加工中及加工后的各种物理、化学及生物保鲜和保藏手段，尽量减少游离氨基酸的生成、抑制腐败微生物的繁殖和蔓延、并规避氨基酸脱羧酶的最适作用条件。在捕捞和运输过程中，应确保酮体尽可能免受机械损伤并保持适宜的冷藏条件。在加工过程中，除常见保鲜措施外，可采用多种手段控制原材料和加工环境的卫生条件，如添加茶多酚可与鱼肉中的相关辅酶金属离子螯合、抑制蛋白酶的分解速度；添加溶菌酶制剂
2、可抑制腐败微生物的生长繁殖；添加葡萄糖氧化酶制剂可通过除氧抑制部分好氧腐败微生物的生长等等。另外，高盐环境可抑制大部分细菌的脱羧反应，而其它常规手段如真空包装、罐装过程的消毒措施等对组胺的抑制或消除并无明显作用。除上述组胺的间接控制技术外，还可开发组胺的微生物降解技术并应用于水产制品的生产过程。应用微生物控制降解技术，可有效的去除水产品中的组胺，具有生物反应的种种优点，如作用条件温和、反应迅速、节约能源、安全可靠等。但是目前对于水产品中组胺的微生物降解技术的研究，仍处于探索阶段。开展微生物组胺降解机制和控制技术的研究，不仅能避免因食用含高组胺水产品而引起的中毒，确保水产品的食用安全，还能促进水
3、产品进出口贸易的发展，是水产品加工行业亟待解决的问题。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1鉴定组胺降解菌的生理生化特征配制生理生化鉴定的培养基，然后按各个鉴定原理对其进行VP试验、组胺降解试验等。2对该组胺降解菌进行分子鉴定将该组胺降解菌的DNA经离心、洗脱等步骤提取出来，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA，然后将目的基因进行PCR扩增，之后将DNA片段回收，最后将回收的DNA进行克隆和测序。3确定该组胺降解菌的属以及可能的种三、研究的方法与技术路线1依据微生物学实验（第4版）教材，对该组胺降解菌的生理生化研究。生理生化特性试验结果糖酵解试验淀粉水解试验甲基乙酞甲醇（VP）试验甲基红（METHYL
4、RED）试验靛基质（IMDOLE）试验硝酸盐（NITRATE）还原试验明胶（GELATIN）液化试验尿素酶（UREASE）试验2按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取目的菌株的基因组DNA，进行PCR扩增，随后采用16SRRNA测序技术将,获得的16SRRNA序列在NCBI上用BLAST软件与GENBANK数据库序列进行对比与同源性比较。四、研究的总体安排与进度2010年11月12月查阅资料，确定试验方案，写开题报告与文献综述。2011年1月2月仪器、实验材料的准备，并翻译两篇外文文献。2011年3月4月对菌株做生理生化以及分子鉴定。2011年5月分析讨论实验结果，整理总结手中资料，完成本科
5、毕业论文。五、主要参考文献1陶志华,佐藤实海水中组胺菌的分离及其理化性质分析J生物技术,2009,19142442沈萍,陈向东微生物学实验（第4版）M高等教育出版社,20073王震,杨媚,杨迎青等广东省柑橘炭疽病病原菌的形态与分子鉴定J菌物学报,2010,2944904924RE布坎南NE吉本斯伯杰细菌鉴定手册（第8版）M北京科学出版社,19847607905龙雯,陈存社16SRRNA测序在细菌菌种鉴定中的应用J北京工商大学学报（自然科学版）,2006,24510126李鹏,马艳娇,赵云16SRRNA、23SRRNA及16S23SRRNA基因在细菌分离与鉴定中的应用J现代畜牧兽医,2008,7
6、49517张彤,方汉平微生物分子生态技术16SRRNA/DNA方法J微生物学通报,2003,30297998刘文海,邓先余,向言词等一株甲胺磷高效降解菌巨大芽孢杆菌BACILLUSMEGATERIUM的分离及其分子鉴定J海洋与湖沼,2009,4021711729张洁,徐桂花,尤丽琴16SRDNA序列分析法鉴定乳酸菌J农产品加工创新版,2009,4474910刘文强,贾玉萍,赵宏坤16SRRNA在细菌分类鉴定研究中的应用J动物医学进展,2006,2711151811李波,郭桐生,崔恩博PCRRFLP技术在布氏菌鉴定与分型中的应用J解放军医学杂志,2010,35324124312宋维娟,程池PCR
7、SSCP技术在假丝酵母属菌种鉴别中的应用J微生物学通报,2009,36691892213满朝新,迟涛,胡博韬等REPPCR指纹图谱技术在乳酸菌鉴定中的应用J中国乳品工业,2010,3854614张根生,李大龙,李志等哈尔滨风干肠中优势蛋白质降解菌筛选及16SRDNA鉴定J食品科学,2010,31118618815赵美玲,鞠文庭,郭军康等黄华属根瘤菌的16SRDNA2RFLP分析J西北植物学报,2008,28468068516周贤轩,杨波,陈新华几种分子生物学方法在菌种鉴定中的应用J生物技术,2004,146353717徐婧,于莉,姜钰等颉颃放线菌XA1菌株分子鉴定及生物学特性研究J生物技术通报
8、,200939039118潘峰,王平,胡正嘉等利用16S23SRDNARFLP及16SRRNA基因序列分析方法对湖北省饭豆VIGNAUMBELLANTAL根瘤菌系统发育的研究J应用于环境生物学报,2007,131788219苏乾莲,黄维义,张为宇等奶牛温氏支原体16SRRNA基因的PCR扩增、克隆及分析J中国兽医寄生虫病,2008,16601520XIAOYANGZHI,LINGLINGYANG,YUNWANG,ECTGENUSSPECIFICPCRFORMOLECULARIDENTIFICATIONOFNOVELISOLATESOFTHEGENUSNESTERENKONIAJACTAMICR
9、OBIOLOGICASINICA,2008,48564464521何亮,熊礼宽,曾忠铭乳杆菌的分类与分子鉴定方法研究进展J中国微生态学杂志,2007,19331231322JOSELB,IGNACIOB,IMANOLRZ,ETALSEQUENCINGOFVARIABLEREGIONSOFTHE16SRRNAGENEFORIDENTIFICATIONOFLACTICACIDBACTERIAISOLATEDFROMTHEINTESTINALMICROBIOTAOFHEALTHYSALMONIDSCOMPIMMUNMICROBIOLINFECTDIS2007,3011111823焦振泉,刘秀梅细菌分
10、类与鉴定的新热点16S23SRDNA间区J微生物学通报,2001,281868824李红,周友兵,陈炳耀等分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用J河北大学学报（自然科学版）,2003,23445145225董慧明,张颖,张德民等DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用J微生物学杂志,2007,271454826卢莉琼,徐亚同,梁俊分子生物方法在微生物多样性及微生物生态研究中的应用J应用于环境生物学报,2004,106826830毕业论文文献综述食品质量与安全组胺降解菌株鉴定方法概述摘要本文根据微生物的普遍鉴定方法，概述了组胺降解菌的的形态特征鉴定方法，生理生化鉴定方法与分子鉴定中的应
11、用16SRRNA和16SRDNA的细菌鉴定方法。关键词组胺；生理生化；分子鉴定0前言由于组胺中毒事件发生频率较高，每次涉及的人数较多，且一些冷冻产品和加工制品被检出组胺含量超标的案例不断上升，所以世界各国对组胺的相关研究一直是近年来水产品行业的研究热点之一。目前，我国的相关研究大多集中在组胺的检测方法的探索以及与组胺相关的鲭鱼中毒的流行性病学报道。比如范青霞、曾艳、李青等分别报道了近年来因食用鲭科鱼类而产生的中毒案例13。另有10多篇文献报道了不同的组胺分析检测方法，如分光光度法、高效液相色谱法，等离子色谱法等47，这些研究主要涉及罐头、鱼粉等不同样品。而国外对组胺的相关研究要进行的深入且全面
12、，包括组胺的萃取、分离、检测分析以及形成机理等各个方面810。相比较而言，各国对组胺的控制降解技术的研究，特别是工业化的脱组胺工艺的研究各国还较为薄弱。组胺一经产生，就很难去除，从而造成巨大经济损失与安全隐患。为防止食物中毒以及经济损失应该从组胺这一源头抓起，所以，组胺降解技术暨微生物降解技术的研究对社会经济与食品安全发展有重大意义。本文根据微生物鉴定通用检测方法，将其运用到组胺降解菌株的鉴定中，综述了组胺降解菌株的几种鉴定方法。1形态观察111211显微观察将适量菌株在载玻片上进行涂布，并令其自然干燥，然后手执载玻片一侧，标本面朝上，在火焰外侧往复34次，待冷却后滴加结晶紫染液，使整个标本固
13、定在染色液中。染色13MIN后，在显微镜观察菌体的形态。12革兰氏染色在干净载玻片上，用接种环挑取少许菌种，于载玻片上无菌水滴边缘涂片，待自然风干后，在火焰外侧往复34次，待冷却后滴加结晶紫染液染色LMIN，然后用水冲净结晶紫液。滴加碘液冲净残水，并覆盖约LMIN。用水冲去碘液，将片上的水甩干。滴加95乙醇液脱色约2030S，并立即用水冲净乙醇。再用蕃红液染12MIN之后洗净蕃红，待玻片风干后用显微镜油镜观察涂片。13芽孢染色取培养24H左右的菌株进行涂片、干燥和固定，然后滴加35滴孔雀绿染液于己固定的涂片上。用木夹夹住载玻片在火焰上加热（使染液冒蒸汽但勿使沸腾）。加热时间从冒蒸汽时开始计时约
14、45MIN。倾去染液，待载玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。再用蕃红水溶液复染LMIN，水洗。待干燥后，置油镜观察。2生理生化鉴定7111221糖酵解试验在无菌操作下，用接种针或环移取菌种少许，接种于葡萄糖发酵液体培养基管中，并在361条件下培养。每天观察培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡（微小气泡亦为产气阳性）。22淀粉水解试验以培养1824H的菌株，涂布接种于淀粉琼脂斜面上，在361培养条件下培养2448H。将碘试剂滴在培养表面上，立即检验结果。若为阳性反应（淀粉被水解），则琼脂培养基呈深蓝色、菌落周围出现无色透明环；若为阴性反应（淀粉未水解），则菌落周围没有透明环。23VP试
15、验将菌株接种于VP试验培养基中，在361培养条件下培养46D。取培养液约2ML和等量的40NAOH溶液混合，加入少量约051MG肌酸，摇动25MIN。阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或361恒温箱中，若2H内仍不显现红色，则为阴性。24甲基红（METHYLRED）试验将菌株接种于通用培养基，培养于361环境中35天。从第二天起，每日取培养液1ML，加甲基红指示剂12滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色（目前发现阳性或至第5天仍为阴性即可判定试验结果）。25靛基质（IMDOLE）试验将菌株接种于试验培养基管中，在361条件下培养24H，取约2ML培养液，加入KOVACS氏试
16、剂23滴，轻摇试管，呈红色为阳性。26硝酸盐（NITRATE）还原试验在试验前将试剂的A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B（萘胺乙醇溶液）试液各02ML等量混合，取混合试剂约01ML，加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10MIN内呈现红色即为试验阳性；若无红色可再加一滴二苯胺试剂，如呈蓝色则无硝酸盐还原作用，否则按硝酸盐还原阳性处理。27明胶（GELATIN）液化试验将菌接种于明胶明胶高层约2/3深度或点种于平板养基中，在2022条件下培养714D。再放入4冰箱中，观察培养基还能不能凝固，若不能凝固，则明胶被液化，呈阳性；能凝固即明胶未被液化，呈阴性。28尿素酶（UREASE）试验将培养182
17、4H的菌种大量接种于液体培养基管中并摇匀，在361条件下分别培养10，60和120MIN，并观察结果。若呈粉红色，则为阳性；若显阴性应继续培养4天，然后作最终判定，变为粉红色为阳性，反之为阴性。3分子鉴定14273116SRRNA测序技术按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取目的菌株的基因组DNA，然后在PCR反应体系内进行PCR扩增。目的基因经回收纯化后，进行测序。获得的16SRRNA序列在NCBI上用BLAST软件与GENBANK数据库序列进行对比与同源性比较。3216SRDNA序列分析法按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取目的菌株的基因组DNA，然后在PCR反应体系内进行PCR扩增
18、。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后回收纯化，进行测序。获得的16SRDNA序列在NCBI上用BLAST软件与GENBANK数据库序列进行对比与同源性比较。4小结近年来对微生物的研究技术在快速、微量、精确的程度上越来越优越。我们在运用不同鉴定方法的同时，不能单一运用一种或片面的鉴定方法，要将微生物的培养条件、镜检特征、生理生化和分子鉴定相结合，才能完整的说明该类微生物的生物学特征。这样，我们的研究才会更有意义，科学的发展才更严谨与快速。参考文献1范青霞,孔亚明,马洪喜一起因食用鲭鱼引起的组胺过敏慢性食物中毒J医学动物防制,2006,2242952962曾艳,周朝虹58例扁舵鲣鱼所致组胺中毒的急救J中
19、国热带医学,2009,047047053李青一起变质鲐鱼引起组胺中毒的调查分析J中国社区医师综合版,2007,232594赵新颖,焦霞,夏敏等离子色谱法同时测定水源水中的五种生物胺J色谱,2009,2745055085朱文慧,周德庆分光光度法测定鱼罐头中组胺的方法改进J食品科学,2008,1223225,2296黄新华,陈本美,梁绍先,等高效液相色谱法测定生物组织中的组胺J分析化学简报,2000,2878658677陶志华,佐藤实海水中组胺菌的分离及其理化性质分析J生物技术,2009,19142448DRIOUICHR,TAKAYANAGIT,OSHIMAM,ETCSEPARATIONANDD
20、ETERMINATIONOFNALKYLAMINESANDHISTAMINEBYCAPILLARYZONEELECTROPHORESISUSINGSALICYLALDEHYDE5SULFONATEASADERIVATIZINGREAGENTJJOURNALOFCHROMATOGRAPHYA,2001934951039LOPEZSABATEREI,RODRIGUEZJERESJJ,HERNADEZHERREROM,ETCINCIDENCEOFHISTAMINEFORMINGBACTERIAANDHISTAMINECONTENTINSCOMBROIDFISHSPECIESFROMRETAILMAR
21、KETSINTHEBARCELONAAREAJINTERNATIONALJOURNALOFFOODMICROBIOLOGY,1996,2841141810KUDAT,MIHARAT,YANOTDETECTIONOFHISTAMINEANDHISTAMINERELATEDBACTERIAINWSHNUKAZUKE,ASALTEDANDFERMENTEDWSHWITHRICEBRAN,BYSIMPLECOLORIMETRICMICROPLATEASSAYJFOODCONTROL,20071867768111沈萍,陈向东微生物学实验（第4版）M高等教育出版社,200712RE布坎南NE吉本斯伯杰细菌
22、鉴定手册（第8版）M北京科学出版社,198476079013龙雯,陈存社16SRRNA测序在细菌菌种鉴定中的应用J北京工商大学学报（自然科学版）,2006,245101214李鹏,马艳娇,赵云16SRRNA、23SRRNA及16S23SRRNA基因在细菌分离与鉴定中的应用J现代畜牧兽医,2008,7495115宋维娟,程池PCRSSCP技术在假丝酵母属菌种鉴别中的应用J微生物学通报,2009,36691892216满朝新,迟涛,胡博韬等REPPCR指纹图谱技术在乳酸菌鉴定中的应用J中国乳品工业,2010,3854617张根生,李大龙,李志等哈尔滨风干肠中优势蛋白质降解菌筛选及16SRDNA鉴定
23、J食品科学,2010,31118618818张彤,方汉平微生物分子生态技术16SRRNA/DNA方法J微生物学通报,2003,302979919刘文海,邓先余,向言词等一株甲胺磷高效降解菌巨大芽孢杆菌BACILLUSMEGATERIUM的分离及其分子鉴定J海洋与湖沼,2009,40217117220苏乾莲,黄维义,张为宇等奶牛温氏支原体16SRRNA基因的PCR扩增、克隆及分析J中国兽医寄生虫病,2008,16601521XIAOYANGZHI,LINGLINGYANG,YUNWANG,ECTGENUSSPECIFICPCRFORMOLECULARIDENTIFICATIONOFNOVELIS
24、OLATESOFTHEGENUSNESTERENKONIAJACTAMICROBIOLOGICASINICA,2008,48564464522KUDAT,MIHARATREDUCTIONOFHISTAMINEINFISHSAUCESBYRICEBRANNUKAJFOODCONTROL,2010,21101322132623JOSELB,IGNACIOB,IMANOLRZ,ETALSEQUENCINGOFVARIABLEREGIONSOFTHE16SRRNAGENEFORIDENTIFICATIONOFLACTICACIDBACTERIAISOLATEDFROMTHEINTESTINALMICR
25、OBIOTAOFHEALTHYSALMONIDSCOMPIMMUNMICROBIOLINFECTDIS2007,3011111824焦振泉,刘秀梅细菌分类与鉴定的新热点16S23SRDNA间区J微生物学通报,2001,281868825李红,周友兵,陈炳耀等分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用J河北大学学报（自然科学版）,2003,23445145226董慧明,张颖,张德民等DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用J微生物学杂志,2007,271454827卢莉琼,徐亚同,梁俊分子生物方法在微生物多样性及微生物生态研究中的应用J应用于环境生物学报,2004,106826830本科毕
26、业设计（20_届）组胺降解菌PSYCHROBACTERSP的生理生化与分子鉴定目录0引言11材料与方法111实验材料1111菌株来源2112培养基2113实验试剂3114实验主要仪器4115其他412实验方法4121生长曲线和产酶曲线绘制4122形态鉴定革兰氏染色5123生理生化鉴定5124分子鉴定62结果与讨论921形态特征922生长曲线与产酶曲线特征923生理生化特征10231生长条件实验10232生化鉴定结果1224分子鉴定结果13241DNA提取结果13242基因克隆检测结果14243目的基因测序结果14244经BLAST序列比对绘制系统发生树143结论15致谢错误未定义书签。参考文献
27、15附录16摘要组胺是生物产生的一种生物胺，存在于多种食物中，尤其是富含组氨酸的鱼类中，如金枪鱼和鲭鱼。组胺中毒事件频发，给人类健康和社会经济效益带来很多危害。为了降低鱼类食品组胺含量过高危险，提供食品加工业组胺降解菌候选菌株，本文对实验室筛选得到的组胺降解菌株进行了生理生化以及分子鉴定。此菌株为革兰氏阴性细菌，ZOBELL2216E培养基平板培养菌落呈黄色、圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，光学显微镜检下菌株为直杆状，无芽孢生成。经生理生化鉴定该组胺降解菌为嗜温、中度嗜盐、中性、需氧异养型微生物。不能分解明胶，亦不能水解淀粉。氧化发酵实验中，可利用葡萄糖产酸但不产气，不能利用甘露醇、肌醇、山梨醇
28、、鼠李糖、蔗糖、密二糖、阿拉伯糖和苦杏仁苷。可利用柠檬酸盐，硝酸盐还原阳性，硫代硫酸钠为阴性。可利用精氨酸，不能利用赖氨酸、鸟氨酸和脲素。MR阴性，VP阴性，过氧化氢酶阳性。经分子鉴定该组胺降解菌属于PSYCHROBACTERSP并与PSYCHROBACTERCIBARIUS亲缘关系最近。关键词组胺降解菌；生理生化鉴定；分子鉴定ABSTRACTHISTAMINEISABIOGENICAMINETHATOCCURS,TOVARIOUSDEGREES,INMANYFOODS,PARTICULARLYINHISTIDINERICHFISHES,SUCHASTUNAANDMACKERELNOTONLY
29、ISHISTAMINETOXICITYTOHARMHEALTH,BUTALSOISHARMFULTOSOCIALECONOMICBENEFITSINORDERTOREDUCETHEHISTAMINEQUANTITYOFTHEFISHANDPROVIDEFOODPROCESSINGINDUSTRYWITHHISTAMINEREDUCINGBACTERIALSTRAINS,THEPAPERONTHEPRODUCTIONOFAMYLASE,HISTAMINEREDUCINGBACTERIALSTRAIN,WEREBIOCHEMISTRYANDMOLECULEIDENTIFIEDTHECELLSOFT
30、HEHISTAMINEREDUCINGBACTERIALSTRAINAREGRAMNEGATIVEZOBELL2216ECOLONYISYELLOWANDROUND,ANDTHESURFACEOFTHESTRAINISMOISTANDSMOOTHWHATSMORE,THEEDGEISNEATTHESHAPEOFSINGLECELLISPOLEANDHASNOENDOSPOREUNDERTHELIGHTMICROSCOPEBYDOINGBIOCHEMISTRYIDENTIFICATION,WECANKNOWTHESTRAINISWILLGROWVERYWELLINAWARM,SALTY,OXYG
31、ENOUSANDNEUTRALCONDITIONINADDITION,WECANSEETHESTRAINCOULDMAKEUSEOFGLUCOSETOPRODUCEACIDBUTGAS,BUTITCANNOTUSEMANNITOL,INOSITOL,SORBITOL,RATLEESUGAR,SUCROSE,DENSETWOSUGAR,ARABORAMYGDALINGELATINTESTANDSTARCHTESTARENEGATIVEBUTCATALASETEST,THEUSEOFCITRATETESTANDNITRATEREDUCTIONTESTAREPOSITIVE,YETSODIUMTHI
32、OSULFATEISNEGTIVETHEBACTERIACANAVAILABLEUSEARGININEBUTCANNOTUSELYSINE,ORNITHINEORTHIOUREAONTHECONTRARY,THEMRANDVPISNEGATIVEMOREOVER,THROUGHTHEMOLECULEIDENTIFICATION,WECANSURETHESTRAINBELONGSTOPSYCHROBACTERSPANDISTHECLOSESTRELATIONSHIPWITHPSYCHROBACTERCIBARIUSKEYWORDSHISTAMINEREDUCINGBACTERIALSTRAINB
33、IOCHEMISTRYIDENTIFICATIONMOLECULEIDENTIFICATION10引言组胺（HISTAMINE，2咪唑基乙胺）是生物产生的一种生物胺，存在于多种食物中，尤其是富含组氨酸的鱼类中，如金枪鱼和鲭鱼，也存在于发酵食品中，如发酵香肠、奶酪、红酒、味噌和发酵咸鱼中。健康人类食物中摄取的组胺可被胺氧化酶迅速分解，但是个别胺氧化酶活性低的人会引发组胺中毒。由于二胺氧化酶活性的降低和过量的组胺使组胺降解活性降低，引起众多类似过敏症状的反应。组胺中毒是食品安全事故中高频的事故，并且涉及的人数较多。除此之外一些加工制品组胺含量超标的案例也屡见不鲜，与此同时，组胺在水产品行业的研究一
34、直是热点。目前，我国关于组胺的检测方法的和鲭鱼中组胺中毒的流行性病学等方面已有相关报道。譬如曾艳、范青霞、李青等人分别报道了近年来因食用鲭鱼类而的中毒的案例13。还有多篇文献报道了分析检测组胺的多种方法，这些研究主要涉及腌制、鱼粉等不同的样品47。国外对组胺的相关研究包括组胺的萃取、分离、检测、分析和形成机理等方面8。在水产品生产储藏过程中组胺一经形成，一般加工手段不能将其分解，所以其控制技术的研究主要在加工前、中、后的过程中物理、化学和生物保藏手段。通过抑制腐败微生物的生长和繁殖，尽量减少游离氨基酸的生成，并避免形成氨基酸脱羧酶的最适反应条件来尽量避免组胺的生成。如添加溶菌酶制剂可抑制腐败微
35、生物的生长繁殖，添加茶多酚可与鱼肉中的相关辅酶金属离子螯合抑制蛋白酶的分解速度，添加葡萄糖氧化酶制剂通过除氧抑制部分好氧腐败微生物的生长等8。此外，高盐环境可抑制大部分细菌的脱羧反应，而其它常规手段如罐装、真空包装过程的消毒等措施对组胺的抑制或去除并无明显作用9,10。除上述组胺的间接控制技术外，还可以应用组胺的微生物降解技术，并将其应用于水产制品的生产过程。组胺降解酶类主要有组胺氧化酶和组胺脱氢酶，其中，组胺氧化酶可催化组胺氧化生成醛，而组胺脱氢酶可催化组胺在氧化脱氢的同时脱去氨基生成咪唑乙醛。组胺氧化酶在高等生物体中较丰富，也存在于植物组织和微生物中。目前，从水产品及其它自然界来源分离到一
36、些具有组胺降解潜力的菌株，如WANAPORN等从腌制水产品中分离到1株产组胺氧化酶的嗜盐古细菌（NATRINEMAGARIBCC24369），DAPKEVICIUS等从鱼下脚料青贮饲料中分离筛选到5株产组胺氧化酶的乳酸菌（LACTICACIDBACTERIA），RENATA等从各种发酵食品菌群中筛选到具有组胺氧化酶活力的多个菌株，包括27株乳酸菌、17株微球菌（MICROCOCCUSSP）和21株扩展短杆菌BREVIBACTERIUMLINENS等11,12。利用微生物来控制水产品中的组胺含量，具有生物反应的一般优点，如作用条件温和、反应迅速、安全可靠、节约能源等。浙江省是中国沿海省区，海产品
37、资源丰富，拥有众多的涉渔企业，除了发酵水产制品外，多年来的水产品进场交易量、交易额、海洋渔业产值和出口额等均居全国前列。以水产品加工与出口较多地区宁波和舟山区域为例，累计水产加工企业达330多家，出口水产品贸易额2008年为418亿美元。组胺问题的存在，对各种系列水产制品，特别是低值鱼加工利用产品、青皮红肉鱼为加工原料的产品、包括发酵水产品，均有一定程度的经济上的负面影响。譬如宁波当地以易产生高含量组氨的马鲛鱼和鲐鯵鱼为原料生产的产品，因为组胺含量超标而被禁止出口的产品每年都多达五六批次。可见，微生物组胺降解机制和控制技术的研究，不仅能避免含组胺水产品引起的食物中毒，从而确保水产品的食用安全，
38、还能促进水产品进出口贸易的发展，是我省乃至整个水产品加工行业亟待解决的问题。本文对实验室筛选出的具有降解组胺能力的菌株进行形态鉴定、生理生化鉴定和分子鉴定13，为食品生产工业降低组胺含量等技术提供候选菌株。1材料与方法11实验材料2111菌株来源从鲭鱼皮肉样品中实验室筛选T6菌株、保藏。112培养基1121ZOBELL2216E培养基（G/L）蛋白胨50G酵母膏10G磷酸铁001G蒸馏水1000MLNACL25G琼脂16G最终调节PH7002，121灭菌20MIN；1122生理生化鉴定培养基二、明胶水解实验培养基明胶12G蛋白胨05G生理盐水100ML最终调节PH7274，分装到试管中，每管装
39、45CM高培养基，121灭菌20MIN；（2）淀粉水解实验培养基可溶性淀粉02G蛋白胨LG牛肉膏03GNACL05G生理盐水100M1最终调节PH7274，固体培养基加琼脂15G，121灭菌20MIN，然后倒平板；（3）葡萄糖的氧化发酵实验培养基葡萄糖LG蛋白胨02G琼脂06GKH2PO4002GNACL05GL溴百里酚蓝水溶液03ML生理盐水100ML最终调节PH6870，分装于试管中，121灭菌20MIN后备用，溴百里酚蓝溶液先用少量95乙醇溶解，然后加水配成1浓度溶液；（4）柠檬酸盐培养基柠檬酸钠02G琼脂2GMGS047H20002GNH4H2P040LGKH2PO43H2001GNA
40、CL05GL溴百里酚蓝水溶液1ML生理盐水100ML以上成分除指示剂外加热溶解，调节PH6869，再加入指示剂，培养基分装试管，121灭菌20MIN后摆成斜面，溴百里酚蓝先用少量95乙醇溶解后再加水配成1浓度；（5）硝酸盐还原实验培养基KNO301G蛋白胨LG牛肉膏03GNACL05G生理盐水100ML最终调节PH7274，分装于试管中，121灭菌20MIN；（6）甲基红MR实验和VP实验培养基葡萄糖05G蛋白胨05GNACL05G生理盐水100ML最终调节PH7072，分装于试管中，每管装45CM高液体，121灭菌20MIN。1123分子鉴定培养基（1）LB液体培养基酵母膏15G蛋白胨075
41、GNACL075G3蒸馏水150ML最终调节PH70，121灭菌20MIN；（2）LB固体培养基酵母膏15G蛋白胨075GNACL075G蒸馏水150ML琼脂粉24G最终调节PH70，121灭菌20MIN；（3）含氨苄青霉素的LB固体培养基酵母膏15G蛋白胨075GNACL075G蒸馏水150ML琼脂粉24G100G/MLAMP100L最终调节PH70，121灭菌20MIN。113实验试剂1131形态鉴定用溶液（1）革兰氏染色结晶紫染液；卢戈氏（LUGOL）碘液；95乙醇溶液；番红复染液14。（2）调PH所用的酸碱溶液1MOL/L的盐酸溶液；01MOL/L的盐酸溶液；1MOL/L的氢氧化钠溶液
42、；01MOL/L的氢氧化钠溶液。1132组胺浓度测定用溶液组胺二盐酸盐HAAR,美国SIGMA公司；OPAAR,国药集团化学试剂有限公司；甲醇AR,西安化学试剂厂；其他试剂均为分析纯；所用水均为MILLIPORE去离子水。1133分子鉴定用溶液（1）DNA提取试剂细菌基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN公司，中国）。（2）琼脂糖凝胶电泳试剂1）LDNA/HINDIII分子量标准2）40MMOL/LTRIS乙酸1MOL/L3）溴酚蓝指示剂点样缓冲液4）琼脂糖5）1MG/ML溴化乙锭溶液（EB）6）TAE电泳缓冲液571ML冰醋酸，242GTRIS碱，10ML05MOL/LEDTAPH80，用蒸
43、馏水定容至5000ML。（3）PCR扩增试剂引物16SF53AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物16SR53CCGTCAATTCCTTTRAGTTT；模板DNA，TAQ聚合酶（25U/L，TAKARA公司，日本），MG2，4DNTP，10缓冲液，T1THERMALCYCLER（BIOMETRA，德国），无菌双蒸馏水。（4）DNA割胶回收试剂琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN公司，中国）（5）感受态细胞制备试剂4100ML01MOL/LCACL2溶液称取11G无水CACL2，溶于蒸馏水定容至100ML，装于250ML三角瓶中。（6）DNA克隆试剂PLASMIDMINIPREPK
44、ITI（OMEGABIOTEK公司）、PMD19TVECTOR（TAKARA公司，日本）114实验主要仪器AB204S型分析电子天平广州君达仪器公司CARY100紫外/可见分光光度计美国瓦里安公司立体式压力蒸汽灭菌器上海中安医疗器械厂HWS智能型恒温恒湿培养箱宁波江南仪器厂F95荧光分光光度计上海合利仪器有限公司PN2123XB恒温培养摇床上海智城分析仪器制造有限公司HH3数显恒温水浴锅金坛市大地自动化仪器场DHG9070A型电热恒温鼓风干燥箱宁波江南仪器厂ANKETDL802B离心机上海安亭科学仪器厂115其他烧杯；玻璃棒；电炉；培养皿；试管；锥形瓶；量筒；接种环；试管架；离心管；冰箱；光学
45、显微镜；酒精灯；PHS2C酸度计；计时器；移液枪（1L、10L、100L、200L、1000L、1ML）；枪头（10L、200L、1000L、1ML）；DYCZ28A型水平电泳槽；DDY1118型电泳仪；小型EP管离心机；微波炉；透射紫外观察仪；无菌操作台。12实验方法121生长曲线和产酶曲线绘制摇瓶发酵培养基中（250ML三角瓶中装入50ML），以2的接种量接种，28摇瓶培养，120R/MIN，每隔6小时取样3ML，立即放入冰箱中贮存。用未接种的培养基作空白对照，各样品取05ML加25ML蒸馏水混匀后，620NM波长下比浊测定15。从最早取出的培养液开始依次测定，根据菌液的浊度来判断菌体的生
46、物量。同时测定发酵液中组胺降解酶活力。1211组胺测定方法组胺荧光检测法（参照AOAC97713）配制901106MOL/L组胺二盐酸盐（HA）标准溶液相当于167G/ML,取1MLHA,加01MOL/LHCL1ML,然后加入04MOL/LNAOH溶液05ML,混匀后立即加入01OPA甲醇溶液01ML,混匀置室温下反应10MIN,加05ML05MOL/LHCL终止反应。所得反应产物置于荧光分光光度计中进行测定激发波长和发射波长分别为347NM和442NM。溶液配制方法1HA标准溶液贮备液1000G/ML。无碱性。准确称取约1691MG组胺2HCL98于100ML容量瓶中，用01MHCL溶解并稀
47、释到刻度，每周新配。2中间溶液10G/ML。吸取1ML贮备液放进100ML容量瓶，用01MHCL稀释到刻度，每周新配。3工作溶液01、02、03、05、10、15G/M1。吸取1、2、3、5、10、15ML中间溶液，分别于100ML容量瓶中，各用01MHCL稀释至刻度，每天新配。1212组胺降解酶活力测定取1MLHA溶液于试管中，加入05ML菌液与05ML无菌水，混匀。空白对照用05ML无菌培养基代替试验组菌液，混匀。30水浴加热1015MIN后，加01MOL/LHCL1ML,然后加入04MOL/LNAOH溶液05ML,混匀后立即加入01OPA甲醇溶液01ML,混匀置室温下反应10MIN,加0
48、5ML05MOL/LHCL终止反应。所得反应产物置于荧光分光光度计中进行测定激发波长和发射波长分别为347NM和442NM。酶活单位定义为5每毫升发酵液使上述反应液在LMIN内组胺减少1G所含的酶的量为一个酶活单位EA,U/ML。酶活力U/MLOD13291N/（01697T）式中OD422NM荧光值的变化T反应时间MINN发酵液稀释倍数122形态鉴定革兰氏染色（1）制片取一洁净载玻片，用滴管滴一滴无菌水，用接种环挑取少量6号菌株的菌苔，于水滴边缘轻轻，自然风干，干燥和固定。（2）初染滴加草酸铵结晶紫染液覆盖涂菌部位，染色12分钟后倾去染液，水洗至流出水无色。（3）媒染用卢戈氏碘液冲去残留水迹
49、，再用碘液覆盖约1分钟，倾去碘液，水洗至流出水无色。（4）脱色用吸水纸将载玻片上的残留水吸去，滴加95乙醇液脱色约2030S，当流出液无色时立即用水冲净乙醇。（5）复染用吸水纸将载玻片上的残留水吸去，用蕃红液染12分钟，水洗去蕃红，吸去水风干。（6）镜检用显微镜油镜观察涂片，菌体呈蓝紫色为革兰氏染色阳性，呈红色为革兰氏染色阴性。123生理生化鉴定1231生长条件试验（1）温度分别挑取一环新鲜斜面种子，接种至斜面，分别在5、10、20、30、40、50下培养2D。（2）氧气ZOBELL2216E培养基（0205的琼脂），用接种针挑取新鲜斜面种子穿刺接种，27培养2D。（3）PH挑取一环新鲜斜面种子，接入液体种子培养基中（20ML/100ML三角瓶）。28，160R/MIN培养24H，取05ML种子液接入PH值分别为4、5、6、7、8、9、10的摇瓶发酵培养基中（30ML/250ML三角瓶）。28，160R/MIN培养24H后。取样05ML，加25ML蒸馏水混匀后于620NM下比色。（4）盐度挑取一环新鲜斜面种子，接入液体种子培养基中（20ML/100ML三角瓶）。28，160R/MIN培养24H，取05ML种子液接入NACL浓度分别为0、1、2、3、4、5、6
