1、1本科毕业论文系列开题报告生物技术增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达一、选题的背景与意义随着生命科学和医学研究的不断深入，研究者们迫切需要一种能够在活体中表达且易于检测的报告基因，目前常用的报告基因主要有分泌型胎盘磷酸酯酶SECRETEDEMBRYOALKALINEPHOSPHATASE，SEAP基因、半乳糖苷酶GALACTOSIDASE基因、葡糖苷酸酶GLUCOSIDASE，GUS基因、萤火虫荧光素酶LUCIFERASE，LUC基因等，但这些基因的检测方法并不理想，它们都需要底物和辅助因子，因而在活体中的应用受到限制。而绿色荧光蛋白基因作为一类新型的报告基因，它在蓝光或长紫外光的激发下
2、，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光。作为报告基因，GFP是能在活细胞中表达的发光蛋白；作为荧光标记分子，GFP既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害。而且新的研究表明，GFP是一个良好的细胞间信号传递的动态标记分子,可以跟踪观测第二信使。增强型绿色荧光蛋白EGFP是GFP的一个突变体，发出的荧光强度要比GFP大六倍以上，且EGFP具有敏感的标记检测率，又无放射性的危害，比GFP更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。目前，在利用一些原核表达载体进行基因表达研究，常常遇到外源基因表达与否不能迅速得知，纯化过程中对各分离组分需进行多次电
3、泳检测，才能进行后续工作，花费大量时间。因此，构建以绿色荧光蛋白为标记的原核表达载体能够为外源基因表达的检测提供一种简单而直观的方法。本课题旨在利用增强型绿色荧光蛋白为标记构建一个可以直观地观察蛋白表达情况的原核表达载体PET28AEGFP，并了解该载体的表达情况，探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容（1）设计引物，通过PCR法扩增EGFP目的片段；（2）将EGFP目的片段与PMD19TVECTOR连接，构建PMD19EGFP载体；2（3）将PMD19EGFP与PET28A双酶切，回收大小片段之后连接，构建PET28AEGFP载体；（4）将P
4、ET28AEGFP重组载体转化至大肠杆菌，获得转EGFP基因的大肠杆菌；（5）IPTG诱导，并在诱导不同时间观察转EGFP基因大肠杆菌中绿色荧光蛋白的表达量。解决的主要问题（1）EGFP目的片段的克隆；（2）PMD19EGFP载体的构建；（3）PET28AEGFP重组载体的构建；（4）转EGFP基因的大肠杆菌的获得及原核表达条件的研究。三、研究的方法与技术路线研究的方法（1）根据EGFP序列特征设计一对引物FEGFP和REGFP，分别含有NDEI和ECORI酶切位点，通过PCR扩增EGFP目的片段。（2）将EGFP片段与与PMD19TVECTOR连接，转化至大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆，PCR
5、扩增及鉴定之后，用质粒小量抽提试剂盒制备PMD19EGFP质粒DNA。（3）将PMD19EGFP与PET28A用NDEI、ECOR同时进行双酶切，回收大、小片段，之后连接，转化大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆并鉴定，鉴定完毕后用质粒小量抽提试剂盒抽提PET28AEGFP质粒。（4）将重组载体PET28AEGFP转化至大肠杆菌BL21，筛选阳性克隆PCR扩增及鉴定。将转EGFP基因的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，经IPTG诱导表达，在诱导的0H，1H，2H，3H，4H，5H收集诱导表达的菌体，并置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。研究技术路线PMD19EGFP质粒的抽提PMD19
6、EGFP质粒的双酶切回收小片段（750BP）PCR扩增EGFP序列PMD19T与EGFP的连接转化至大肠杆菌DH5阳性克隆的筛选及鉴定引物设计与合成PET28A质粒的抽提PET28A质粒的双酶切回收大片段3四、研究的总体安排与进度（1）2010年5、6月根据EGFP序列特征设计引物，引物由上海生物工程公司合成，以PFGCEGFP为模板，通过PCR法扩增EGFP目的片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。（2）2010年7、8月用胶回收试剂盒回收目的基因片段，与PMD19TVECTOR连接，转化至大肠杆菌DH5中，筛选阳性克隆，进行PCR扩增及鉴定。将转化菌液进行扩大培养，用质粒小量抽提试剂盒制备
7、PMD19EGFP质粒DNA。（3）2010年9、10月将质粒PMD19EGFP与PET28A同时进行双酶切，回收大、小片段并连接，将连接好的载体转化至大肠杆菌DH5中，筛选阳性克隆并鉴定，鉴定完毕后用质粒小量抽提试剂盒抽提PET28AEGFP质粒。（4）2010年11、12月将重组载体PET28AEGFP转化至大肠杆菌BL21中，筛选阳性克隆并鉴定，鉴定完毕后，将转EGFP基因的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，经IPTG诱导表达，在诱导的0H，1H，2H，3H，4H，5H收集诱导表达的菌体，并置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。52011年3、4、5月数据整理和论文的撰写。
8、4五、主要参考文献1张敏,任慧霞报告基因的应用研究进展J食品与药品,2007,9945482杨英军,周鹏转基因植物中的标记基因研究新进展J遗传,2005,2734995043SHEENJ,HWANGS,NIWAY,KOBAYASHIH,GALBRAITHDWGREENFLUORESCENETPROTEINASANEWVITALMARKERINPLANTCELLSJTHEPLANTJOURNAL,1995,587777844陈伟伟,郭正红,康升云,等增强型绿色荧光蛋白在集胞藻6803中的表达J西北植物学报,2009,292022902335张鲲,马媛媛,邹少兰,等大肠杆菌双顺反子表达载体中绿色荧
9、光蛋白表达水平的研究J生物技术通报,2009,560636王伟,孟超,朱平,等绿色荧光蛋白标记的表达载体PHISEGFP的构建J中国生物工程杂志,2005,25935397陆惠萍,周凤娟,孙树汉绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达J第二军医大学学报,1997,1854064088黄国存,张寒霜,高鹏,李俊兰,朱生伟,孙敬三GFP基因在棉花转化中的应用J遗传,2001,2321311349HUW,CHENGCLEXPRESSIONOFAEQUOREAGREENFLUORESCENTPROTEININPLANTCELLSJFEBSLETTERS,1995,36933133410程在全,丁玉梅,
10、曾黎琼绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究J云南植物研究,2002,24334135111汪恒英,周守标,常志州,马艳,秦卫华绿色荧光蛋白GFP研究进展J生物技术,2006,143717312薛启汉绿色荧光蛋白GFP的特性及其在分子生物学研究中的应用江苏农业学报J,1999,151525813ASPURIAET,OOURAC,CHENGQ,UCHIMIYAH,OONOYGFPACCUMULATIONCONTROLLEDBYANAUXINRESPONSIVEPROMOTERASANONDESTRUCTIVEASSAYTOMONITOREARLYAUXINRESPONSEJPLA
11、NTCELLREPORTS,2002,21525714郝敏,邢达,谢波,周俊初,曾列先含有绿色荧光蛋白基因的质粒载体的构建及其在水稻白叶枯细菌中的表达J激光生物学报,2002,11642743015EPELBL,PADGETTHSPLANTVIRUSMOVEMENTPROTEINDYNAMICSPROBEDWITHAGFPPROTEINFUSIONJGENE,1996,1737579516黄乐天,蒋琳兰,宋进锋绿色荧光蛋白基因导入胡萝卜愈伤组织并获得表达J生物技术,2006,162182017赵彤,黄丛林,张秀海,于荣,王永勤,吴忠义玉米叶绿体表达载体构建及绿色荧光蛋白基因瞬时表达检测J华北农
12、学报,2008,234727618HUB,ZHANGCJ,BAAWOK,QINR,COLEGJ,LEEJA,CHENXXZEBRAFISHK5PROMOTERDRIVENGFPEXPRESSIONASATRANSGENICSYSTEMFORORALRESEARCHJORALONCOLOGY,2010,4631376毕业论文文献综述生物技术绿色荧光蛋白在分子生物学研究中的应用摘要绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP基因一种能发出绿色荧光的新型报告基因，它在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能自发地形成绿色荧光，并且能在在细胞内稳定表达。GFP
13、对受体细胞无毒性，对目的基因没有影响，可以很方便的对活体进行观察，来检测基因的表达。因此，GFP已经成为生命科学领域中研究得最广泛的蛋白质之一。本文就GFP在分子生物学中的应用作简要阐述。关键词绿色荧光蛋白；标记；载体引言在研究基因的表达调控、信号转导、蛋白运输与定位时常用荧光物质或报告基因作为标记。分泌型胎盘磷酸酯酶SECRETEDEMBRYOALKALINEPHOSPHATASE，SEAP基因、半乳糖苷酶GALACTOSIDASE基因、荧火虫荧光素酶LUCIFERASE，LUC基因是目前常用的一些报告基因，但是它们需要底物和辅助因子，否则不能用于检测，因而在活体中无法更好地应用1。绿色荧光
14、蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP是近年发展起来的一种新型的报告基因，它能自发地发出绿色荧光，荧光反应也不是酶反应，因此受到了广泛的关注2。作为报告基因，GFP不需要任何外源性底物和辅助因子，无毒、稳定、无污染，而且可以在紫外或蓝光激发下直接观察3。因此，GFP在分子生物学研究中有广阔的应用前景，本文就其在分子生物学的应用做一简要综述。1绿色荧光蛋白概述11绿色荧光蛋白的性质在水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内存在一类生物发光蛋白绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP4。它在紫外或蓝色波长范围的光线激发下，依靠钙离子的帮助能够发出绿色荧光，并在活
15、细胞内稳定表达。GFP的分子量为27KD，由238个氨基酸构成，由11个片层组成桶状构成疏水中心，第6567位氨基酸SERTYRGLY形成发光团，是主要发光的位置。发光的过程中还需要冷光蛋白AEQUORIN的帮助，且这个冷光蛋白与钙离子可产生交互作用，由此产生绿色荧光5。它在395NM处具有最大吸收高峰，在475NM处还有一个肩峰6。712绿色荧光蛋白的优点作为一种新型的标记分子，GFP具有诸多优点而备受关注1便于检测无需底物和辅助因子提供能源，可被光直接激发；2荧光特性稳定对高温60、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂等大多具有较强抗性，对光漂白有较强的耐受性，3对细胞或组织无毒害GFP与目的基因融
16、合后对目的基因的表达没有多大的影响，也不会损害宿主细胞；4通用性和共用性GFP的表达不受宿主范围的限制，也没有细胞种类和部位的限制；5分子量小，便于构建载体与其他序列一起构建载体之后不至于使载体过大影响转化频率；6可进行活细胞定时定位观察能够在细胞和生物体内对目标基因的表达产物进行实时示踪，对高等动物或植物进行转基因标记和体内观察；7不受假阳性干扰，灵敏度高其他生物本身不含有GFP，不会出现假阳性结果，比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率；8易于得到突变体可通过不同的方法得到GFP的突变体，如荧光强度增加或者颜色改变等；9能制成永久标本光漂白和福尔马林的固定都不容易破坏GFP的荧光，利用
17、这个特点可以制成标本用于长期保存711。2绿色荧光蛋白在分子生物学中的应用21用于构建基因工程的表达载体因为GFP的生物发光无种属组织特异性，所以人们可根据自己的实验目的在不同表达系统中能随意构建表达GFP的表达载体12。陆惠萍等利用绿色荧光蛋白基因GFPS65T构建载体并使其在大肠杆菌中高效表达13。沈关心等构建了WEE1HU与GFP融合基因表达载体，并对其在真核细胞的表达及生物学效应进行研究14。SUMMERS等用GFP作为报告基因构建两种转录型的穿梭报告载体并用于丝状蓝藻的研究15。GUPTA等利用GFP构建载体并使其在大肠杆菌重组突变体中的过量表达16。程克棣等构建了能在大肠杆菌中表达
18、融合蛋白的通用表达载体PHISEGFP，并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法17。孙丽萍等构建了人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体并转染HEK293T细胞，为进一步深入探索NOD2启动子的始动原因及调控机制奠定基础18。姜伯乐等将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体PLAFR6上，构建报告质粒PLZY，为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料19。何淑雅等将携带人脆性X相关基因1（FRAGILEXRELATEDGENEL，FXR1）与EGFP的融合并构建表达载体，为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制
19、奠定基础20。张鲲等构建了大肠杆菌双顺反子表达载体，并中研究绿色荧光蛋白的表达水平21。唐金宝等利用增强型8绿色荧光蛋白基因作筛选标记构建克隆载体22。22作为报告基因用于转基因研究GFP作为报告基因可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。GFP作为一种标记蛋白也可以完全替代抗生素或除草剂以筛选转基因组织。SHEEN报道，通过电击ELECTROPORATION转染玉米叶肉原生质体，有50原生质体观察到GFP荧光23。黄国存等将GFP作报告基因，将外源基因导入棉花，能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定24。HU报道，用
20、电击法和PEG法同时转化玉米和拟南芥菜ARABIDO原生质体，GFP在玉米原生质体中表达25。程在全等用GFP作报告基因用基因枪法转化水稻愈伤组织，在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白基因的表达26。黄乐天等通过冻融法将含有GFP基因的重组表达载体转入到根癌农杆菌中，再利用根癌农杆菌介导的方法将GFP基因导入到胡萝卜愈伤组织细胞中，经过除菌和抗性筛选后在荧光显微镜观测到被转化的愈伤组织在受蓝光激发后发出绿色荧光，证明GFP基因在胡萝卜愈伤组织细胞中获得了表达27。23蛋白融合将蛋白质的N端或C端与GFP融合之后仍能保持其天然蛋白的特性，因此GFP可作为一种“荧光标签”用来研究蛋白质在细胞中的定位、
21、转移、相互作用等。BAULCOMBE等将马铃薯X病毒和融合蛋白载体PVXGFP接种菸草NCLEVELANDII12D后，在紫外光下可以直接观察到病毒侵染的确切部位28。KHLER等用拟南芥叶绿体蛋白的RECA序列连接GFP，结果表明GFP标记的RECA序列存在于叶绿体的基质中29。25研究病原物与宿主之间的相互作用将病原体用GFP活体标记，可以在全真条件而不是模拟条件下实时研究病原体与宿主的关系。郝敏等利用GFP所发出的绿色荧光，来追踪白叶枯细菌侵染水稻的路径，以及检测水稻在遭受白叶枯病害时的一些生理生态变化30。EPEL等将GFP基因与烟草花叶病毒运动蛋白基因在烟草花叶病毒中融合表达，观察到
22、病毒运动蛋白与宿主细胞肌动蛋白的结合，表明是病毒与植物组分间的相互作用促进了病毒在植物体内的局部传播31。陆勇军等将高量表达绿色荧光蛋白基因的自发突变质粒转化至嗜肺军团菌，以转化菌饲喂嗜热四膜虫BF1株后，在荧光显微镜下能清楚观察到细菌在细胞内的形态变化、增殖和裂解宿主细胞的过程，这为研究嗜肺军团菌与原生动物寄主的相互关系提供了一种简单而直观的方法32。展望9虽然GFP在分子生物学的众多研究领域有着广泛的应用，但目前看来仍有其不足，GFP的检测灵敏度还不够高，有待进一步改进，天然的GFP形成具有活性的形式这个过程十分缓慢，需要通过折叠和加工，某些GFP不能耐受紫外光的漂白和破坏作用，虽然自发的
23、荧光现象还十分微弱，但也存在于许多物种之中，这些都会使GFP的检测受到不同程度的干扰。但随着生物技术的发展，对GFP的不断改进和理论研究的进一步深入，我们有理由相信，GFP一定会给我们带来更多的应用价值，并进一步揭开生命的未解之谜。参考文献1张敏,任慧霞报告基因的应用研究进展J食品与药品,2007,9945482杨英军,周鹏转基因植物中的标记基因研究新进展J遗传,2005,2734995043杨慧敏,李文刚,吴高锋,等绿色荧光蛋白的研究进展J中国畜牧兽医生理生化,2008,35829324唐孝青,李斌,伍小兵,等绿色荧光蛋白及其应用的研究进展J陕西农业科学,2007,11231245段青,王倩
24、,祁庆生绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用J生命的化学,2007,27148516余林辉,姚伟,段真珍,等绿色荧光蛋白及其在农作物研究中的应用J安徽农业科学,2008,36361578815790,158017汪恒英,周守标,常志州,等绿色荧光蛋白GFP研究进展J生物技术,2004,14370738吴瑞,张树珍绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用J分子植物育种,2005,322402449ALKAABIKM,YAFEAA,ASHRAFSSEFFECTOFPHONTHERMALANDCHEMICALINDUCEDDENATURATIONOFGFPJAPPLIEDBIOCHEMISTRYANDB
25、IOTECHNOLOGY,2005,126214915610MAREKH,SLAVOMR,VLADISLAVCGREENFLUORESCENTPROTEINASAVITALMARKERFORNONDESTRUCTIVEDETECTIONOFTRANSFORMATIONEVENTSINTRANSGENICPLANTSJPLANTCELLTISSUEANDORGANCULTURE,2006,86330331811刘艳丽,鲁澄宇绿色荧光蛋白的特性及其在药学研究中的应用J药物生物技术,2009,16217017412杨健,任碧轩,唐恩洁绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定J川北医学院学报,2005,621
26、2312513陆惠萍,周凤娟,孙树汉绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达J第二军医大学学报,1997,18540640814沈关心,周华荣,张晓晖,等绿色荧光蛋白与WEE1HU融合基因的构建及其真核表达J中国生物化学与分子生物学报,2001,17671571915ARGUETAC,YUKSEKK,SUMMERSMCONSTRUCTIONANDUSEOFGFPREPORTERVECTORSFORANALYSISOF10CELLTYPESPECIFICGENEEXPRESSIONINNOSTOCPUNCTIFORMEJJOURNALOFMICROBIOLOGICALMETHODS,2004,5
27、918118816JAINS,TEOTIAS,GUPTAMNPURIFICATIONOFGREENFLUORESCENTPROTEINOVEREXPRESSEDBYAMUTANTRECOMBINANTESCHERICHIACOLIJPROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION,2004,36768117程克棣,王伟,孟超,等绿色荧光蛋白标记的表达载体PHISEGFP的构建J中国生物工程杂志,2005,259353918孙丽萍,胡巢凤,周羽竝人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建J现代免疫学,2008,28321922319姜伯乐,赵宇,刘建元,等含有增强型绿色荧光
28、蛋白报告子的载体系统的构建J广西农业生物科学,2008,27434334820何淑雅,马云,杨阳,等FXR1基因与增强型绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达J现代生物医学进展,2009,71265126721张鲲,马媛媛,邹少兰大肠杆菌双顺反子表达载体中绿色荧光蛋白表达水平的研究J生物技术通报,2009,5606322唐金宝,陈永,梁淑娟,等利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记克隆载体的构建及鉴定J中国海洋药物杂志,2009,282283123SHEENJ,HWANGS,NIWAY,ETALGALBRAITHDWGREENFLUORESCENTPROTEINASANEWVITALMARKERINP
29、LANTCELLSJTHEPLANTJOURNAL,1995,5877778424黄国存,张寒霜,高鹏,李俊兰,朱生伟,孙敬三GFP基因在棉花转化中的应用J2001,23213113425HUW,CHENGCLEXPRESSIONOFAEQUOREAGREENFLUORESCENTPROTEININPLANTCELLSJFEBSLETTERS,1995,36933133426程在全,丁玉梅,曾黎琼,等绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究J云南植物研究,2002,24334135127黄乐天,蒋琳兰,宋进锋绿色荧光蛋白基因导入胡萝卜愈伤组织并获得表达J生物技术,2006,162
30、182128BAULCOMBEDC,CHAPMANS,CRUZSSJELLYFISHGREENFLUORESCENTPROTEINASAREPORTERFORVIRUSINFECTIONSJTHEPLANTJOURNAL,1995,71045105329KHLERRH,CAOJ,ZIPFELWR,ETALEXCHANGEOFPROTEINMOLECULESTHROUGHCONNECTIONSBETWEENHIGHERPLANTPLASTIDSJSCIENCE,1997,276203920421130郝敏,邢达,谢波,等含有绿色荧光蛋白基因的质粒载体的构建及其在水稻白叶枯细菌中的表达J激光生物学
31、报,2002,11642743031EPELBL,PADGETTHSPLANTVIRUSMOVEMENTPROTEINDYNAMICSPROBEDWITHAGFPPROTEINFUSIONJGENE,1996,173757932陆勇军,黄绍松,徐润林用绿色荧光蛋白研究军团菌与寄主的相互关系J微生物学通报,2006,332212412本科毕业设计（20_届）增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达13目录摘要12ABSTRACT错误未定义书签。引言31材料与方法511材料5111菌株与质粒5112工具酶及试剂5113培养基512方法5121引物设计及合成5122目的基因EGFP编码序列的克隆51
32、23PCR扩增产物的鉴定6124目的片段回收6125连接6126大肠杆菌DH5感受态细胞的制备6127转化7128阳性克隆的筛选与鉴定7129PMD19EGFP质粒的抽提81210重组质粒PET28AEGFP的构建及鉴定81211转EGFP基因大肠杆菌的获得及原核表达条件的研究102结果与分析1121目的基因EGFP编码片段的克隆1122PMD19EGFP质粒的构建和鉴定1123重组质粒PET28AEGFP的构建和鉴定1224转EGFP基因的大肠杆菌原核表达条件的研究133讨论144结论15致谢错误未定义书签。参考文献错误未定义书签。1摘要绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTE
33、IN，GFP基因是在细胞内稳定表达，在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因。增强型绿色荧光蛋白ENHANCEDGREENFLUORESCENTPROTEIN，EGFP是GFP的一个突变体，发出的荧光强度要比GFP大六倍以上，更适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。本实验旨在构建以EGFP为标记的原核表达载体，观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况，探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性。根据已知的EGFP序列，设计一对引物FEGFP和REGFP，分别含有NDEI和ECORI酶切位点，通过PCR从PF
34、GCEGFP质粒中克隆EGFP编码序列，并将其与PMD19TVECTOR连接，以此构建PMD19EGFP。将其双酶切后与PET28A连接，得到重组质粒PET28AEGFP。转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，在诱导的不同时间收集菌体沉淀，并置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。经IPTG诱导后，细菌培养物在紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。本实验成功构建了原核表达载体PET28AEGFP，为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础。关键词增强型绿色荧光蛋白；重组质粒；大肠杆菌；原核表达2ABSTRACTTHEGREENFLUORESCENTPROTEINGFPG
35、ENEISANEWREPORTERGENEWHICHCANBEEXPRESSEDINLIVINGCELLS,UNDEREXCITATIONOFLONGUVLIGHTORBLUELIGHT,GREENFLUORESCENCECANBEEMITTEDWITHOUTOTHEREXTERNALSUBSTRATETHEENHANCEDGREENFLUORESCENTPROTEINEGFPISAMUTANTOFGFP，WHICHCANEMITSIXTIMEHIGHERFLUORESCENCEASAREPORTERGENE,ITISMORESUITABLEFORSTUDYINGGENEEXPRESSIONA
36、NDREGULATION,CELLDIFFERENTIATIONANDPROTEINLOCALIZATIONANDTRANSFERINLIVINGORGANISMSTHEPURPOSEOFTHISSTUDYWASTOCONSTRUCTTHEEGFPLABELLEDPROKARYOTICEXPRESSIONVECTORANDDETECTTHEEXPRESSIONOFEGFPINESCHERICHIACOLIACCORDINGTOTHEOPENREADINGFRAMEOFKNOWNEGFPGENE,APAIROFPRIMERS,WHICHCONTAINSTWORESTRICTIONENZYMESI
37、TESNDEANDECORRESPECTIVELY,WASDESIGNEDAFRAGMENTOFEGFPGENEWASOBTAINEDBYPCRAMPLIFICATIONFROMPFGCEGFPPLASIMDTHENTHEPCRPRODUCTSWERELINKEDTOPMD19TVECTORSOASTOCONSTRUCTPMD19EGFPITWASDIGESTEDANDLIGATEDWITHPET28A,TOCONSTRUCTTHERECOMBINANTPLASMIDPET28AEGFPTHEPET28AEGFPWASTRANSFORMEDINTOECOILBL21INDUCEDBYIPTG,
38、THEBACTERIALDEPOSITONWASCOLLECTEDATDIFFERENTTIMEANDEXCITEDBYLONGWAVEULTRAVIOLETLIGHTTODETECTTHEEXPRESSIONOFEGFPECOILBL21SHOWEDBRIGHTLYGREENFLUORESCENTWHENEXCITEDBYLONGWAVEULTRAVIOLETLIGHTAFTERINDUCTIONTHEPROKARYOTICEXPRESSIONVECTORPET28AEGFPWASCONSTRUCTEDSUCCESSFULLYTHISWORKLAIDTHEEXPERIMENTALFOUNDA
39、TIONFORTHEUSEOFEGFPASAREPORTERANDSELECTIVEMARKERKEYWORDEGFPRECOMBINANTPLASMIDECOLIPROKARYOTICEXPRESSION3引言在水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内存在一类生物发光蛋白绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP1。它在紫外或蓝色波长范围的光线激发下，依靠钙离子的帮助能够发出绿色荧光，并在活细胞内稳定表达。GFP的分子量为27KD，由238个氨基酸构成，由11个片层组成桶状构成疏水中心，第6567位氨基酸SERTYRGLY形成发光团，是主要发光的位置。发光的过程中还需要冷光蛋白
40、AEQUORIN的帮助，且这个冷光蛋白与钙离子可产生交互作用，由此产生绿色荧光2。它在395NM处具有最大吸收高峰，在475NM处还有一个肩峰3。作为一种新型的标记分子，GFP具有诸多优点而备受关注1便于检测无需底物和辅助因子提供能源，可被光直接激发；2荧光特性稳定对高温60、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂等大多具有较强抗性，对光漂白有较强的耐受性，3对细胞或组织无毒害GFP与目的基因融合后对目的基因的表达没有多大的影响，也不会损害宿主细胞；4通用性和共用性GFP的表达不受宿主范围的限制，也没有细胞种类和部位的限制；5分子量小，便于构建载体与其他序列一起构建载体之后不至于使载体过大影响转化频率；6
41、可进行活细胞定时定位观察能够在细胞和生物体内对目标基因的表达产物进行实时示踪，对高等动物或植物进行转基因标记和体内观察；7不受假阳性干扰，灵敏度高其他生物本身不含有GFP，不会出现假阳性结果，比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率；8易于得到突变体可通过不同的方法得到GFP的突变体，如荧光强度增加或者颜色改变等；9能制成永久标本光漂白和福尔马林的固定都不容易破坏GFP的荧光，利用这个特点可以制成标本用于长期保存48。正是由于GFP具有上述优点，它在分子生物学和细胞生物学研究中有广阔的应用前景。不同种的蛋白质N端或C端能与GFP融合，但其天然蛋白的特性又不会受到影响，因此，GFP能用来研究蛋
42、白质在细胞中的定位、转移、相互作用，作为一种“荧光标签”，它可用于研究。BAULCOMBE等将马铃薯X病毒和融合蛋白载体PVXGFP接种菸草NCLEVELANDII12D后，在紫外光下可以直接观察到病毒侵染的确切部位9。KHLER等用拟南芥叶绿体蛋白的RECA序列连接GFP，结果表明GFP标记的RECA序列存在于叶绿体的基质中10。GFP常常用于构建基因工程的表达载体。SUMMERS等用GFP作为报告基因构建两种转录型的穿梭报告载体并用于丝状蓝藻的研究11。GUPTA等利用GFP构建载体并使其在大肠杆菌重组突变体中的过量表达12。孙丽萍等构建了人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体并转染H
43、EK293T细胞，为进一步深入探索NOD2启动子的始动原因及调控机制奠定基础13。姜伯乐等将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体PLAFR6上，构建报告质粒PLZY，为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料14。何淑雅等将携带人脆性X相关基因1FRAGILEXRELATEDGENEL，FXR1与EGFP的融合并构建表达载体，为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制奠定基础15。张鲲等构建了大肠杆菌双顺反子表达载体，并中研究绿色荧光蛋白的表达水平16。尽管GFP作为报告基因具有许多优点，但天然的GFP仍存在一些缺陷而使其无法更好
44、地应用于科学研究，如发光较弱，耐光性差。为了解决上述问题，需要对GFP作出一些改进，主要包括以下两个方面1改变GFP的荧光强度，2改变GFP的颜色。通过点突变的方法将SER65THR，增强了荧光强度，另外，PHE64LEU点突变使GFP在哺乳动物细胞37的培养条件下能更有效地进行构象折叠。向GFP引入遗传突变可以获得不同颜色的变种，改变GFP颜色的点突变主要针对其6567的发光位点及构象上接近发光位点的氨基酸1719。增强型GFPENHANCEDGFP是其中最具有代表性的一种，它的荧光强度显著提高。因此更适合作为报告基因来研究基因的表达、信号转导、蛋白运输与定位等。4在蛋白水平检测导入的外源基
45、因是否表达的过程中，我们往往需要通过多次的蛋白纯化和电泳检测的步骤或者通过WESTERN杂交的方法，整个过程耗时长，步骤繁琐，无法迅速得知蛋白是否表达。本实验可以利用增强型绿色荧光蛋白为标记构建一个可以直观地观察蛋白表达情况的原核表达载体PET28AEGFP，试图在大肠杆菌中克隆并高效表达该载体，以利进一步研究其生化特，并进一步探索其作为报告基因的优势，为其在以后的研究奠定基础。51材料与方法11材料111菌株与质粒大肠杆菌DH5、TOP10和BL21菌株均为本实验室保存。质粒PFGCEGFP，PET28A为本实验室保存，质粒PMD19T购自TAKARA公司。112工具酶及试剂小量胶回收试剂盒
46、、质粒小量抽提试剂盒及IPTG均购自上海生物工程公司，限制性内切酶ECORI、NDEI、SOLUTIONI、DNAMARKER均购自TAKARA公司，其他所用试剂均为国产分析纯。113培养基采用LB培养基，其他试剂及培养基均由本实验室配制。12方法121引物设计及合成根据GENBANK中已知的EGFP编码序列，自行设计1对引物FEGFP、REGFP。上游引物FEGFP5CCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3，含有NDEI酶切位点，下游引物REGFP5GGAATTCCTAGGATCCCTTGTACAGCT3，含有ECORI酶切位点。引物由上海生物工程公司合成。122目的基因EGFP编
47、码序列的克隆以实验室存有的质粒PFGCEGFP为模板，分别以引物FEGFP、REGFP进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下10EXTAQBUFFER25LDNTPS（25MMEACH）2LFEGFP1LREGFP1L质粒DNA1LTAKARAEXTAQ（5U/L）05LDDH2O17LTOTAL25L反应程序设置如下6循环次数温度时间1943MIN34941MIN551MIN721MIN1728MIN14保存123PCR扩增产物的鉴定称取02G琼脂糖置于锥形瓶中，加入50TAE电泳缓冲液50ML，置于微波炉中加热至琼脂糖完全融化，一般煮沸三次，配制成1琼脂糖凝胶溶液。将EB加入锥形瓶中并混匀
48、，之后倒入选定的胶膜中，插入相应的梳子。过20MIN后待凝胶完全凝固，小心拔出梳子，将凝胶放入装有50TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳液刚没过胶面（1MM），取5L待电泳的DNA样品与1L的6LOADINGBUFFER在封口膜上混匀，用移液枪将样品加到梳孔中，以100V电泳20MIN左右，在紫外灯下观察结果和拍照。124目的片段回收1打开水浴锅，将温度设到5560，待温度上升后将ELUTIONBUFFER放在水浴锅里预热。2将空的EPPENDORF管置于电子天平上称重，记下重量之后将切下的胶块放入管中再称重量，两者相减，若两者之差小于300MG（针对1琼脂糖凝胶溶液），再加入300LBIND
49、INGBUFFER，放入水浴锅10MIN。3将管内的溶液转移到带有离心柱的收集管内，放置2MIN，之后10000RPM离心1MIN，弃去外套管内的废液。4加入500L的WASHSOLUTION，10000RPM离心1MIN，弃去外套管内的废液。5重复上述步骤之后倒掉外套管内的废液后离心10000RPM离心30S，打开盖子，在温室下晾干10MIN。6将离心柱放入EPPENDORF管中，加入40L的已经预热的ELUTIONBUFFER。7放置2MIN后，10000RPM离心1MIN后放置20冰箱中保存。125连接使用PMD19TVECTOR（TAKARA，日本）进行连接反应，4连接过夜。反应体系如下SOLUTION5L回收产物5LPMD19TVECTOR05LTOTAL105L126大肠杆菌DH5感受态细胞的制备1取70甘油保存的DH5菌种20L，接种于20MLLB液体培养基中，37下220250RPM振荡过夜。2取上述菌液20L，接种于20MLLB液体培养基中，37下220250RPM振荡254H，至OD8000506。取上述菌液1ML于无菌EPPENDORF管中，盖上盖，4下5000RPM离心5MIN。3去上清，吸干管底残留的L
