1、本科毕业论文系列开题报告生物技术三疣梭子蟹球状病毒的纯化与人工感染一、选题的背景与意义三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS隶属于甲壳纲CRUSTACEA、十足目DECAPODA、梭子蟹科PORTUNIDAE，广泛分布于我国沿海，是一种经济价值较高的大型海产经济蟹类。三疣梭子蟹肉味鲜美，营养丰富，是人们极为喜爱的水产品，同时也是重要的出口创汇品种，已逐渐成为我国海水养殖的主导品种之一。目前,我国沿海各省均开展了三疣梭子蟹人工养殖,尤其浙江省沿海地区养殖发展迅速，舟山市一带短短几年就发展成了全国闻名的梭子蟹养殖基地。随着三疣梭子蟹养殖业的快速发展，养殖规模不断扩大，养殖密度不断
2、增加，而又因其受海洋环境污染、养殖生产自身带来的污染、养殖技术等多方面的原因制约，三疣梭子蟹的养殖过程中病害问题也日趋突出。各种疾病的发病率和危害程度有逐年上升的趋势，并呈现出大规模发生和暴发性流行的趋势。不但提高了水产养殖的投入产出比，危害水产养殖业者的经济利益，且由于对病原不了解而盲目用物，导致药物滥用，打击了消费信心，影响到出口内销，严重困扰着梭子蟹水产养殖业的健康发展。另外由于一些虾蟹综合养殖的推广，一些广宿主病毒如白斑综合症杆状病毒等也成为侵害三疣梭子蟹的病原体。三疣梭子蟹产业化人工养殖中，病害防治是最重要的环节，是核心问题，而这恰恰是目前最薄弱环节。而蟹类病毒性病原研究更是极其薄弱
3、。国内外已报道的蟹类病毒有类呼肠孤病毒、微核糖核酸病毒、蓝蟹疱疹病毒、蓝蟹螺旋病毒、河蟹颤抖病毒及锯缘青蟹杆状病毒等。对蟹类病毒的研究多集中在形态观察水平上，尚未进行分子鉴定及灵敏检测方法构建。国内外有关三疣梭子蟹病毒研究的文献极少，对三疣梭子蟹病毒的病原和病理研究也尚不深入。其中以对虾白斑症病毒（WSSV）研究相对透彻白斑综合症病毒WHITESPOTSYNDROMEVIRUS,WSSV是对虾白斑综合症的病原体,同时也是导致三疣梭子蟹大量死亡的主要传染性病毒之一，具有宿主范围广、传播快、感染后死亡率高等特点，国内一些研究所通过实时荧光定量PCR测定试验蟹体内各器官中WSSV含量,病理切片观察濒
4、死蟹各器官组织病理改变的方法，对WSSV进行了系统的研究。近年来，梭子蟹养殖中大规模爆发性死亡现象的时有发生，至今还未得到微生物学、分子生物学、免疫学的明确鉴定。此类不明病害严重威胁着我国梭子蟹蟹类养殖业。通过对宁海三疣梭子蟹发生秋季大规模死亡样品的病理观察，发现组织细胞中存在大量球状病毒。我们拟对人工养殖过程中的三疣梭子蟹秋季大量死亡的病样进行病毒纯化，对纯化的病毒进行形态观察，并用病毒对健康蟹进行人工感染研究，以期为三疣梭子蟹病毒病害快速诊断、防治提供理论与技术支撑。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容1建立由三疣梭子蟹感染组织纯化球状病毒的技术方法A采集患病三疣梭子蟹B研制
5、合适的缓冲液C将病样在缓冲液中匀浆，后建立多步骤差速离心纯化病毒的技术，摸索、优化纯化条件D对纯化的病毒进行负染、电镜观察其形态特征2三疣梭子蟹球状病毒的人工感染研究A由病样粗提病毒，细菌滤器过滤后，注射健康梭子蟹，观察感染、死亡情况B对人工感染发病的梭子蟹，抽样解剖、固定后制作超薄切片电镜观察。拟解决的主要问题1建立由三疣梭子蟹感染组织纯化球状病毒的技术方法2确定三疣梭子蟹球状病毒的致病力三、研究的方法与技术路线1采集发病梭子蟹，在缓冲液中匀浆，差速离心纯化病毒，对纯化的病毒进行负染、电镜观察，重复实验，摸索、优化相关纯化条件。2由发病梭子蟹粗提病毒，细菌滤器过滤后，注射健康梭子蟹，观察、记
6、录其感染、死亡情况。对人工感染发病的梭子蟹，抽样解剖、固定后制作超薄切片电镜观察判断其细胞中是否存在相应病毒。研究技术路线四、研究的总体安排与进度201011201012查阅文献，撰写开题报告和综述，熟悉实验操作；201012201101翻译二篇外文文献；201101201102样品采集，病毒纯化；201102201104人工感染三疣梭子蟹，对发病的三疣梭子蟹组织切片后电镜观察；201104201105实验数据的整理、分析，撰写论文，结题、答辩。五、主要参考文献1阎斌伦，梁利国，张晓君三疣梭子蟹主要病害研究进展J水产科技情报，2010129372KAZUOMOMOYAMA，MIDORIHIRA
7、OKA，VENEGASETALPATHOGENICITYOFPENAEIDRODSHAPEDDNAVIRUSPRDVTOJUVENILESOFSIXCRUSTACEANSPECIESC4SYMPONDISEASESINASIANAQUACULTUREDAAIV，CEBU取病样匀浆差速离心纯化病毒细菌滤器过滤用滤过液人工感染健康蟹，观察发病死亡情况对纯化的病毒负染人工感染发病的组织制作超薄切片统计分析电镜下观察病毒形态电镜下观察病毒感染情况，确定其致病力CITYPHILIPPINES1999，2226NOV3肖国华，赵春龙，崔兆进三疣梭子蟹人工育苗及养成病害发生的主要原因及防治方法J齐鲁渔业，2
8、006，23336374王亚维三疣梭子蟹人工育苗中丝状菌病和粘污病的防治M养殖技术，20062415MONTANIEH，BONAMIJR，COMPSMIRIDOLIKEVIRUSINFECTIONINTHECRABMACROPIPUSDEPURATORLCRUSTACEA,DECAPODAJJINVERTEBRPATHOL，1993，613203226王光宇三疣梭子蟹的健康养殖和白斑病毒病的防治J水产科技情报，2005，3252212227王忠发，王志铮，许文军虾蟹混养塘中WSSV对三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS致死效应的定量研究J海洋与湖沼，2008，2184189
9、8MARIJ，BONAMIJRPC84，APARVOLIKEVIRUSFROMTHECRABCARCINUSMEDITERRANEUSPATHOLOGICALASPECTS，ULTRASTRUCTUREOFTHEAGENT，ANDFIRSTBIOCHEMICALCHARACTERIZATIONJJINBERTEBRPATHOL，1988511451569徐国成，阎斌伦，徐加涛虾蟹拟阿脑虫病的防治研究M水利渔业，200626959710施慧，许文军，徐汉祥三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫PCR检测方法的建立J上海水产大学学报，200817283311王希升，曹建亭，李欣，等才女虫对三疣梭子蟹育苗的影响M
10、齐鲁渔业200828444512王建平，余晓巍，周志强，等宁波市三疣梭子蟹主要病害流行特征及应对措施M河北渔业20O89495313赵春民三疣梭子蟹亲蟹培育过程中“掉腿病”的防治J科学养鱼，200845214何伟贤三疣梭子蟹鳃病的病因与防治J渔业现代化，20034242515丁朋晓，张连英养殖蟹类病害的研究进展M畜牧与饲料科学，201031333516王高学，黄增荣，顾忠旗三疣梭子蟹“牛奶病”的流行病学调查与防治技术上M科学养鱼，200728317王国良，金珊，李政，等三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS乳化病的组织病理和超微病理研究J海洋科学，2006，43718陈寅儿，
11、王国良，金珊，等三疣梭子蟹肌肉乳化病的同工酶病理变化研究M海洋科学，200832363919许文军，徐汉祥，施慧，等梭子蟹假丝酵母菌病初步研究M水产学报，20052983183620许文军，徐汉祥，施慧三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUSMIERS血卵涡鞭虫病诊断与综合防治措施M现代渔业信息，2006，211121王广成，赵炳然，王权，等对越冬期三疣梭子蟹拟阿脑虫病的初步研究J齐鲁渔业，2005，223333422陈寅儿，王国良，金珊，等梭子蟹乳化病病原菌联合药敏实验M水利渔业，200626131523王世党，周维武，宋宗岩，等文登市中国对虾白斑病发病监测及分析J齐鲁渔业，
12、2002191024侯传宝梭子蟹育苗中“红圈病”防治初探M渔业致富指南，200724125许文军，徐汉祥，金海卫梭子蟹“乳化病”病原的研究J浙江海洋学院学报，200322209213毕业论文文献综述生物技术三疣梭子蟹病害研究进展摘要综述了蟹类中常见的病害种类及其危害，包括细菌类疾病，真菌类疾病，病毒类疾病，寄生虫疾病。对蟹类病害的防治进行了探讨。关键词蟹类；病害；研究方法；防治三疣梭子蟹PONUNUSTRITUBERCULATUS隶属于甲壳纲CRUSTACEA，十足目DECAPODA，梭子蟹科PORTUNIDAE，梭子蟹属PORTUNUS，是一种重要的海洋经济蟹类1。三疣梭子蟹肉味鲜美，营养丰
13、富，是人们极为喜爱的水产品，同时也是重要的出口创汇品种，已逐渐成为我国海水养殖的主导品种之一。随着三疣梭子蟹养殖业的快速发展，养殖规模不断扩大，养殖密度不断增加，同时由于海洋环境污染、养殖生产自身带来的污染以及养殖技术制约等多方面的原因，三疣梭子蟹的养殖过程中病害问题日趋突出。各种疾病的发病率和危害程度有逐年上升的趋势，并呈现出大规模发生和暴发性流行的势态。各种疾病的爆发引起了研究者们的关注，许多梭子蟹疾病的病症和病原得到了分析和鉴定，对三疣梭子蟹疾病的预防和治疗的研究提供了积极、有效的指导，本文将对目前为止三疣梭子蟹主要病害及研究现状进行综述，旨在为海水养殖蟹类病害的防治提供科学依据。1三疣
14、梭子蟹病害三疣梭子蟹的常见疾病可分为细菌类疾病，真菌类疾病，病毒类疾病，寄生虫疾病。11细菌类疾病111弧菌病由鳗弧菌，副溶血弧菌及溶藻弧菌引起的弧菌病。大多数弧菌为条件致病菌，当环境污染，水质恶化，弧菌大量繁殖达到一定数量时，体质弱或受伤的梭子蟹易发生弧菌病。丝状细菌病的病原体为毛霉亮发菌，菌体为头发丝状，不分枝，基部略粗，顶端稍细，长度一般几微米到1以上，菌丝一般为透明无色。主要附着在抱卵蟹的受精卵表面及蚤状幼体的鳃，附肢，体表2。112发光病病原体为萤光假单胞和亮弧菌等发光细菌引起的发光病。主要危害蚤状幼体的各个时期，幼体感染此病后会陆续死亡，严重时死亡率在12天内可高达80以上3。11
15、3甲壳溃疡病一些能分解几丁质的细菌会引起甲壳溃疡病。主要发生在养成期，并且甲壳上有数目补丁的黑褐色溃疡性斑点，在蟹的腹部较多4。12真菌类疾病链壶菌病发病率不高但危害较重，是由链壶菌与链壶菌状的真菌寄生引起的。主要寄生在抱卵蟹的受精卵表面及蚤状幼体的体节处，一旦发病，菌丝快速生长，感染率高5。13病毒类疾病2000年以来，以对虾白斑综合症病毒（WSSV）6病原的“虾蟹共死病”在浙江沿海虾蟹混养池内经常大面积发生（王虹玲，2005），王忠发等在20032005年间在舟山沿海对感染了白斑综合症濒死的三疣梭子蟹病毒进行验证，观察分析，为三疣梭子蟹的高效安全养殖提供了基础材料7。14寄生虫疾病141蟹
16、栖拟阿脑虫病寄生虫也是蟹类疾病的重要病原之一，常造成养殖蟹类大量死亡，给养殖户带来严重的损失。常见的蟹类寄生虫蟹栖拟阿脑虫是一种兼性寄生虫，有多种传染途径，最早报道于意大利的绿蟹和法国的一种黄道蟹中发现这种寄生虫的存在。王广成等于2005年首次在三疣梭子蟹中发现了蟹栖拟阿脑虫，报道了该寄生虫能引起蟹“纤毛虫病”，并描述了其危害情况8拟阿脑虫病在三疣梭子蟹越冬期经常发现，但多因诊断错误和和该虫频发而很难根治，造成越冬失败。该病发作和流行几率很大，贯穿亲蟹整个越冬阶段9。142血卵涡鞭虫病自1931年CHATTON等首次报道法国沿岸绿蟹的血卵涡鞭虫HPEREZI感染以来，至今国内外许多地区均发现和
17、报道了该寄生虫病的流行。国外许多地区包括澳大利亚、阿拉斯加、苏格兰、加拿大以及美国东部沿岸等地均发现和报道了血卵涡鞭虫HPEREZI感染病的流行10。梭子蟹血卵涡鞭虫病在温盐度环境变化较大的梅雨季节和台风季节，会在短时间内出现死亡高峰。143才女虫病才女虫POLYDORASPP隶属于隐居目SEDENTARIA，海稚虫科SPIONIDAE，才女虫属，系一类量附着在鳃上时，鳃丝变黑甚至腐烂，呼吸困难，用显微镜检查可见钟形虫、累枝虫、斜管虫等纤毛虫。水中溶氧量低时，病蟹向浅滩处爬行，最后窒息死亡11。144纤毛虫类病引起蟹类寄生虫病的纤毛虫类病原体包括聚缩虫，钟形虫，单缩虫，累肢虫等，此类寄生虫主要
18、寄生在抱卵蟹的受精卵表面及各个时期幼体的鳃，体表的各个部位12。15多病因疾病151掉腿病赵春民报道，梭子蟹掉腿病的病因是水质恶化和细菌如弧菌和痢疾杆菌等感染。分为急性型和慢性型两种，急性型发生的时间短，一般不超过2D，亲蟹附肢集中脱落2个以上，紧接着发生大量死亡；慢性型发生时间较长，贯穿于整个亲蟹培育期，附肢逐渐脱落2个以上，亲蟹陆续衰竭死亡。附肢脱落既可能是步足，也可能是螯足，或是步足、螯足同时脱落。急性型死亡率高，大部分会在短时间内一般不超过5D全部死亡；慢性型培育前期基本无死亡，中后期死亡逐渐增加，至破膜孵幼期会大量死亡，并且由于亲蟹的摄食、活动、自卫能力和体质下降，受精卵的发育受到很
19、大的影响，孵出的幼体体质弱、摄食能力差，死亡率高，很难培育出高质量的蟹苗13。152蟹鳃病鳃是三疣梭子蟹重要的呼吸器官。海洋环境污染和养殖生产自身带来的污染使鳃病成为现代水产养殖业的通病,鳃病可分为四种，由环境不良引起的鳃病，由丝状细菌引起的鳃病，由原生动物引起的鳃病，由丝状藻类引起的鳃病14。由丝状细菌引起的鳃病中丝状细菌往往与纤毛虫等共同附着在三疣梭子蟹的鳃部,影响鳃的呼吸功能,丝状细菌也可能会分泌毒素对机体产生毒害作用,也称“黑鳃病”15。153“乳化病”也叫做“牛奶病”细菌中以革兰氏阴性菌对蟹类影响较大，梭子蟹中的乳化病致病菌溶藻弧菌，是海水中的一种常见的条件致病菌,是近海养殖海洋生物
20、致病的主要病原体之一。发病症状是血淋巴液变为乳白色，折断步足可流出大量白色粘液，患病严重时肌肉可全部化为粘液，也叫做“牛奶病”16。早在1998年吴友吕等对“乳化病”的流行病学、病原及预防进行了研究，接下来又有不同的学者进行更深入的研究17。2003年开始，王国良等为进一步分析该病的病理变化以及致病机理,采集大量典型病蟹样品,对病蟹组织进行病理学研究。他们发现在乳化腔液涂片中观察到的大量葡萄牙假丝酵母，只有在具有显著乳化病症的病蟹中才能分离到的结果相一致。说明酵母菌为继发性感染,而典型的乳化病症主要是由这种继发感染引起18。2005年许文军等通过菌体形态、培养特性及生理生化反应，鉴定该菌为假丝
21、酵母菌。溶藻弧菌和假丝酵母菌两种病原之间的相互协同作用,可能是乳化病能在短时间内迅速爆发造成大面积死亡的重要原因之一19。通过流行病学调查、病原分离、感染试验、组织病理、电镜观察以及分子生物学方法研究，许文军还提出了血卵涡鞭虫HEMATODINIUMSP是近年来引起养殖梭子蟹规模性死亡“牛奶病”的重要病原之一20。2三疣梭子蟹病害的防治虽然国外已有较多关于蟹类病害研究的文献，但对病害防治的研究报道还特别少，许多传染性蟹病因缺乏有效的治疗措施而长期流行蔓延，造成了巨大的经济损失。针对亲蟹越冬危害巨大的蟹栖拟阿脑虫病，王广成等提出了一系列的预防措施以及治疗方法，有盐度抑制法，“甲醛抗菌药”治疗法等
22、21。王国良等提出由于三疣梭子蟹乳化病的致病机理复杂,且表现出细菌与酵母菌并发感染的特点,生产上很难直接应用针对性药物来防治22。因此,在养殖生产上应从改善养殖生态环境、控制养殖密度和加强水质管理等综合防治环节入手文登市水产技术推广站对蟹病进行监测,王世党等提出了治疗对虾白斑病的措施,把好苗种检测关,把好蟹池清池关,把好水源关，把好苗种交叉感染关23。侯传宝发现“红圈病”主要发生在水质清瘦的池子,有单胞藻的池子未见发生,因而育苗池培育起一定数量的有益藻类是预防该病的好措施，并且提出采用新洁尔灭治疗“红圈病”是可行的,有效浓度为10PPM24。许文军等提出有关“乳化病”的防治，尚未有较好的方法，
23、采用消毒药物预防，减少放养密度，改善养殖环境及各种应激反应，将起到较好的效果25。三疣梭子蟹病害防治应坚持“以防为主、综合防治”的方针，积极采取有效的防治措施，并自始至终贯彻到各个养殖环节，才能控制疾病的发生和蔓延。参考文献1阎斌伦，梁利国，张晓君三疣梭子蟹主要病害研究进展J水产科技情报，2010129372KAZUOMOMOYAMA，MIDORIHIRAOKA，VENEGASETALPATHOGENICITYOFPENAEIDRODSHAPEDDNAVIRUSPRDVTOJUVENILESOFSIXCRUSTACEANSPECIESC4SYMPONDISEASESINASIANAQUACUL
24、TUREDAAIV，CEBUCITYPHILIPPINES1999，2226NOV3肖国华，赵春龙，崔兆进三疣梭子蟹人工育苗及养成病害发生的主要原因及防治方法J齐鲁渔业，2006，23336374王亚维三疣梭子蟹人工育苗中丝状菌病和粘污病的防治M养殖技术，20062415MONTANIEH，BONAMIJR，COMPSMIRIDOLIKEVIRUSINFECTIONINTHECRABMACROPIPUSDEPURATORLCRUSTACEA,DECAPODAJJINVERTEBRPATHOL，1993，613203226王光宇三疣梭子蟹的健康养殖和白斑病毒病的防治J水产科技情报，2005，32
25、52212227王忠发，王志铮，许文军虾蟹混养塘中WSSV对三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS致死效应的定量研究J海洋与湖沼，2008，21841898MARIJ，BONAMIJRPC84，APARVOLIKEVIRUSFROMTHECRABCARCINUSMEDITERRANEUSPATHOLOGICALASPECTS，ULTRASTRUCTUREOFTHEAGENT，ANDFIRSTBIOCHEMICALCHARACTERIZATIONJJINBERTEBRPATHOL，1988511451569徐国成，阎斌伦，徐加涛虾蟹拟阿脑虫病的防治研究M水利渔业，2006269
26、59710施慧，许文军，徐汉祥三疣梭子蟹感染血卵涡鞭虫PCR检测方法的建立J上海水产大学学报，200817283311王希升，曹建亭，李欣，等才女虫对三疣梭子蟹育苗的影响M齐鲁渔业200828444512王建平，余晓巍，周志强，等宁波市三疣梭子蟹主要病害流行特征及应对措施M河北渔业20O89495313赵春民三疣梭子蟹亲蟹培育过程中“掉腿病”的防治J科学养鱼，200845214何伟贤三疣梭子蟹鳃病的病因与防治J渔业现代化，20034242515丁朋晓，张连英养殖蟹类病害的研究进展M畜牧与饲料科学，201031333516王高学，黄增荣，顾忠旗三疣梭子蟹“牛奶病”的流行病学调查与防治技术上M科学
27、养鱼，200728317王国良，金珊，李政，等三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS乳化病的组织病理和超微病理研究J海洋科学，2006，43718陈寅儿，王国良，金珊，等三疣梭子蟹肌肉乳化病的同工酶病理变化研究M海洋科学，200832363919许文军，徐汉祥，施慧，等梭子蟹假丝酵母菌病初步研究M水产学报，20052983183620许文军，徐汉祥，施慧三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUSMIERS血卵涡鞭虫病诊断与综合防治措施M现代渔业信息，2006，211121王广成，赵炳然，王权，等对越冬期三疣梭子蟹拟阿脑虫病的初步研究J齐鲁渔业，2005，2233
28、33422陈寅儿，王国良，金珊，等梭子蟹乳化病病原菌联合药敏实验M水利渔业，200626131523王世党，周维武，宋宗岩，等文登市中国对虾白斑病发病监测及分析J齐鲁渔业，2002191024侯传宝梭子蟹育苗中“红圈病”防治初探M渔业致富指南，200724125许文军，徐汉祥，金海卫梭子蟹“乳化病”病原的研究J浙江海洋学院学报，200322209213本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹球状病毒的人工感染与纯化目录1引言22材料和方法221材料、试剂、设备2211材料2212试剂2213仪器、耗材322方法3221蟹病毒人工感染3222病蟹组织超薄切片制作与观察3223由蟹病组织纯化病毒3224
29、纯化病毒的负染、电镜观察43结果与分析431人工感染后三疣梭子蟹病症432病蟹组织超薄切片的电镜观察433由病蟹组织纯化病毒434病毒致病性（致死性）验证64讨论641病毒纯化方法642病毒的致病性7致谢错误未定义书签。参考文献82011届宁波大学本科毕业论文三疣梭子蟹球状病毒的人工感染与纯化1摘要由宁波沿海采集患病三疣梭子蟹，匀浆后过滤，制备病毒匀浆液注射到健康梭子蟹中，同时设置PBS注射对照组。结果为实验组全部死亡，对照组无死亡情况。证实此前在自然感染组织中观察到的球状病毒对三疣梭子蟹具有强感染力，并且致死性较强。采用差速离心法，由患病三疣梭子蟹组织纯化病毒，对纯化的病毒进行负染、电镜下观
30、察，结果表明获得了较纯净的病毒粒子，根据该病毒的形态、大小，此病毒疑似呼肠孤病毒。纯化的病毒感染健康梭子蟹，实验组全部死亡，证实纯化后病毒完整并且有活力，纯化方法有效。关键词三疣梭子蟹；人工感染；纯化ABTRACTSSICKPORTUNUSTRITUBERCULATUSSPECIMENSWERECOLLECTEDFROMCOASTALOFNINGBOINFECTEDTISSUESWEREHOMOGENATEDAFTERFILTERATION,THEVIRUSHOMOGENATEWASINJECTEDINTOHEALTHYCRABCONTROLCRABGROUPWASINJECTEDWITHPB
31、SASARESULT,THEEXPERIMENTALGROUPWEREALLDIEDWHILENODEATHAPPEAREDINTHECONTROLGROUPITCONFIRMEDTHATTHESPHERICALVIRUSHASSTRONGINFECTIOUSANDLETHALEFFECTTOPTRITUBERCULATUSTHEVIRUSWEREPURIFIEDFROMINFECTEDCRABTISSUESBYMULTISTEPDIFFERENTIALCENTRIFUGATIONTHEPURIFIEDVIRUSPARTICLESWERENEGATIVESTAINEDOBSERVEDUNDER
32、ELECTRONMICROSCOPT,THEREAREMANYPURIFIEDVIRUSACCORDINGTOTHESHAPEANDSIZEOFTHEVIRUS,ITWASSUSPECTEDTOREOVIRUSINFECTEDHEALTHYCRABWITHPURIFIEDVIRUS,THEEXPERIMENTALGROUPWASALLDIEDWHICHCONFIRMEDTHATPURIFIEDVIRUSWASCOMPLETEANDDYNAMIC,THEPURIFICATIONMETHODISEFFECTIVEKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSARTIFICIALIN
33、FECTIONPURIFICATION21引言三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS隶属于甲壳纲CRUSTACEA、十足目DECAPODA、梭子蟹科PORTUNIDAE，广泛分布于我国沿海，是一种经济价值较高的大型海产经济蟹类1。三疣梭子蟹味道鲜美，营养价值极为丰富，是人们非常喜爱的水产品之一，同时也是很重要的出口品种，已逐渐成为我国海水养殖的主导品种之一。浙江省沿海地区养殖业发展迅速，宁波市一带短短几年内就发展成了全国闻名的梭子蟹养殖基地。随着三疣梭子蟹养殖业的快速发展，养殖密度不断增加，养殖规模不断扩大，又因为它受到海洋环境的污染、养殖生产自身所带来的污染、养殖技术水平等
34、多方面的原因制约，三疣梭子蟹在养殖的过程中病害问题日趋突出2。各类疾病的发病率和危害程度有逐年上升的趋势，并呈现出大规模发生和暴发性流行的趋势。由于对病原不了解而盲目用药，导致药物滥用，不但提高了水产养殖的投入产出比，危害水产养殖业者的经济利益，而且打击了消费信心，影响到出口内销，严重困扰着梭子蟹水产养殖业的健康发展3。另外由于一些虾蟹综合养殖的推广，一些广宿主病毒如白斑综合症杆状病毒等也成为侵害三疣梭子蟹的病原体。三疣梭子蟹产业化人工养殖中，病害防治作为其最核心的环节，往往被养殖者所忽视，蟹类病毒性病原研究更是极其薄弱4。国内外已报道的蟹类病毒有水生呼肠孤病毒5、微核糖核酸病毒、蓝蟹疱疹病毒
35、、蓝蟹螺旋病毒、河蟹颤抖病毒6，锯缘青蟹杆状病毒7，黄头病毒等。对蟹类病毒的研究多集中在形态观察水平上，尚未进行分子鉴定及灵敏检测方法构建8。研究发现蟹类对黄头病毒YHV具有较高的抵抗力，并不容易感染9。国内外有关三疣梭子蟹病毒研究的文献极少，对三疣梭子蟹病毒的病原和病理研究也尚不深入。其中以对虾白斑症病毒（WSSV）10研究相对透彻国内一些研究所通过实时荧光定量PCR测定试验蟹体内各器官中WSSV含量,病理切片观察濒死蟹各器官组织病理改变的方法，对WSSV进行了系统的研究。近年来，梭子蟹养殖中大规模爆发性死亡现象时有发生，至今还未得到微生物学、分子生物学、免疫学的明确鉴定。此类不明病害严重威
36、胁着我国梭子蟹蟹类养殖业。通过对奉化三疣梭子蟹发生秋季大规模死亡样品的病理观察，发现组织细胞中存在大量球状病毒。我们对人工养殖过程中的三疣梭子蟹秋季大量死亡的病样进行病毒纯化，对纯化的病毒进行形态观察，并用病毒对健康蟹进行人工感染研究，以期为三疣梭子蟹病毒病害快速诊断、防治提供理论与技术支撑。2材料和方法21材料、试剂、设备211材料患病三疣梭子蟹由奉化市池养和滩涂梭子蟹养殖场采集。梭子蟹及喂养梭子蟹的缢蛏购自宁波水产批发、零售市场。212试剂TNE缓冲液50MMTRISHCL，400MMNACL，5MMEDTA，PH763TM缓冲液50MMTRISHCL，10MMMGCL2，PH76，TRI
37、S60578G，MGCL26H2O20338G，H2O1000ML01MOL/LPBS缓冲液NACL8G，KCL02G，NA2HPO4144G，NA2HPO412H2O363G，KH2PO4024G，H2O400ML，调节PH76，补水至500ML混合蛋白酶抑制剂（PMSF）用异丙醇配成100MG/MLTRIZOL试剂购自INVITROGEN，EDTA购置上海生工，青霉素，链霉素，TRISHCL，NACL，EDTA，MGCL2，25戊二醛，1锇酸，酒精，苯甲酸二丙烯醋，醋酸双氧铀一柠檬酸铅，3磷钨酸钾（PTA）。213仪器、耗材高速离心机（BECKMANAVANTIJE由美国贝克曼库尔特公司制
38、造），低速离心机（D37520DSTERODE德国THERMO），超低温冰箱（THERMO991），匀浆机（PT1600EPOLYTRONMADEINSWITZERLANDBYKENEMATICA/G），过滤器（AP01PVACUUMPUMP天津奥特赛思斯仪器有限公司），精密电子天平（JA12002上海恒平科学仪器有限公司），超薄切片机RMCPOWERTOMEXL、透射电子显微镜（日立H7650），045UM、022UM滤膜，滤纸，冰箱，针式滤头，冰盒，注射针，剪刀，移液枪，覆有FORMVAR膜的铜网。22方法221蟹病毒人工感染取病蟹组织进行匀浆；匀浆液在4下，6000G离心10MIN；沉淀
39、用少量PBS重新悬浮后再次离心；合并上清，经045UM、022UM滤膜先后抽滤除杂；用022UM针式滤器滤头过滤除菌后按1000IU/ML加入青霉素和链霉素；插入冰盒，放4病箱过夜，即为攻毒用病毒悬液。将梭子蟹随机分为实验组和对照组，每组四只蟹，对照组注射生理盐水，实验组每只由第四步足基部注射02ML病毒液并且每日投喂缢蛏，换水，观察死亡情况。222病蟹组织超薄切片制作与观察取人工感染发病的病蟹的鳃、胃和肠组织，切成MM3的小块,按常规方法经25戊二醛和1锇酸双固定,浓度梯度酒精脱水，苯甲酸二丙烯醋包埋，聚合。于切片机上制备超薄切片。经醋酸双氧铀一柠檬酸铅双染色，在日立S3400N电镜下观察、
40、拍照并分析。223由蟹病组织纯化病毒取病蟹腮和肌肉，快速剪成碎块，加200ML预先冰浴过的TNE缓冲液（50MMTRISHCL，400MMNACL，5MMEDTA，PH76）；0充分匀浆；缓冲液中添加了1X的混合蛋白酶抑制剂（1MMPMSF）6。4下6000G离心10MIN，收集上清，沉淀用TNE重悬，匀浆1MIN,6000G离心10MIN合并上清。8000G，4离心20MIN,取上清。4下35000G离心15H，弃部分上清液，将沉淀的上层疏松部分用上清洗掉。下层结实的略带白色的部分重悬于1ML的TM缓冲液（50MMTRISHCL，10MMMGCL2，PH75）中。TM缓冲液中添加了1MMPM
41、SF。冰浴过夜。4下3500G离心5MIN，去除沉淀。上清在4下38000G离心15H。将沉淀的上层疏松部分用TM缓冲液冲洗掉。下层结实的白色的部分即纯化的病毒粒子。取少4量病毒固定于100UL25的戊二醛中。224病毒纯化后的负染以及电镜观察取蟹病组织纯化后的病毒悬液，滴一滴此病毒悬液在载玻片上，把覆有FORMVAR膜的铜网反扣在病毒悬液上，20MIN后，取下铜网，然后晾干。在病毒悬液中滴加的3磷钨酸钾（PTA）负染5MIN，用滤纸吸去多余的染液，室温下风干，在日立H7650透射电子显微镜下观察。3结果与分析31人工感染后三疣梭子蟹病症实验组梭子蟹攻毒后全部发病，病蟹临死前呈现活力差、四肢无
42、力、肌肉颤抖、食欲差、行动迟缓。腮丝呈黑化趋势，肝脏部位稍呈红色，部分步足变红，个别可见肌肉浑浊，其他脏器肉眼观察无明显异常。上述症状出现后很快死亡，死亡率100。对照组梭子蟹没有出现死亡情况。32病蟹组织超薄切片的电镜观察将三疣梭子蟹的组织进行超薄切片，在电镜下可以观察到在切片中有明显的病毒粒子的存在。各组织、器官包括腮、肠、肌肉、心脏、肝胰腺、性腺均有感染，其中肠、肌肉、心脏感染严重，存在大量病毒，病毒核心直径约20NM。感染情况及病毒粒子形态与自然感染一致。图1人工感染健康三疣梭子蟹超薄组织切片的电镜观察图片FIG1ELECTRONMICROGRAPHPICTUREOFVIRALPART
43、ICLESFROMVARIOUSTISSUEOFINFECTEDHEALTHCRABS33由病蟹组织纯化病毒将患病三疣梭子蟹组织匀浆后经过两次差速离心，从患病三疣梭子蟹的组织，主要是内5脏中提取纯化得到了大量病毒，经过电镜负染后可以观察到大量的病毒粒子，且纯度较高。成熟病毒粒子直径约为60120NM，病毒呈球形。图2A图2B图2C图2D6图2E图2F图2纯化的病毒粒子的负染电镜照片FIG2PURIFIEDVIRALPARTICLESNEGATIVESTAIN34病毒致病性（致死性）验证在人工感染实验中，我们用纯化的病毒对三疣梭子蟹进行注射感染，同时设立对照组，每组四只蟹，在感染发病的周期内，三
44、疣梭子蟹全部死亡，且死亡率高达100，对照组没有出现死亡情况。与养殖业中该病爆发时蟹群大量快速死亡现象相符，实验结果表明，该病毒对三疣梭子蟹具有致病性，且致死率极高。应该引起水产养殖业的重视。4讨论41病毒纯化方法为了研究病毒的本质并对病毒性疾病进行诊断，必须对病毒颗粒的物理化学性质和病毒遗传物质的结构进行研究，需要高度纯净的病毒制品并且获得一定量纯病毒颗粒11。因而当前迫切任务之一仍是进一步改进病毒提纯技术。目前，从感染动物组织内纯化病毒的方法，主要有离心法、沉淀法和透析法等，其中超速离心法是应用最为广泛的一种纯化病毒的方法12。超速离心法可分为平衡密度梯度离心法和等密度梯度离心法，较常使用
45、的梯度材料有甘油、氯化铯、蔗糖和重水等。氯化铯13主要用于平衡密度梯度离心法，其成本很高、价格较贵；蔗糖用于等密度梯度离心法，因为它溶于水，对蛋白质和核酸无不良影响，应用相对来说更为普遍。密度梯度离心法14虽然是一种常用的病毒纯化方法，但是它的缺点是操作复杂并且成本较高。差速离心是利用了不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。病毒纯化时离心力的选择通常是根据病毒大小、密度来确定的，对于中、大型病毒，在8O000G离心60MIN，即能沉淀15。利用差速离心法提纯各种大小的颗粒和病毒是一种有效的手
46、段。在纯化病毒的工作中，我们必须根据需要分离的病毒的特点，选择适宜的纯化方法。我们从对三疣梭子蟹分离纯化的这种球状病毒的研究结果表明，该病毒个体较小，一般的高速离心较难获得纯净病毒。通过参考文献1617，我们设计了纯化流程。在实验中发现，经过多次低速离心时去除大部分的组织碎片后，通过调整病毒纯化缓冲液中盐离子浓度，可以促进病毒的沉降。同时在第一次高速离心后及时更换较低盐离子浓度的缓冲液，可以更好的保护裸露的病毒粒子，尽量保持病毒粒子的完整性。通过上述方法获得了较好的病毒纯化效果电镜下观察病毒较纯净、结构完整；用纯化的病毒对健康蟹进行人工感染，致死率高。用纯化的病毒进行核酸分析发现其为RNA病毒
47、，基因组分节，为呼肠孤病毒，这进一步表明纯化获得成功，这也是在国内外首次在三疣梭子蟹中发现呼肠孤病毒（另文发表）。虽然从核酸分析其为呼肠孤病毒，但形态上该病毒与以往报导的呼肠孤科病毒有较大差异，可能是新病毒。742病毒的致病性在人工感染试验中，对照组未出现死亡。病毒注射感染组，所有个体均成功感染，出现食欲减退甚至停食、反应迟缓等症状，且在感染后全部死亡，这与自然状况下发病死亡的三疣梭子蟹的情况一致。通过对人工感染实验的结果分析发现，此球状病毒为三疣梭子蟹发病死亡的病原，而且这种病毒对三疣梭子蟹有很强的致死性，三疣梭子蟹一旦感染这种病毒，经过短暂的潜伏期后，快速死亡。由于这种疾病具有潜伏期短，发
48、病快等特点，使得在该病的防治过程中存在一定的难度。对感染濒死个体三疣梭子蟹的组织病理观察可见，病蟹肝胰腺、肌肉、鳃组织的靶细胞核肿大、变形，并出现以坏死为主的病变，电镜下可在濒死蟹的肝胰腺、肌肉等组织细胞中观察到大量病毒粒子。成熟病毒粒子直径约为60120NM，病毒呈球形。呼肠孤病毒是蟹类病毒中常见的一种病毒。呼肠孤病毒在锯缘青蟹、中华绒螯蟹以及河蟹中曾被报道1820。WENG等18报道了一种新的锯缘青蟹病毒性疾病“睡眠病SLEEPINGDISEASE”，病蟹的典型特征是肝胰腺萎缩。2004年511月该病在东南沿海福建省和广东省广泛流行，致螃蟹的死亡率非常高在养殖塘中青蟹死亡率接近70。WEN
49、G等通过一系列的实验证实青蟹类呼肠孤病毒是“睡眠病”发生的主要病原。该病毒在病蟹的心脏、鳃、肝胰腺和肠细胞等组织中广泛分布，且在细胞浆中分散分布或呈晶格状排列。贡成良19等在对江苏等地的患颤抖病的中华绒螯蟹进行研究后发现，该病的病原为一种球状病毒，大小约为55NM。经核酸电泳后证实该病毒为呼肠孤病毒。陈吉刚20等在对浙江省三门县等地区患病锯缘青蟹的组织电镜切片观察中发现大量的呼肠孤病毒，该病毒粒子的大小为60NM左右，二十面体对称，无囊膜。我们的研究发现，此次三疣梭子蟹中所纯化得到的病毒在大小和形态等方面与已报道的蟹中感染的呼肠孤病毒均类似。在其后对该病毒进行的进一步研究结果证实了该病毒确实为呼肠孤病毒（另文阐述）。此次对三疣梭子蟹病害的研究结果表明，呼肠孤病毒正是浙江地区三疣梭子蟹爆发性死亡的致病原，这在国内外的三疣梭子蟹病害研究报道中尚属首
