1、本科毕业论文系列开题报告生物工程梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI隶属单殖目、分室科、新贝尼登虫属,在世界范围内广泛分布,它主要寄生于重要海水养殖鱼类,如大黄鱼、鮸鱼、石斑鱼、真鲷、花鲈和牙鲆等鱼类体表、鳍和鳃丝等部位。虫体破坏宿主黏液组织,吸取宿主的血液或吞食体表组织,引起宿主皮肤搔痒而不停摩擦养殖网箱,进而导致皮肤溃疡糜烂和体表组织大面积创伤脱落,病鱼烦躁不安,食欲降低、厌食或拒食,容易因衰竭而死亡。近年来,由于养殖生态环境变化及高密度养殖等原因,该病害在我国浙江、福建和广东沿海一带重要海水养殖地区频繁爆发,鱼群
2、自然感染率平均为5214,最高感染率达100,严重地影响我国沿海水产养殖业的发展。因此，梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗具有重要意义。组织蛋白酶B具有广谱的蛋白水解活性，活性中心含有巯基，可以降解血红蛋白、血清蛋白、卵黄磷蛋白、层粘蛋白、纤维连接蛋白和型胶原等细胞外基质成分。血吸虫的肠道内存在组织蛋白酶B，可以为其提供营养。梅氏新贝尼登虫也应该有类似的特性。目前，利用植物基因工程技术已经克隆了水稻、小麦、玉米等L5种不同来源的蛋白酶抑制剂CDNA，并通过基因枪或农杆菌介导等转化途径转人不同植物，其中大部分均获得了对昆虫具有明显抗性的转基因植株，解决了因大量使用化学药剂控制害虫而造成的环境污染问题。
3、这梅氏新贝尼登虫病的预防有很好的指导和借鉴意义。本研究目的旨在为梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗提供科学理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题研究的基本内容本实验主要是提取梅氏新贝尼登虫总RNA，获得梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶BCDNA序列，并进行序列分析及进化树构建。拟解决的问题梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B序列分析。三、研究的方法与技术路线（一）研究方法1实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA体表分离梅氏新贝尼登虫成虫，经系统寄生虫学的鉴定，暂养于海水中至肠道内含物排空后，用无菌双蒸水反复冲洗虫体
4、后置于EPPENDOFF管中，70C冰箱保存备用。2总RNA提取利用RNAISO试剂提取梅氏新贝尼登虫组织总RNA1将100MG70保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1MLRNAISO组织以下为加入1MLTRIZOL试剂标准。2研磨后转入15MLEPPENDORF管中，剧烈振荡混匀，室温放置5MIN。4，12000RPM离心5MIN。3取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15S，充分混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。4底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管注意不要吸入蛋白层，加入05ML氯仿于上清，振荡混匀
5、，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。5将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN。412000RPM离心10MIN，去上清。6加入DEPC水配制的体积分数75乙醇1ML，振摇，洗涤沉淀。412000RPM离心5MIN。重复步骤6一次，以彻底将盐份除净。7去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意所有待用的非TRIS的试剂用01DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用01DEPC水处理过夜后121高压灭菌20MIN。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA降解。8RNA样品OD值检测。取1LRNA溶液加入到69LDEPC处理水中
6、，用紫外分光光度计测定230NM、260NM和280NM的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000G/L去除蛋白指标OD260/OD28018去除盐分指标OD260/OD230209RNA电泳检测。取5LRNA样品加4LDEPC处理水和1L10BUFFER凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。10MRNA纯化采用OLIGOTEXDT30进行纯化。3构建寄生虫CDNA文库构建实验采用的载体为PBLUESCRIPTIISK，根据选择的ECORI和XHOI酶切位点和锚定引物。31CDNA第一链的合成（1）模板RNA（POLYARNA）500G中加入不含RNA酶的灭菌水，使其总量达到
7、108L。（2）65加热5分钟后，冰中放置5分钟（冷却。（3）在微量离心管中配制下列反应液。试剂体积/L51STSTRANDSYNTHESISBUFFER1STSTRANDDNTPMIXTURERNASEINHIBITOR20U/LOLIGODT18ANCHORPRIMER1G/L40121020（4）向3的反应液里加入2的热处理后的POLYARNA溶液（5G），轻轻混匀。（5）室温放置10分钟后，加入REVERSETRANSCRIPTAE（MMLV10L（全量为20L，轻轻混匀。（6）42反应1小时。（7）反应结束后置于冰中冷却2分钟。32CDNA第二链的合成（1）在CDNA第一链合成液（2
8、0L）中按下列顺序加入反应试剂，进行2NDSTRANDCDNA的合成反应（反应液总量为146L。试剂体积/L灭菌DEPC水52NDSTRANDSYNTHESISBUFFER2NDSTRANDDNTPMIXTURERNASEFREEH2O可变3045875ECOLIRNASEH/ECOLIDNALIGASEMIXTUREECOLIDNAPOLYMERASEI总体积22146（2）用移液枪轻轻混匀后16反应2小时。（3）70加热10分钟后，室温放置5分钟。（4）加入4L的T4DNAPOLYMERASE后，轻轻搅拌。（5）37反应10分钟。（6）向2NDSTRANDCDNA合成反应液（150L）中加
9、入等量（150L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）溶液。VORTEX搅拌510秒钟。（7）室温下15,000RPM离心5分种，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中注意切勿取出中间层。（8）向水相中加入等量（150L）的氯仿/异戊醇（241）溶液，VORTEX搅拌510秒钟。（9）在室温下15,000RPM离心5分钟，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中。（10）加入1/10量（15L）的3MSODIUMACETATEPH52、4L的DRGENTLEPRECIPITATIONCARRIER、225倍量的100乙醇。（11）均匀混合后立即进行15,
10、000RPM、30分钟的离心室温下。（12）除去上清后用70的乙醇清洗。（13）干燥沉淀后，用125L的不含RNA酶的灭菌水溶解沉淀。33适配体连接ADAPTORLIGATION向上述双链CDNA溶液125L中加入下列试剂，全量20L。试剂体积/L灭菌DEPC水10T4DNALIGASEBUFFERECORISMAIADAPTOR04G/LT4DNALIGASE350U/L总体积可变2352202轻轻混匀后，8过夜反应（16小时以上。370保温30分钟后，室温放置5分钟。44下12000G离心15分钟，小心弃去上清液，用70乙醇洗涤沉淀，4下12000G离心5分钟。34限制酶XHOI酶切反应1
11、向ADAPTORLIGATION溶液20L中加入下列试剂，全量50L。试剂体积/L灭菌DEPC水XHOISUPPLEMENTXHOI50U/L总体积可变27350轻轻混匀后，37反应3小时。35使用SPINCOLUMN除去短链CDNA以下的COLUMN处理可以除去400BP以下的短链CDNA。SPINCOLUMN的准备（1）反复上下颠倒悬浊COLUMN内的GEL。（2）先取下上盖后，慢慢取下下盖，COLUMN上下盖不要丢弃。（3）让COLUMN内的BUFFER自然流出（大约需要15分钟。（4）安装下盖，向COLUMN中加入2ML的TEBUFFER后再盖上盖，反复上下颠倒悬浊GEL。（5）重复上
12、述操作24。（6）取下COLUMN的上下盖，让COLUMN内的BUFFER自然流出。（7）将去盖的15MLMICROTUBE放置于FALCONTUBE中，然后将SPINCOLUMN插入FALCONTUBE中，将COLUMN的下端安装于FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE内2，400G离心2分钟。（8）丢弃FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE，向FALCONTUBE中放入新的去盖的15MLMICROTUBE，再将SPINCOLUMN的下端安装于FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE内。36短链CDNA的除去（1）向XHOI酶切溶液（50L）中加入下列试剂，
13、充分混合。试剂体积/LTEBUFFER40TRNA10G/L1（2）将上述1的溶液向操作1中准备好的SPINCOLUMN中添加。请注意要添加在COLUMN中的GEL表面的中央位置，每次添加约10L，分数次慢慢添加。（3）400G离心2分钟。（4）COLUMN洗脱液约100L转移至新的15MLMICROTUBE中，加入等量（100L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）溶液，剧烈振荡混匀。（5）室温下15,000RPM离心5分钟，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中注意切勿取出中间层。（6）加入等量（100L）的氯仿/异戊醇（241）溶液，剧烈振荡混匀。（7）室温下15,
14、000RPM离心5分钟，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中。（8）加入1/10量（10L）的SODIUMACETATE（PH52、4L的DRGENTLEPRECIPITATIONCARRIER，225倍量的100乙醇，充分混匀。（9）室温下15,000RPM离心30分钟，除去上清，再用70乙醇清洗沉淀。（10）干燥沉淀后用15L的RNASEFREEH2O溶解沉淀。37连接到特定质粒载体载体结合反应配制下列LIGATION反应液。试剂PURIFIEDCDNA10T4DNALIGASEBUFFERPBLUESCRIPTIISKT4DNALIGASE350U/L体积/L1
15、5212（2）轻轻混合后12过夜反应。（3）向LIGATION反应液中加入80L的TEBUFFER，用等量100L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）抽提1次，再用等量（100L）的氯仿/异戊醇（241抽提1次。（4）向上清中加入1/10量（10L）的3MSODIUMACETATEPH52）、4L的DRGENTLEPRECIPITATIONCARRIER，225倍量的100乙醇，充分混合。（5）室温15,000RPM离心30分钟，除去上清。（6）用70乙醇清洗沉淀。（7）干燥沉淀后，用20L的TEBUFFER溶解沉淀。（8）20保存。38质粒转化（1）将80保存的DH10BELECTROCEL
16、LS于冰上融解。（2）将LIGATION溶液的一部分（0510L）加入至DH10BELECTROCELLS中，轻轻混匀。（3）将2的菌液迅速转移至冰上预冷的01CM冲击槽中，施加电压脉冲进行电击转化。LIGATION溶液宿主大肠杆菌机种冲击条件0510LDH10BECOLIPULSER（BIORAD公司）15KV,200，25F（4）向冲击槽内快速加入冰上预冷的SOC。（5）全量取出回收后，转移至培养TUBE中（FALCONTUBE等，37振荡培养1小时（使用1ML的SOC培养基。（6）取部分5的培养液（1L或10L）涂布于LB/AMP琼脂平板培养基上培养，剩余的培养液请于4保存。（7）37过
17、夜培养。（8）计算菌落数，求取CDNAPRIMARYLIBRARY效率。（9）使用T7PROMOTERPRIMER及T3PROMOTERPRIMER进行COLONYPCR反应，确认本LIBRARY的INSERT分布情况。4随机测序及序列分析得到的宿主细胞（大肠杆菌DH10B）进行平板涂布，然后用牙签挑取平板上阳性单克隆，进行序列测定。序列测定和分析采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由上海华大公司测定。序列分析采用BLASTP分析软件HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLAST/，多重序列比对采用DDBJ软件CLUSTALW程序HTTP/CLUSTALWDDBJ
18、NIGACJP/，等电点分析采用EXPASY软件HTTP/WWWEXPASYCH/，系统进化分析由MEGA40版程序完成TAMURAETAL，2007。（二）技术路线四、研究的总体安排与进度2010120103毕业论文选题2010320107进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书，制定具体研究计划和试验方案。2010720108梅氏新贝尼登虫成虫采集和保存。20108201012梅氏新贝尼登CB全长CDNA序列获得，CB序列BLAST分析，CB序列多序列比对分析，CB进化树构建；开题答辩与综述。2011120113数据和材料整理、分析。2011320115完成2篇外文翻译，论文撰写、提交
19、并答辩。五、主要参考文献1徐昌隆,黄智铭,陈民新,等组织蛋白酶B及其基因在肝癌中的表达及意义J温州医学院学报,2004,3464144162李杰平,张平,张书杰,等实验性肺纤维化大鼠肺组织CATHEPSINB表达的动态变化J中国现代医学杂志,2008,18165683赵艳艳,刘建兵,罗梅浩,等烟夜蛾组织蛋白酶B酶原基因的克隆、序列分析和原核表达J昆虫学报,2008,5111112111284杜欣军,邵红莲,邵丁丁,等棉铃虫组织蛋白酶B酶原在大肠杆菌中的表达及纯化J农业生物技术学报,2004,1221621665赵露露,董秀萍,于蕾,等海参体壁组织蛋白酶B酶学性质的研究J食品研究与开发,2008
20、,298596杨丽,陈清江宫颈鳞癌组织中组织蛋白酶B、层粘连蛋白表达及其意义J医学论坛杂梅氏新贝尼登虫成虫采集和保存构建进化树文库构建克隆序列分析志,2008,291713157华静,任卫平,陆伦根,等不同亚型胃癌细胞株裸鼠移植瘤中组织蛋白酶B的表达J胃肠病学,2002,731631658刘顾,施尧,王利民,等原位杂交检测胃癌组织中组织蛋白酶B的表达J中华消化杂志报,1998,1881811829肖庆,唐深,樊晓晖组织蛋白酶B及抑制剂与肿瘤J现代肿瘤医学,2008,16467467610王中显,刘少扬,江大琼组织蛋白酶B在卵巢癌中的表达及意义J肿瘤,2006,26655956211DONGSS
21、,STRANSKYGI,WHITAKERCH,ELA1AVIANCATHEPSINBCDNASEQUENCEANDDEMONSTRATIONTHATMRNASOFTWOSIZESAREPRODUCEDINCELLTYPESPRODUCINGLARGEQUANTITIESOFTHEENZYMEJBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTA1995,125L697312李美宁组织蛋白酶B与肿瘤J国外医学肿瘤学分册,2005,32642943213BERQUINIM,YANS,KATIYARK,ELA1DIFFERENTIATINGAGENTSREGULATECATHEPSINBGENEEX
22、PRESSIONINHL60CELJJLEUKOCBIOL,L999,664609616毕业论文文献综述生物工程梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析摘要组织蛋白酶B（CATHEPSINB，CB）为半胱氨酸蛋白酶，具有广谱的蛋白水解活性。本文就CB的生物学特性与生理功能及酶学性质，酶原如何激活，CB与肿瘤扩散和细胞凋亡的关系以介绍，并对CB的抑制剂和应用方面的研究做了总结，最后总结了CB的基因结构特点及其表达调控机制。关键词组织蛋白酶B；细胞凋亡；抑制剂；基因结构；表达调控1组织蛋白酶B简介组织蛋白酶B（CATHEPSINB，CB）为半胱氨酸蛋白酶，在酸性PH的溶酶体中，CB主要是外肽酶，若
23、在中性或碱性PH环境中，CB则为内肽酶（徐昌隆等，2004；李杰平等，2008）。CB的此种水解蛋白的双重活性，使其蛋白水解范围很广。CB存在于细胞质和溶酶体中，其活性中心有巯基，可降解细胞外基质成分，进而破坏组织屏障赵艳艳等，2008。CB广泛存在于细菌、昆虫和哺乳动物中。溶酶体的降解蛋白质过程中，CB发挥着重要的作用，血浆蛋白、激素和细菌等被溶酶体内的蛋白水解酶类水解。CB对多种昆虫，如棉铃虫、蚊等的卵黄磷蛋白水解活性高，提供胚胎发育必要的营养物质（杜欣军等，2004）。2CB酶学性质日本血吸虫CB基因所编码的蛋白分子量395KD，不含有亮氨酸。520位氨基酸区域可能为跨膜结构域，CB信号
24、肽剪切位点在第26和27位氨基酸之间。蛋白序列中含有一个肽酶C1催化结构域，含有半胱胺酸蛋白酶活性位点和磷酸化位点，因此推测此蛋白的活性可能会受磷酸化作用调节。研究海参CB酶学性质发现，CB最适温度为40，最适PH为55（赵露露等，2008）。3CB酶原激活无活性的前体酶原水解后变成成熟的组织蛋白酶，前体酶原由含有成熟酶活性中心的催化域和信号肽前体肽二者构成。信号肽负责将核糖体表达的前体酶原蛋白转运到内质网，然后在内质网被水解形成酶原。酶原通过蛋白水解，变为分子量30KDA的成熟单链形式，再作经进一步的裂解，最后才形成具有活性的成熟组织蛋白酶B。溶酶体内的CB，首先在粗面内质网的核糖体内合成无
25、活性酶原，到胞浆糖基化，糖基在高尔基体中被磷酸化修饰，形成甘露糖一6一磷酸蛋白，溶酶体上的6一磷酸甘露糖受体能对其进行识别，进而胞饮入溶酶体内。CB有两种成熟形式，双链的形式或单链形式杨丽等，2008。4CB与肿瘤和细胞凋亡41CB与肿瘤一方面，研究表明CB与瘤细胞的侵袭和转移相关。EXON2和EXON3以及激活前体蛋白肽的7个氨基酸残基在肿瘤时缺失，形成了特殊的MRNA产物，蛋白质合成后因其缺失信号肽，所以不能沿内质网途径进入溶酶体而弥散于胞浆中，在癌细胞转移的过程中，CB可以直接溶解细胞外基质，产生可降解如层粘素、纤维连接蛋白等成分的酶，进而促进了肿瘤细胞向组织深部的浸润（华静等，2002
26、）。瘤细胞分泌的CB不能被摄人的溶酶体，因其缺乏甘露糖一6一磷酸受体识别标记。利用免疫组化及原位杂交技术研究，发现CB在许多的种肿瘤细胞中表达较高（刘顾等，2008）。另一方面来讲，血管被CB通过多种机制促进形成，进而促使肿瘤生长。CB降解基底膜和细胞外基质时，会从细胞外基质中释放促血管生长因子，促进血管生成。另外，CB还可以降解金属基质蛋白酶的抑制剂，直接或间接促进血管生成（肖庆等，2008；王中显等，2006）。42CB与细胞凋亡促凋亡蛋白BID被CB裂解后，细胞色素C从线粒体被释放，导致细胞凋亡的瀑布效应。这表明组织蛋白酶B与细胞凋亡存在着紧密的关系（李杰平等，2007）。CB基因被剔除
27、了的小鼠，对于TNF介导的肝细胞凋亡和肝损伤有阻断作用。CB还参与了WEHIS纤维肉瘤中TNF介导的细胞凋亡，这也同时说明了CB有截然相反的两个作用既可以促使瘤细胞对周围组织的侵袭；也可以促进瘤细胞凋亡。组织蛋白酶B有两条途径介导细胞凋亡组织蛋白酶B不依赖于CASPASES的细胞凋亡途径；组织蛋白酶B依赖于CASPASES的细胞凋亡途径（李杰平等，2007；王翠芬等，2008）。5CB抑制剂人类的CB的抑制剂均属于内源性的蛋白抑制剂，且专一性较差。恶性肿瘤中CB与CB抑制剂之间生理平衡的破坏，及CB抑制剂的表达下降，造成了CB活性的增加。肿瘤的侵袭和转移过程，有CB同其抑制剂共同作用的参与。C
28、B抑制剂有潜在治疗和控制癌细胞转移的作用，目前CB抑制剂已成为研究抗肿瘤药物的一个重要研究方向（肖庆等，2008）。CB有三类主要的抑制剂一类为KININOGENS，其对CB的抑制作用较弱；第二类为CYSTATINS，主要包括CYSTATINC，CYSTAINC是对CB亲和力最大的蛋白；第三类为STEFINS，包括STEFINC、STEFINA和STEFINB。最近又发现了五种对组织蛋白酶B具有较好抑制活性的黄烷醇类天然化合物抑制剂PROEYANIDINB2，PRODELPHINIDINB23OGALLATE，EPIGALLOCATECHIN30GALLATE，PRODELPHINIDINB2
29、和PUERINA，其IC50值分别为076，058，096，044和207MOL/L。这五种抑制剂是组织蛋白酶B的新型天然的抑制剂（贾锐锐等；2008）。大肠癌患者的CYSTATINC比正常时增加16倍，其抑制剂的含量虽增加，但增加的抑制剂并未平衡相应增加的组织蛋白酶B酶活性，即组织蛋白酶B和其抑制剂处于失平衡状态。因此，可以将组织蛋白酶B的抑制剂与其比值用来作为断定肿瘤恶性程度（乔镇等，2008；刘颐等，1998）。6CB应用研究61CB疫苗日本血吸虫的CBDNA疫苗SI31BIN给小鼠接种后，结果显示日本血吸虫CBDNA疫苗具有高度的抗生殖免疫作用（易新元等，2000）。体外转录合成CB基
30、因的特异性SIRNA并转染EC9706细胞，结果表明不同浓度的SIRNA对CB及MRNA的表达都有抑制效应（娄欣等，2007）。进一步的研究表明，疫苗使小鼠获得了抗血吸虫感染的能力（田明礼等，2001）。因此推测，SJ31B1N免疫后产生了细胞免疫，对血吸虫的产卵和发育具有一定的影响，这给人类的抗寄生虫感染带来了新希望（曾宪忠等，2001）。62CB抑制剂的应用巯基蛋白酶抑制剂在防治病虫害上面，显示了广阔的应用前景。因为CB消化酶活性被抑制剂抑制，会引起昆虫正常代谢的扰乱，甚至导致死亡。当前，已经克隆了水稻、玉米等L5种不同来源蛋白酶抑制剂的CDNA，并转入到不同植物中，其中大部对昆虫有明显抗
31、性。CB抑制剂还有潜在的控制癌细胞转移的作用，已成为研究抗寄生虫感染、抗肿瘤疾病药物的重要研究方向。63CB在食品工业中的应用CB在食品工业中具有重要的应用价值。CB能将肌肉中的蛋白质分解成游离氨基酸和多肽，进而降解成风味成份醛类和酮类化合物。CB能降解原肌蛋白、肌球蛋白等蛋白，在肉加工时的嫩化、成熟中发挥重要作用（赵改名等，2003）。7CB基因结构特点CB基因的核苷酸有一定的保守性，不同种动物及不同组织的CB序列具有相似的结构与组成。日本血吸虫CB基因序列与曼氏血吸虫CB肽链内切酶基因序列高度同源85的同一性，编码348个氨基酸（胡永轩等，2004）。鼠的CB基因由10个外显子EXON和9
32、个内含子INTRON组成，催化活性位点被内含子分开，5端具有TATA盒和信号肽。禽的CB基因共编码340个氨基酸，与鼠的CB序列很相似（DONG等，2004）。8CB基因表达调控机制CB表达的调节，存在着基因、转录和转录后水平，以及翻译、翻译后修饰等多水平的调节（李美宁，2005）。转录因子，如ETS1、CBBP和SP1等均在转录过程中起重要作用。视黄酸、钙化醇等，在转录和转录后水平都起着调控CB表达的作用（ISABELLEMBERQUIN等，1999）。另外，MRNA异常的表达也可以致使CB的外泄，在转录、转录后加工、翻译等过程中，都能影响到CB的活力。反义RNA技术可对蛋白质进行负调控卢士
33、英等，2004。参考文献1徐昌隆,黄智铭,陈民新,等组织蛋白酶B及其基因在肝癌中的表达及意义J温州医学院学报,2004,3464144162李杰平,张平,张书杰,等实验性肺纤维化大鼠肺组织CATHEPSINB表达的动态变化J中国现代医学杂志,2008,18165683赵艳艳,刘建兵,罗梅浩,等烟夜蛾组织蛋白酶B酶原基因的克隆、序列分析和原核表达J昆虫学报,2008,5111112111284杜欣军,邵红莲,邵丁丁,等棉铃虫组织蛋白酶B酶原在大肠杆菌中的表达及纯化J农业生物技术学报,2004,1221621665赵露露,董秀萍,于蕾,等海参体壁组织蛋白酶B酶学性质的研究J食品研究与开发,2008
34、,298596杨丽,陈清江宫颈鳞癌组织中组织蛋白酶B、层粘连蛋白表达及其意义J医学论坛杂志,2008,291713157华静,任卫平,陆伦根,等不同亚型胃癌细胞株裸鼠移植瘤中组织蛋白酶B的表达J胃肠病学,2002,731631658刘顾,施尧,王利民,等原位杂交检测胃癌组织中组织蛋白酶B的表达J中华消化杂志报,1998,1881811829肖庆,唐深,樊晓晖组织蛋白酶B及抑制剂与肿瘤J现代肿瘤医学,2008,16467467610王中显,刘少扬,江大琼组织蛋白酶B在卵巢癌中的表达及意义J肿瘤,2006,26655956211李杰平,何平平,于小华,等大鼠肺纤维化细胞凋亡及CATHEPSINB基
35、因变化的关系J现代生物医学进展,2007,5269669812李杰平,张平组织蛋白酶B与细胞凋亡及肺纤维化的关系J国际呼吸杂志,2007,27429529713王翠芬,陈敏,等溶酶体CATHEPSINB参与大黄素诱导HK2细胞凋亡J东南大学学报医学版,2008,27640440814肖庆,唐深,樊晓晖组织蛋白酶B及抑制剂与肿瘤J现代肿瘤医学,2008,467467615贾锐锐,曾广智,等组织蛋白酶B的新型天然抑制剂J云南植物研究2008,30562162316乔镇,关景明,汪丽燕组织蛋白酶B及其抑制剂CYSTATINC与大肠腺瘤及大肠腺癌关系的实验研究J浙江临床医学,2008,10674975
36、017杨正时海鱼弧菌感染J国外医学微生物学分册,1989,82818318易新元,曾宪忠,汪世平,等日本血吸虫组织蛋白酶BDNA疫苗抗生殖免疫的研究J中国人兽共患病杂志,2000,161454719娄欣,张红,曹学全,等组织蛋白酶B特异性SIRNA对食管癌EC9706细胞组织蛋白酶B基因表达的影响J郑州大学学报医学版,2007,421141720曾宪忠,易新元,曾宪芳日本血吸虫组织蛋白酶B核酸疫苗血清抗体与抗生殖免疫关系的初步研究J中国人兽共患病杂志,2001,174404221田明礼,易新元,曾宪芳,等日本血吸虫31KDA组织蛋白酶BDNA疫苗保护性免疫效果观察J中国血吸虫病防治杂志,200
37、1,13420921222赵改名,周光宏,徐幸莲肌肉内源蛋白酶及其在干腌火腿加工过程中的作用J食品与发酵工业,2003,294707423胡永轩,肖建华,曾桥,等日本血吸虫组织蛋白酶B肽链内切酶基因的获得及结构与功能分析J中国人兽共患病杂志,2004,20979079324DONGSS,STRANSKYGI,WHITAKERCH,ELA1AVIANCATHEPSINBCDNASEQUENCEANDDEMONSTRATIONTHATMRNASOFTWOSIZESAREPRODUCEDINCELLTYPESPRODUCINGLARGEQUANTITIESOFTHEENZYMEJBIOCHIMICA
38、ETBIOPHYSICAACTA1995,125L697325李美宁组织蛋白酶B与肿瘤J国外医学肿瘤学分册,2005,32642943226BERQUINIM,YANS,KATIYARK,ELA1DIFFERENTIATINGAGENTSREGULATECATHEPSINBGENEEXPRESSIONINHL60CELJJLEUKOCBIOL,L999,66460961627卢士英,任洪林,柳增善,等组织蛋白酶B研究进展J河北师范大学学报自然科学版,2004,283306309本科毕业设计（20_届）梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析目录摘要（ABSTRACT）1引言192材料和方法19
39、21材料19211原料与试剂19212主要仪器20213主要试剂及其配制2122方法21221实验动物21222总RNA提取21223构建寄生虫CDNA文库构建22224CDNA第一链的合成22225CDNA第二链的合成22226适配体连接ADAPTORLIGATION23227限制酶XHOI酶切反应23228使用SPINCOLUMN除去短链CDNA23229短链CDNA的除去242210连接到特定质粒载体242211质粒转化252212随机测序252213生物信息学分析253结果与分析2631生物信息学分析26311同源性及ORF分析分析26312分子量、等电点、信号肽、及电荷分布分析263
40、13功能域分析28314二级结构分析28316胞内定位及疏水性分析2832氨基酸多序列比对2933进化树构建324讨论33参考文献35致谢错误未定义书签。摘要组织蛋白酶B（CATHEPSINB，CB）为半胱氨酸蛋白酶，具有广谱的蛋白水解活性，从而破坏一系列组织屏障。目的本研究旨在为梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗提供科学理论依据。方法通过序列克隆和分析，鉴定梅氏新贝尼登组织蛋白酶B序列特征及进化关系。结果梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B基因的CDNA序列全长1056个核苷酸，最大开放阅读框编码一个352个氨基酸的蛋白，分子量394KDA，等电点为586，含有一个肽酶C1A结构域。系统进化树分析均表明梅氏
41、新贝尼登虫组织蛋白酶B与广州管圆线虫（ANGIOSTRONGYLUSCANTONENSIS最近。关键词组织蛋白酶B；梅氏新贝尼登虫；序列分析；进化树ABSTRACTCATHEPSINBISACYSTEINEPROTEASESANDHASAWIDEPROTEOLYSISACTIVITY,THEREFOREITCANDECOMPOSETISSUEBARRIERAIMTHEPURPOSEOFTHISSTUDYISTOAFFORDTHEORETICALBASISFORPREVENTIONANDCUREOFNEOBENEDENIAMELLENIDISEASEMETHODSCLONINGANDSEQUEN
42、CEANALYSISOFCATHEPSINBWASEMPLOYEDTOIDENTIFYTHESEQUENCEFEATUREANDEVOLUTIONARYRELATIONSHIPOFCATHEPSINBOFNEOBENEDENIAMELLENIRESULTTHECDNASEQUENCEOFCATHEPSINBOFNEOBENEDENIAMELLENIHAS1056NUCLEOTIDESCATHEPSINBCONTAINS352AMINOACIDS,THEMOLECULARWEIGHTOFITIS394KDA,ISOELECTRICPOINTIS586,APEPTIDASEC1ADOMAINISI
43、NTHEMOLECULEPHYLOGENETICTREEANALYSISREVEALSTHATCATHEPSINBOFNEOBENEDENIAMELLENIISCLOSERTOTRICHOBILHARZIAKEYWORDSCATHEPSINBNEOBENEDENIAMELLENISEQUENCEANALYSISPHYLOGENETICTREE1引言梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI，属扁形动物门PLATYHELMINTHES、吸虫纲TREMATODA、单殖吸虫目MONOGENEA、多室科CAPSALIDAE、贝尼登亚科BENEDENIINAE。其繁殖速度很快，所寄主范围遍及数
44、百种海产鱼类，可以寄生在鳃丝和体表上取食鱼体表皮肤和粘液12。如真鲷、大黄鱼和牙鲆等，梅氏新贝尼登虫破坏其的黏液组织，吞食体表组织，吸取血液，致使其皮肤搔痒而不断地摩擦，皮肤会糜烂。最终病鱼会躁动不安，厌食或者拒食，易因体力衰竭而死亡34。每只成虫大约可产数百枚卵，虫卵抵抗外界不利因素的能力很强。这些卵孵化成钩毛蚴后又再度侵袭，养殖上采用的一般的防治手段是很难将虫卵杀死的。而且，我国福建、浙江等地近年来非常流行梅氏新贝尼登虫病，自然感染率平均为5214，死亡率近70，经济损失比较大，浙闽沿海等地区的水产养殖业发展受到严重制约。例如福建宁德1998年因梅氏新贝尼登虫病暴发，大黄鱼的自然感染率达7
45、0以上，经济损失甚至超过了细菌性疾病带来的损失5。组织蛋白酶B是一类细胞内肽键水解酶，存在于大多数动物的组织中，活性中心含有巯基，催化苯甲酰L精氨酰胺水解。其蛋白水解活性很广泛，可以降解卵黄磷蛋白、血清蛋白、层粘蛋白和血红蛋白等细胞外基质成分67。除参与如免疫抗原的加工、激素的活化和慢性炎症等生理病理过程外，最重要的是参与细胞内蛋白质的新陈代谢8。巯基化合物（SH化合物）存在的前提下，组织蛋白酶B才具有活性，已知有B1和B2二种类别，最适PH在6附近，与木瓜蛋白酶的肽链内切酶类似。CB有两种成熟的形式一种是双链形式，分子量为25KD或26KD的重链，和5KD的轻链，；另一种是单链形式，分子量为
46、31KD9。有报道，在昆虫卵如蚊子卵中含有组织蛋白酶B成分，其在脂肪体内合成，参与胚胎发育时卵黄蛋白的水解过程；棉铃虫的卵内具有半胱氨酸蛋白酶，氨基酸序列分析后，鉴定其为组织蛋白酶B，作用与蚊子卵中的CB相同1011。在研究曼氏血吸虫降解寄主血红蛋白酶类时发现，这些酶均含有半胧氨酸蛋白酶结构域，梅氏新贝尼登虫也吸取寄主血液，也有半胧氨酸蛋白酶结构域，因此推断本研究的基因所编码蛋白也具有降解寄主血红蛋白的作用。2材料和方法21材料211原料与试剂1菌株A宿主大肠杆菌DH10B由本实验室保存B大肠杆菌BL21PLYSS或BL21PLYSE由本实验室保存2质粒PBLUESCRIPTIISK由本实验室
47、保存3工具酶ARTAQDNA聚合酶TAKARA公司B各种限制性内切酶TAKARA公司CT4DNA连接酶TAKARA公司4主要化学试剂A100BPDNAMAKERTAKARA公司B1KBDNAMAKERTAKARA公司CGELEXTRACTIONKIT50DMEGA公司DDNALIGATIONKITVER2TAKARA公司EEB上海生物工程公司F胰蛋白胨和酵母提取物上海生物工程公司G琼脂粉上海生物工程公司H琼脂糖GENETECHI氨苄青霉素上海生物工程公司J卡那霉素上海生物工程公司KIPTG上海生物工程公司L蛋白预染MARKER上海生物工程公司M溴酚兰上海生物工程公司NTEMED上海生物工程公司
48、OTRIS上海生物工程公司P甘油浙江中星化工试剂有限公司QDTT上海生物工程公司R马斯亮蓝R250上海生物工程公司SEDTA上海生物工程公司T甘氨酸上海生物工程公司（5）引物合成INVITROGEN公司合成（6）测序上海华大公司（7）实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA体表分离梅氏新贝尼登虫成虫。212主要仪器（1）台式离心机MICROCL17，THERMO（2）电子分析天平（上海科达测试仪器厂）（3）磁力加热搅拌器（国华企业）（4）DYY11B电泳仪（北京市六一仪器厂）（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳仪
49、（BIORAD）（6）恒温培养箱（上海实验仪器厂有限公司）（7）涡旋振荡器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）（8）PCR仪（MASTERCLERPERSONAL，EPPENDORF）（9）凝胶成像系统（UVP，W/VISIONWORKS）213主要试剂及其配制1菌体培养及保存所用试剂ALB液体培养基NACL05，酵母抽提物05，胰蛋白胨1，用NAOH调PH至74，在151BFIN（1034X105）高压蒸汽灭菌20分钟。BLB固体培养基LB液体培养基中加入琼脂至15，高压灭菌。CSOC培养基2W/VTRYPTONE，05W/VYEASTEXTRACT，005W/VNACL，25MMKCL10MMMGCL2，20MMGLUCOSE，配制量100ML。D10甘油加10ML甘油于适量水中，加水定容至100ML过压灭菌后于4保存，备用。2琼脂糖电泳缓冲液50XTAETRIS242G，冰乙酸571ML，05MOLLEDTA（PH80）100ML，加水定容至1L。22方法221实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄
