1、本科毕业论文系列开题报告生物工程曼氏无针乌贼凝集素基因关键结构域重组子的构建一、选题的背景与意义凝集素是一类具有糖结合专一性，可促使细胞凝集的蛋白质。广泛分布于植物、动物和微生物中。近年来凝集素研究发展迅速，凝集素对糖的特异结合性以及凝集素在不同生物或同一生物不同组织中的分布多样性决定了它在动植物以及微生物体内有重要而特殊的生物学功能。它们在科学的多个领域中均有重要应用价值。不同来源凝集素的特点、分布及作用机制各不相同。凝集素有促有丝分裂、细胞识别、抗虫、抗病毒等诸多方面的作用。在生物养殖、生物工程、生理活动调控、疾病防治等方面展示出广阔的应用前景。而关于曼氏无针乌贼的凝集素的作用目前尚不明确
2、，更没有人做过关于它的研究。所以进行曼氏无针乌贼凝集素基因关键结构域重组子的构建，对于研究它的特殊生物学功能具有重大的意义。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题1曼氏无针乌贼总RNA的提取2凝集素基因EST序列的获得3凝集素基因同源性以及进化分析4进行凝集素关键结构域的重组三、研究的方法与技术路线1曼氏无针乌贼总RNA的提取2曼氏无针乌贼CDNA文库的构建3序列分析与目的基因片段的获得4基因的扩增与验证5基因的同源性分析6基因的进化分析7重组表达载体的构建8重组表达载体转化宿主菌四、研究的总体安排与进度201010201011毕业论文选题201011201012进行文献查阅和资料收集，制定具体
3、研究计划和试验方案。201012201112撰写综述和开题报告及任务书。201012开题报告答辩2011120112实地采样、试验研究、数据处理和分析2011220113完成外文翻译2011320114论文撰写2011420115提交并答辩五、主要参考文献1SHARON，NRESEARCHMTIBS1993182212SHARON，NLISLECTINESASCELLRECOGNITIONJMOLECULESSCIENCE，19892462273GARBERN，GEUMPELU，BELZA，ETALSPECIFICITYOFTHEDGALACTOSEBINDINGLECTINOFPSEUDOM
4、ONASAERUGINOSAANDITSSTRONGBINDINGTOHYDROPHOBICDERIBATIEVESOFDGALACTOSEANDTHIOGALACTOSEBIOCHEMJBIOPHYSACTA，1992，11163313334郭锰凝集素的双功能性质凝集素新定义J国外医学分子生物学分册，199012355张世明，崔贞福，吴孟超内源性凝集素介导的MTX拟糖蛋白对肝癌细胞的靶向杀伤作用J生物化学与生物物理学报，1991，2365436陈惠黎糖复合物的结构和功能M上海上海医科大学出版社，19977曾麒燕周德义凝集素的寡糖链结构分析及临床应用综述J广西科学，2001，821301348
5、孙册谈谈凝集素作用的基本原理和糖蛋白的寡糖结构J生命的化学，1994，14236379胡业华凝集素的生物学研究J江西教育学院学报自然科学，2001，226474910周柔丽哺乳动物凝集素及其生物学作用J生命的化学，1995，151121511时丽冉凝集素研究进展J衡水师专学报，2001，31464812李润植，高武军，季道藩等朝鲜天南星凝集素的分离及抗棉蚜效应分析J棉花学报，2000，121545613潘科，黄炳球，侯学文植物凝集素在病虫害防治中的研究发展J农药市场信息，200216101114刘勇，倪汉祥，孙京瑞抗虫活性物质的研究与应用前景J植物保护，2000，173“26626915杨晓泉
6、，张水华植物蛋白中的抗营养因子J食品科学，2001，39116SHARON，NLISHRESEARCHTIBS1987，1248817SHARON,N，LISHLEGUMELECTINSALARGEOFHOMOLOGOUSPROTEINSJFASEBJ，1990，43198320818STEFENROSEN，KLAASSJOLLEMA，MARTENVEENHUIS，ETALACYTOPLASMICLECTINPRODUCEDBYTHEFUNGUSARTHROBOTRYSOLIGOSPORAFUNCTIONSASASTORAGEPROTEINDURINGSAPROPHYTICANDPARASIT
7、ICGROWTHJMICROBIOLOGY，1997，1432593260419GATEHOUSEAMR，POWELLKS，PEUMANSWJ，ETALINSECTICIDALPROPERTIESOFPLANTLECTINSTHEIRPOTENTIALINPLANTPROTECTIONABIOMEDICALPERSPECTIVESLECTINSCNEWYORKTAYLORANDFRANCIS1995353717毕业论文文献综述生物工程凝集素研究概况摘要凝集素是一类具有糖结合专一性，可促使细胞凝集的蛋白质。广泛分布于植物、动物和微生物中。近年来凝集素研究发展迅速，凝集素对糖的特异结合性以及凝集素
8、在不同生物或同一生物不同组织中的分布多样性决定了它在动植物以及微生物体内有重要而特殊的生物学功能。它们在科学的多个领域中均有重要应用价值。不同来源凝集素的特点、分布及作用机制各不相同。凝集素有促有丝分裂、细胞识别、抗虫、抗病毒等诸多方面的作用。在生物养殖、生物工程、生理活动调控、疾病防治等方面展示出广阔的应用前景。关键词凝集素；生物学功能；应用前景；作用机制1凝集素概述11分布与分类凝集素（LECTIN）首先是从豆科植物种子中发现的，后来其来源扩展到根、茎、叶各个部份，进而扩展到非豆科植物、动物、微生物，包括真核生物、原核生物、单细胞生物、多细胞生物，几乎无处不在12。已发现的微生物凝集素一般
9、分布在体表，胞质中少见。PSEUDOMONASAERUGINOSA是原核生物中仅知的分布于胞质内的凝集素3。对于凝集素通常有3种分类法（1）根据其在细胞中存在的部位分可溶性和膜结合两类，前者主要存在于胞浆，核质中也有；（2）根据单糖对凝集素活性的抑制作用来研究凝集素的糖结合专一性，以此可分为6类34与D甘露糖或D葡萄糖结合；与2乙酰氨基2脱氧D葡萄糖结合；与2乙酰氨基2脱氧D半乳糖结合；与D乳糖结合；与L岩藻糖结合；与唾液酸结合；（3）根据其来源分，这是人们较为习惯和常用的分类法，此法将凝集素分为植物包括细菌、真菌等微生物凝集素和动物凝集素，也有称前者为外源性凝集素，后者为内源性凝集素5。12
10、凝集素结构凝集素是一类专一识别糖并与之非共价、可逆地结合的蛋白质或糖蛋白。凝集素的生物学作用，主要是由凝集素对糖的专一识别发生的，而凝集素与糖的结合是通过其分子肽链中的活性部位，即专一结合糖的区域实现的，与凝集素分子中共价结合的糖无关6。现有的研究资料表明，虽然来源各异的凝集素在结构上确有不同，但一些同源家族的凝集素却具有一些共同的结构性质，这正是凝集素最新分类法的基础。构成凝集素的蛋白质和糖两个部分，蛋白质占的百分比大，糖的含量较少7。一般都是几个单糖构成寡糖链，寡糖链再以两类方式与蛋白质肽链相连。一类糖链与肽链通过GLCNAC1ASN连接，称血清型糖蛋白，亦称天冬酰胺ASN连接或N连接的糖
11、蛋白；另一类糖链与肽链由GALNAC1SER/THR连接为粘蛋白型糖蛋白，亦称O连接糖蛋白8。N连接的糖蛋白合成过程是以长萜醇DOLICHO1作为糖链载体，在糖基转移酶的作用下，先将UDPGLCNAC分子中的GLCNAC转移至长萜醇，然后再逐个加上糖基，形成N连接寡糖链。此寡糖链再作为一个整体和天冬酰胺残基的酰胺氮连结；而O连接糖蛋白合成过程中不需要糖链载体，只在GALNAC转移酶作用下，将UDPGALNAC中GALNAC基转移至多肽链的丝氨酸或苏氨酸的羟基上，形成O连接寡糖9。2凝集素的作用21动物凝集素动物凝集素包括C型和S型，以膜整合及水溶性的形式存在，通过与体液中的糖配体如某些激素、细
12、胞因子、生长调节因子等或细胞表面的糖配体相互作用，进行识别与结合来对细胞产生信号作用，引发细胞产生一系列反应，参与动物体的发育、内环境的稳定以及机体防御等功能10。动物凝集素在无脊椎动物的免疫识别中具有重要作用。如贝类只有细胞免疫而无体液免疫，血细胞表面的凝集素是它们识别异己的因子。这些细胞借助凝集素的作用，对病原体加以识别，并具有化学趋化性使之向病原体移动，伴随着吸附作用最终将病原体吞噬11。研究表明，鱼类凝集素通过有效地识别和结合异己物质，提高吞噬细胞对异己物质的吞噬、杀灭作用。可作为防止外来微生物等入侵鱼体的一道防线。22植物凝集素对植物凝集素的专一性研究表明，外源多糖可能是许多植物凝集
13、素最可能的受体，外源多糖包括真菌或植物病毒表面、昆虫或草食动物肠道细胞表面的糖蛋白12。基于凝集素和糖的相互作用，植物凝集素被认为和糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控等有关13。植物凝集素可抵御细菌、真菌、病毒等病原体的入侵，具有杀虫作用。自然界中凝集素介导的防御反应主要以两种方式进行一种是通过直接作用来抵御摄食者的入侵；另一种是植物凝集素对病毒、细菌和真菌的间接作用方式14。而决定它们抗性的就是它们的糖结合活性，即通过识别并结合入侵者上的糖结构，来参与抵抗植物病原和摄食者15。23微生物凝集素凝集素对微生物来说是与寄主发生关系的决定因素。目前发现的微生物凝集素大多通过其
14、壁上凝集素对糖基的识别来实现对宿主的感染，所以它们往往在吸附作用中发挥重要作用16。微生物凝集素与其他生物凝集素一样，它们可与细胞膜表面的单糖或寡糖进行专一性的结合，以识别外来的各种信息。微生物凝集素正是通过这种专一性来识别寄主细胞膜上的糖链，与寄主发生关系。如不具有细胞壁凝集素的细菌突变株失去致病力17。细菌凝集素的抑制剂可以降低细菌的侵染几率。类似的，真菌和病毒的凝集素也与糖复合物结合有关。流感病毒可以与末端是唾液酸的受体结合，用唾液酸酶来处理受体细胞可以使其对流感产生抗性。同时，一些细菌的凝集素参与吞噬作用，这具有重要的临床价值和研究意义。有研究表明，微生物凝集素还具有贮存蛋白的功能，这
15、些凝集素多分布在微生物体的胞质内18。3凝集素基因的克隆从1982年HOFFMAN等克隆了第一个凝集素基因到现在已克隆了大量的凝集素基因，仅植物凝集素基因就达222个，它们大多编码豆科凝集素和单子叶植物甘露糖结合凝集素家族成员。通过对已克隆的凝集素基因的序列分析人们获得了凝集素在分类上更为详尽的信息。同样通过对凝集素基因的序列分析，有可能从基因水平上揭示凝集素功能的作用机制。比如豌豆种子中PSL基因由于有对碱性亮氨酸拉链蛋白BZIP高度亲和力的启动子，从而解释了豌豆根或植株其它部位的凝集素的量在整个生命循环过程中达微克数量级19。人们已得到在体外具抗真菌活性的凝集素基因，凝集素抗虫基因更是已应
16、用于基因工程。4展望凝集素已在许多领域有广泛的应用，在分子结构等方面亦积累了大量资料，可是它的功能一直困绕着人们。如前所述凝集素的功能研究已取得了有意义的进展，凝集素的功能与其多重结合性质是分不开的。如果能深入的了解微生物凝集素在生物体内所扮演的角色，调整和发挥凝集素对人们生产和生活有利的一面，将有利于发掘和利用微生物这一资源宝库以造福人类。通过对凝集素基因的克隆研究发现编码凝集素家族蛋白的基因都互有联系，这些同源基因很可能是由一个先祖基因在复制和分离过程中产生的，这就使不同的蛋白质分子获得了不同的防御性质。这可能意味着一些由凝集素基因调控的事件在同一基因家族甚至不同家族中发挥作用。近年来人们
17、探讨较多的是通过凝集素基因扩大根瘤菌宿主范围的可能性，如果能在这方面取得突破的话，在理论和实践上具有重要意义。参考文献1SHARON，NRESEARCHMTIBS1993182212SHARON，NLISLECTINESASCELLRECOGNITIONJMOLECULESSCIENCE，19892462273GARBERN，GEUMPELU，BELZA，ETALSPECIFICITYOFTHEDGALACTOSEBINDINGLECTINOFPSEUDOMONASAERUGINOSAANDITSSTRONGBINDINGTOHYDROPHOBICDERIBATIEVESOFDGALACTOS
18、EANDTHIOGALACTOSEBIOCHEMJBIOPHYSACTA，1992，11163313334郭锰凝集素的双功能性质凝集素新定义J国外医学分子生物学分册，199012355张世明，崔贞福，吴孟超内源性凝集素介导的MTX拟糖蛋白对肝癌细胞的靶向杀伤作用J生物化学与生物物理学报，1991，2365436陈惠黎糖复合物的结构和功能M上海上海医科大学出版社，19977曾麒燕周德义凝集素的寡糖链结构分析及临床应用综述J广西科学，2001，821301348孙册谈谈凝集素作用的基本原理和糖蛋白的寡糖结构J生命的化学，1994，14236379胡业华凝集素的生物学研究J江西教育学院学报自然科学，
19、2001，226474910周柔丽哺乳动物凝集素及其生物学作用J生命的化学，1995，151121511时丽冉凝集素研究进展J衡水师专学报，2001，31464812李润植，高武军，季道藩等朝鲜天南星凝集素的分离及抗棉蚜效应分析J棉花学报，2000，121545613潘科，黄炳球，侯学文植物凝集素在病虫害防治中的研究发展J农药市场信息，200216101114刘勇，倪汉祥，孙京瑞抗虫活性物质的研究与应用前景J植物保护，2000，173“26626915杨晓泉，张水华植物蛋白中的抗营养因子J食品科学，2001，39116SHARON，NLISHRESEARCHTIBS1987，1248817SH
20、ARON,N，LISHLEGUMELECTINSALARGEOFHOMOLOGOUSPROTEINSJFASEBJ，1990，43198320818STEFENROSEN，KLAASSJOLLEMA，MARTENVEENHUIS，ETALACYTOPLASMICLECTINPRODUCEDBYTHEFUNGUSARTHROBOTRYSOLIGOSPORAFUNCTIONSASASTORAGEPROTEINDURINGSAPROPHYTICANDPARASITICGROWTHJMICROBIOLOGY，1997，1432593260419GATEHOUSEAMR，POWELLKS，PEUMANS
21、WJ，ETALINSECTICIDALPROPERTIESOFPLANTLECTINSTHEIRPOTENTIALINPLANTPROTECTIONABIOMEDICALPERSPECTIVESLECTINSCNEWYORKTAYLORANDFRANCIS1995353717本科毕业设计（20_届）曼氏无针乌贼凝集素基因关键结构域重组子的构建目录摘要ABSTRACT1引言1311曼氏无针乌贼13111曼氏无针乌贼病害研究现状13112无脊椎动物的免疫防御机制1312凝集素14121凝集素的分布与分类14122凝集素的结构14123凝集素的作用152实验材料及仪器1621主要化学试剂1622仪器
22、设备1623实验材料及其处理163实验方法1731实验用品的预处理1732曼氏无针乌贼总RNA的提取1733曼氏无针乌贼CDNA文库的构建1734序列分析与目的基因片段的获得1735编码凝集素基因成熟肽DNA的扩增和验证18351PCR产物的回收纯化1836感受态细胞的制备、连接及转化19361感受态细胞的制备19362感受态细胞的连接19363感受态细胞的转化1937序列比较与系统进化分析1938重组表达载体的构建1939重组表达载体转化宿主菌214实验结果2241曼氏无针乌贼总RNA的提取2242序列分析与目的片段（EST）的获得2243关键结构域重组子构建2344凝集素基因的同源性分析2
23、345凝集素基因的进化分析2546重组质粒DNA的酶切255讨论与总结27参考文献28致谢错误未定义书签。【摘要】曼氏无针乌贼是我国重要的水产经济动物，近年来养殖规模不断扩大，产量持续增加。随着养殖规模的扩大以及养殖环境的日益恶化而导致了大量疾病的发生，严重制约了曼氏无针乌贼养殖业的健康发展。可见，疾病的控制与预防对曼氏无针乌贼养殖业的可持续发展具有举足轻重的作用。研究表明，曼氏无针乌贼是依靠由细胞免疫和体液免疫构成的固有免疫系统来对病原进行识别和清除的。所以，固有免疫机制的研究有助于推动曼氏无针乌贼病害防治工作的开展。本实验在提取曼氏无针乌贼总RNA的前提下，构建了CDNA文库，并根据凝集素
24、基因EST序列进行了凝集素结构域的预测，129位氨基酸为其信号肽结构，36264位氨基酸为其结构域部分。对所得到的结构域进行重组子的构建，并成功实现了重组载体对大肠杆菌DE3的转化。【关键词】曼氏无针乌贼；固有免疫；凝集素；重组子【ABSTRACT】THECUTTLEFISHSEPIELLAMAINDRONIISONEOFTHEMOSTCOMMERCIALLYIMPORTANTNATIVESPECIESFORAQUACULTUREINDUSTRYINCHINAWITHTHEEXPANSIONOFFARMINGANDTHEFARMINGENVIRONMENTHASLEDTOTHEDETERIOR
25、ATIONOFALARGENUMBEROFDISEASES,SEVERELYRESTRICTEDTHESQUIDMANNEEDLEHEALTHYDEVELOPMENTOFAQUACULTUREVISIBLE,DISEASECONTROLANDPREVENTIONOFNEEDLEFREESQUIDMANTHESUSTAINABLEDEVELOPMENTOFAQUACULTUREPLAYSANIMPORTANTROLERESEARCHSHOWSTHATCUTTLEFISHMANNEEDLEISTORELYONTHECELLULARANDHUMORALIMMUNITYTOTHEINNATEIMMUN
26、ESYSTEMCONSISTINGOFTHEIDENTIFICATIONANDREMOVALOFPATHOGENSTHEREFORE,MECHANISMSOFINNATEIMMUNITYMANSONIHELPTOPROMOTEDISEASEPREVENTIONANDTREATMENTWITHOUTNEEDLESSQUIDWORKINTHEPRESENTSTUDY,LECTINDOMAINWASPREDICTEDACCORDINGTOLECTINGENEESTSEQUENCES,129AMINOACIDSTRUCTUREISITSSIGNALPEPTIDEANDAMINOACIDS36264PA
27、RTISITSDOMAINTHECONSTRUCTIONOFRECOMBINANTWASWORKEDOUTONTHEBASISOFTHEDOMAINANDFINALYTOACHIEVETHETRANSFORMATIONOFTHERECOMBINANTVECTORINECOLI【KEYWORDS】SEPIELLAMANDRONI；INNATEIMMUNE；LECTIN；RECOMBINANT1引言11曼氏无针乌贼曼氏无针乌贼（SEPIELLAMAINDRONI），俗名花粒子、麻乌贼、血墨。隶属于软体动物门、头足纲、十腕目、乌贼科（唐逸民等，1991）。曼氏无针乌贼生殖群体密集，年产量45万吨（2
28、007中国渔业统计年鉴），主要渔场在中国的浙江近海和福建东北近海（唐逸民，吴常文等，1986）。干制品称“螟蜅鲞”或“南鲞”为海味佳品，是海味市场的重要品种，经济价值巨大。随着曼氏无针乌贼人工养殖的迅猛发展，其病害日趋严重，尤其是细菌性与病毒性疾病的频繁爆发。严重影响了曼氏无针乌贼的养殖效益。因此，疾病预防和控制对曼氏无针乌贼养殖业的可持续发展具有举足轻重的作用。111曼氏无针乌贼病害研究现状外界病原体、环境和寄主本身三方面相互作用往往是疾病发生的根源（张寿山，华鼎可等，1974）。所以解决病害问题，需要从提高养殖品种本身的抗逆性、改善养殖生态环境及控制病原侵袭三方面入手。而宿主本身的抗性决定
29、了环境变化或者病原的入侵能否导致疾病的发生（MYDLARZLD等，2006）。因此，培育抗逆性强的优质种苗在疾病预防方面显得特别重要。其中，增强曼氏无针乌贼的抗逆性、解决种质问题的主要手段是开展遗传育种学的研究和应用。但是传统的遗传选育需要较长时间进行优良性状分离，并建立高品质的家系。而从分子水平研究控制曼氏无针乌贼优良性状的基因类型无疑将会极大推动遗传选育工作的开展。因此，从分子水平开展免疫学研究，了解曼氏无针乌贼的免疫防御机制，将为曼氏无针乌贼抗病品系的培育及健康养殖提供理论基础。112无脊椎动物的免疫防御机制免疫系统分为固有免疫和获得性免疫（LEESY等，2002）。是动物在漫长的进化过
30、程中为了抵抗外来物质的入侵而形成的。“自己”与“非己”的识别是免疫系统的基本功能。获得性免疫是脊椎动物特有的免疫方式，能够选择性地进行病原识别和清除，因此也被称为适应性免疫或者特异性免疫（陈政良，朱锡华等2000）。获得性免疫是个体在生命过程中，受病原微生物及其代谢产物中的抗原性物质刺激后主动产生或接受免疫效应因子后被动获得的（BEUTLERB等，2004）。固有免疫是一种古老的免疫防御方式，在所有的多细胞动物中都有发现，是一种先天免疫形式。固有免疫是最普遍、反应速度最快的，甚至被认为是最重要的免疫类型（BEUTLERB等，2004）。固有免疫包括机体对病原感染的感知（识别）以及机体对入侵病原
31、的清除两个方面（BEUTLERB等，2004）。所以，描述固有免疫应答的有效性包括三个基本方面首先机体识别“自我”和“非我”；其次，机体通过防御反应将入侵者杀死或者使其失去致病力；最后，机体识别并能清除自己的受损害的或者病态的细胞。这要求固有免疫必须具备三种组成（MYDLARZLD等，2006）细胞介导的吞噬；体液反应激活引起的调理作用、黑化和凝结；体液的抗菌物质。对入侵物的识别或感知是免疫防御的起始，将最终引发效应物反应系统，包括吞噬作用、包被（掩）作用、激活蛋白酶级联反应和黑化作用以及抗菌肽的合成等，从而清除或消灭入侵物。这些反应机制传统上被分为细胞免疫和体液免疫（HOFFMANNJA等，
32、1999），实际上细胞免疫和体液免疫两者是密切相关的，如体液因子可在血淋巴细胞中合成并释放出来，而细胞反应又受体液因子的介导和影响（徐海圣，徐步进等，2001）。12凝集素凝集素是一类具有糖结合专一性，可促使细胞凝集的蛋白质。广泛分布于植物、动物和微生物中。近年来凝集素研究发展迅速，凝集素对糖的特异结合性以及凝集素在不同生物或同一生物不同组织中的分布多样性决定了它在动植物以及微生物体内有重要而特殊的生物学功能。它们在科学的多个领域中均有重要应用价值。不同来源凝集素的特点、分布及作用机制各不相同。凝集素有促有丝分裂、细胞识别、抗虫、抗病毒等诸多方面的作用。在生物养殖、生物工程、生理活动调控、疾病
33、防治等方面展示出广阔的应用前景。121凝集素的分布与分类凝集素（LECTIN）首先是从豆科植物种子中发现的，后来其来源扩展到根、茎、叶各个部份，进而扩展到非豆科植物、动物、微生物，包括真核生物、原核生物、单细胞生物、多细胞生物，几乎无处不在（SHARONN等，1993）。已发现的微生物凝集素一般分布在体表，胞质中少见。PSEUDOMONASAERUGINOSA是原核生物中仅知的分布于胞质内的凝集素（GARBERN等，1992）。对于凝集素通常有3种分类法（1）根据其在细胞中存在的部位分可溶性和膜结合两类，前者主要存在于胞浆，核质中也有；（2）根据单糖对凝集素活性的抑制作用来研究凝集素的糖结合专
34、一性，以此可分为6类（郭锰等，1990）与D甘露糖或D葡萄糖结合；与2乙酰氨基2脱氧D葡萄糖结合；与2乙酰氨基2脱氧D半乳糖结合；与D乳糖结合；与L岩藻糖结合；与唾液酸结合；（3）根据其来源分，这是人们较为习惯和常用的分类法，此法将凝集素分为植物包括细菌、真菌等微生物凝集素和动物凝集素，也有称前者为外源性凝集素，后者为内源性凝集素（张世明，崔贞福，吴孟超等，1991）。122凝集素的结构凝集素是一类专一识别糖并与之非共价、可逆地结合的蛋白质或糖蛋白。凝集素的生物学作用，主要是由凝集素对糖的专一识别发生的，而凝集素与糖的结合是通过其分子肽链中的活性部位，即专一结合糖的区域实现的，与凝集素分子中共
35、价结合的糖无关（陈惠黎等，1997）。现有的研究资料表明，虽然来源各异的凝集素在结构上确有不同，但一些同源家族的凝集素却具有一些共同的结构性质，这正是凝集素最新分类法的基础。构成凝集素的蛋白质和糖两个部分，蛋白质占的百分比大，糖的含量较少（曾麒燕，周德义等，2001）。一般都是几个单糖构成寡糖链，寡糖链再以两类方式与蛋白质肽链相连。一类糖链与肽链通过GLCNAC1ASN连接，称血清型糖蛋白，亦称天冬酰胺ASN连接或N连接的糖蛋白；另一类糖链与肽链由GALNAC1SER/THR连接为粘蛋白型糖蛋白，亦称O连接糖蛋白（孙册等，1994）。N连接的糖蛋白合成过程是以长萜醇DOLICHO1作为糖链载体
36、，在糖基转移酶的作用下，先将UDPGLCNAC分子中GLCNAC转移至长萜醇，然后再逐个加上糖基，形成N连接寡糖链。此寡糖链再作为一个整体和天冬酰胺残基的酰胺氮连结；而O连接糖蛋白合成过程中不需要糖链载体，只在GALNAC转移酶作用下，将UDPGALNAC中GALNAC基转移至多肽链的丝氨酸或苏氨酸的羟基上，形成O连接寡糖（胡业华等，2001）。123凝集素的作用动物凝集素包括C型和S型，以膜整合及水溶性的形式存在，通过与体液中的糖配体如某些激素、细胞因子、生长调节因子等或细胞表面的糖配体相互作用，进行识别与结合来对细胞产生信号作用，引发细胞产生一系列反应，参与动物体的进化、内环境的稳定以及机
37、体防御等功能（周柔丽等，1995）。动物凝集素在无脊椎动物的免疫识别中具有重要作用。如贝类只有细胞免疫而无体液免疫，血细胞表面的凝集素是它们识别异己的因子。这些细胞借助凝集素的作用，对病原体加以识别，并具有化学趋化性使之向病原体移动，伴随着吸附作用最终将病原体吞噬（时丽冉，2001）。研究表明，鱼类凝集素通过有效地识别和结合异己物质，提高吞噬细胞对异己物质的吞噬、杀灭作用。可作为防止外来微生物等入侵鱼体的一道防线。对植物凝集素的专一性研究表明，外源多糖可能是许多植物凝集素最可能的受体，外源多糖包括真菌或植物病毒表面、昆虫或草食动物肠道细胞表面的糖蛋白（李润植，高武军，季道藩等，2000）。基于
38、凝集素和糖的相互作用，植物凝集素被认为和糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控等有关（黄炳球，侯学文等，2002）。植物凝集素可抵御细菌、真菌、病毒等病原体的入侵，具有杀虫作用。自然界中凝集素介导的防御反应主要以两种方式进行一种是通过直接作用来抵御摄食者的入侵；另一种是植物凝集素对病毒、细菌和真菌的间接作用方式（刘勇，倪汉祥等，2000）。而决定它们抗性的就是它们的糖结合活性，即通过识别并结合入侵者上的糖结构，来参与抵抗植物病原和摄食者（杨晓泉等，2001）。凝集素对微生物来说是与寄主发生关系的决定因素。目前发现的微生物凝集素大多通过其壁上凝集素对糖基的识别来实现对宿主的感染
39、，所以它们往往在吸附作用中发挥重要作用（SHARONN等，1987）。微生物凝集素与其他生物凝集素一样，它们可与细胞膜表面的单糖或寡糖进行专一性的结合，以识别外来的各种信息。微生物凝集素正是通过这种专一性来识别寄主细胞膜上的糖链，与寄主发生关系。如不具有细胞壁凝集素的细菌突变株失去致病力（SHARONN等，1990）。细菌凝集素的抑制剂可以降低细菌的侵染几率。类似的，真菌和病毒的凝集素也与糖复合物结合有关。流感病毒可以与末端是唾液酸的受体结合，用唾液酸酶来处理受体细胞可以使其对流感产生抗性。同时，一些细菌的凝集素参与吞噬作用，这具有重要的临床价值和研究意义。有研究表明，微生物凝集素还具有贮存蛋
40、白的功能，这些凝集素多分布在微生物体的胞质内（STEFENROSEN等，1997）。2实验材料及仪器21主要化学试剂TRIZOL购自INVITROGEN公司；MMLV和RQ1DNASEI购自PROMEGA公司；TAQDNA聚合酶、核酸MARKER、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物克隆载体体系PMD18TVECTOR购自TAKARA公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；其他常规试剂购自上海生工生物工程公司；各种常见菌株为本实验室保存。22仪器设备凝胶分析系统PHARMACIABIOTECH，IMAGEMASTERVDSPCR仪MJRESEARCH，PTC100紫外可见分光光度计B
41、ECKMANDU650凝胶电泳系统BIORAD，WIDEMINISUBTMCELL高速冷冻离心机HERAEUS，BIOFUGE28RS微量离心机SIGMA，113超低温冰箱SANYOMDF382E电泳仪JIMX恒温水浴锅DK8D超净工作台YJ电热恒温干燥箱DHG9023A电热恒温培养箱DHP9052普通冰箱ELECTROLUXBCD247E制冰机SCOTSMANFRIMONT高压灭菌锅LDZX50KB微量可调移液器EPPENDORF23实验材料及其处理所购买的曼氏无针乌贼在232暂养一周，然后进行实验。抽取胰脏1ML，加入等体积抗凝剂（RODRIGUEZJ等，1995），然后42000G离心5
42、MIN，收集胰脏细胞供后续RNA提取用。3实验方法31实验用品的预处理塑料制品使用一次性无RNASE塑料制品。对国产塑料制品，用01DEPC水浸泡处理过夜，高压蒸汽灭菌30MIN。将灭菌的塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。玻璃器皿用铝箔包裹后180烘烤4H备用（母昌考，2009）。32曼氏无针乌贼总RNA的提取1）分离相将备用样品从超低温冰箱中取出，室温融化。每1MLTRIZOL加入200L氯仿。剧烈摇动15S，然后在1530环境中放置5MIN。4条件下12000G离心15MIN。离心后，混合物分为淡红色的酚仿相、中间相和无色的上层水相。RNA存在于水相中。2）RNA沉淀将水相移至EPPENDO
43、RF管中，加入等体积异丙醇，缓慢混匀。样品在1530条件下放置5MIN，以12000G4离心10MIN。3）RNA洗涤弃上清。加1ML75的乙醇悬浮样品，7500G4离心5MIN，重复一次。4）RNA溶解小心去掉上清，室温干燥，加入无RNASE水溶解RNA。5）RNA产率和质量鉴定用双蒸水稀释RNA，于紫外分光光度计检测A280、A260的相对吸收值。RNA产率通过测定样品在A260下的紫外吸收值获得，RNA浓度（G/ML）A260稀释倍数37G/ML，1个单位大约相当于40G单链RNA/ML。纯净RNA的A260/A280在1822之间。同时采用电泳检查RNA的完整性（母昌考，2009）。3
44、3曼氏无针乌贼CDNA文库的构建利用INVITROGEN公司的TRIZOL试剂从曼氏无针乌贼血淋巴细胞中提取总RNA，按照ZAPCDNASYNTHESISKIT及ZAPCDNAGIGAPACKIIIGOLDCLONINGKIT（STRATAGENE）试剂盒使用说明书分离纯化MRNA，合成第一链、第二链，补平CDNA末端，连接ECOR接头并磷酸化，XHO限制酶消化，获得了两端具有不同粘性末端的完全单向CDNA。将该CDNA片段插入UNIZAPXRVECTOR（LAMBDAPHAGE，INVETROGEN）。经包装，滴度测定和扩增，利用EXASSISTHELPERPHAGE和SOLR菌株从UNIZ
45、APXRVECTOR上体外切割PBLUESCRIPT噬菌粒，大规模提取质粒DNA，最后进行PCR测序（母昌考，2009）。34序列分析与目的基因片段的获得曼氏无针乌贼CDNA文库EST序列的大规模测定文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3在MEGABACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件（ABI，ABD文件）数据经PHRED程序处理转化为序列文件（SEQ）和质量文件（SEQQUAL），依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用CROSSMACH程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13（准确率大于95）且长度大于100BP的序
46、列作为EST数据，具体参见基因表达序列标签（EST）数据分析手册（胡松年，2005）。将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成CONTIGS和SINGLETONS，分别将所获的CONTIGS与SINGLETONS在数据库中进行BLASTN和BLASTX分析，根据相似性分析结果分别找出凝集素基因同源的EST序列（母昌考，2009）。35编码凝集素基因成熟肽DNA的扩增和验证根据所得到的凝集素基因的EST序列（不含NDE和XHO的酶切位点）和表达载体PET21（）的序列特征（图31），设计特异性引物CB1（含有NDE酶切位点）和CB2（含有XHO酶切位点），以曼氏无针乌贼EST序列为模板，扩
47、增编码凝集素蛋白的基因片段。PCR反应程序为94变性5MIN，1个循环；94变性30S，60退火30S，72延伸45S，35个循环；72延伸10MIN，1个循环。PCR产物在10的琼脂糖凝胶中进行电泳，经过凝胶成像系统观察照相后切下特异性目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒纯化目的片段，连入PMD18T载体，转化TOP10F感受态细胞，然后通过PCR（使用特异性引物）筛选阳性克隆并进行测序。引物如下CB1CATATGCTGAGGTTCGAATACAAGCTCA（划线部分表示NDE）CB2CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAGGGGGCGTGCATGGAATGAGT（划线部分
48、表示XHO）图31表达载体PET21（）的多克隆位点区（NOVAGEN技术手册）351PCR产物的回收纯化1）PCR反应结束后，用10琼脂糖凝胶（含EB05G/ML）电泳分离目的片段，在紫外灯下将目的DNA片段切下，放入离心管中，称重；2）每100MG凝胶加入300L溶液I，65水浴10MIN，使凝胶完全溶化；3）将上述溶液转入收集管吸附柱内，室温放置2MIN后10000G离心1MIN；4）倒掉收集管中废液，在吸附柱内加入500L溶液II，于10000G离心1MIN；5）重复上一步，将吸附柱放入同一个收集管中，空柱12000G离心2MIN；6）将吸附柱放入15ML离心管中，在吸附柱中央加入30
49、L洗脱缓冲液进行洗脱，室温放置2MIN，12000G离心1MIN回收纯化的DNA片段。（母昌考，2009）36感受态细胞的制备、连接及转化361感受态细胞的制备1）从37培养1218H的TOP10F菌株的新鲜平板上挑取单菌落，接种到一个含有100MLLB培养基的1000ML烧瓶中。于37条件下，220RPM振荡培养36H。每隔2030MIN测量OD600值来检测生长情况。2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ML聚丙烯管（FALCON2070）中，在冰上放置10MIN，使培养物冷却至0。以下步骤均在无菌操作条件下完成。3）于42000G离心10MIN，弃上清。4）将管倒置1MIN以去除残留培养液。5）用10ML冰预冷的01MCACL2重悬沉淀，放置于冰上。6）于4用SORVALLGS3转头（或与其相当的转头）以2000G离心10MIN
