1、本科毕业论文系列开题报告生物技术纳米AL2O3对斑马鱼肝基因表达的影响一、选题的背景与意义纳米材料的生物安全性问题之所以受到科学家们的关注，是因为纳米材料特殊的物理化学性质可能会导致它们在生物体内的生理行为与常规物质不同，在环境中的行为也可能与常规物质不一样。目前纳米材料的生物效应、环境效应以及毒性和安全性的研究才刚刚起步，科学家们只对纳米TIO2、SIO2、碳纳米管、富勒烯和纳米铁粉等少数几种纳米材料的生物效应进行了初步研究。结果均表明这几种纳米材料对生命体有一定的毒性作用。如用吸入法和注入法将纳米TIO2导入小鼠、大鼠和豚鼠体内，发现TIO2能诱发肺部炎症，并在肺部严重沉积，难以清除；在紫
2、外光的作用下，纳米TIO2能加强GFSKS1鱼细胞中的DNA的损伤等。但是，纳米材料的毒性及其作用机理还远远未被充分揭示，金属纳米颗粒是其中的一种类型，工业上大量生产的金属纳米粒子对生物及环境的效应还是未知数，目前国内外对金属纳米颗粒的生物学效应研究较少，有报道表明纳米A12O3粉可小鼠使血清LDH活性明显增高；而纳米ZNO对雌性小鼠的肝、肾和心肌有轻度毒性；FE2O3纳米粒子在一定范围内可抑制HEPG2细胞增值，高剂量导致细胞线粒体膜电位下降，且细胞凋亡率显著增高。在对小鼠的研究中发现，FE2O3纳米颗粒可以穿过血脑屏障，血睾屏障和血眼屏障。同时，纳米FE2O3可诱导机体产生氧化应激反应，造
3、成组织的损伤作用，并能引起细胞DNA的断裂；CUO，ZNO，CUZNFE2O4，FE2O3，FE3O4，能导致肺上皮细胞中的DNA损伤。但对水生生物的影响只见有铜纳米粒子对斑马鱼的毒性作用和ZNO对嗜热四膜虫毒性的报道。斑马鱼是一种小型热带淡水鱼，生存能力强，遗传背景清楚，物种稳定，繁殖力强，胚胎透明，易于观察，基于自身的这些优点最早是作为胚胎发育生物学和遗传学的实验动物模型。自20世纪70年代末期，国外开始运用斑马鱼进行化学物的急性毒性研究，现在斑马鱼BRACHYDANIORERIO是国际标准化组织（ISO）推荐使用的标准化鱼类毒性试验动物。本课题正是基于这一点，选取斑马鱼作为实验动物，研究
4、纳米AL2O3对斑马鱼生理代谢的影响及其相关基因表达的研究,为该领域的研究提供参考，积累数据，更为深入了解纳米AL2O3的毒性及其机制提供基础依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1从转录水平研究纳米AL2O3对鱼的生物学效应，包括RNA含量的测定；2从分子水平研究纳米AL2O3对鱼的生物学效应，如HSP70等基因的表达。拟解决的主要问题1斑马鱼鱼肝RNA的提取及含量的测定；2检测热应激蛋白70（HSP70），金属调节转录因子（MTF1），多药耐药基因（MDR、NAKATPNKA等基因的表达。三、研究的方法与技术路线研究方法运用RTPCR技术，检测热应激蛋白70（HSP70），金属
5、调节转录因子（MTF1），多药耐药基因（MDR、NAKATPNKA等基因在纳米A12O3胁迫下的表达；研究技术路线四、研究的总体安排与进度2009年10、11月纳米A12O3处理斑马鱼；斑马鱼肝脏RNA提取；2010年3月至今RTPCR检测HSP70、MTF1、ACTIN等基因的表达水平；分析实验结果（目前该部分工作已经接近尾声）。五、主要参考文献1汤宏波纳米材料在生态环境方面的应用及潜在危害J新材料产业,2008,3251552GRAZYNABP,GOLIMOWSKIJ,PAWELLURBANNANOPARTICLESTHEIRPOTENTIALTOXICITY,WASTEANDENVIRO
6、NMENTALMANAGEMENTJWASTEMANAGEMENT,2009,29258725953汤洪宵环境纳米材料及其生态风险J水处理信息报导,2006,63124熊道文,李政,方涛纳米材料的水生态毒理学研究进展J环境污染与防治,2009,3145毕永红,胡征宇纳米材料对环境和健康的潜在危害J上海环境科学,2006,2552142176单志强纳米材料特性极其在环境保护领域的应用J环保材料,2005,2324267李泉,曾广斌纳米粒子J化学通报,1995,6298白伟,张程程,姜文君,等纳米材料的环境行为及其毒理学研究进展J生态毒理学报,2009,421741829ADAMSLK,LYOND
7、Y,ALVAREZPJJCOMPARATIVEECOTOXICITYOFNANOSCALETIO2,SIO2,ANDZNOWATERSUSPENSIONSJWATERRESEARCH,2006,40193527353210ZHANGY,CHENY,WESTERHOFFP,ETA1STABILITYOFCOMMERCIALMETALOXIDENANOPARTICLESINWATERJWATERRESEARCH,2008,428911CHENZ,MENGH,XINGGM,ETALACUTETOXICOLOGICALEFFECTSOFCOPPERNANOPARTICLESINVIVOJTOXICOL
8、OGYLERE,2006,163210912012白茹,王雯,金星龙,等纳米材料生物安全性研究进展J环境与健康杂志,2007,241596113田文静,白伟,赵春禄,等纳米ZNO对斑马鱼胚胎抗氧化酶系统的影响J中国环境科学,2010,30570570914玉晓微,赵占克,韩冰,等纳米二氧化硅对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究J生态毒理学报,2009,4567568115但志刚,倪瑾PEG功能化碳纳米管的制备及对斑马鱼的毒性实验研究J纳米加工工艺,2009,61303316刘信勇,朱琳多壁碳纳米管存在环境下PB、ZN对斑马鱼毒性的变化J生态毒理学报,2009,4682683317袭著革,林治卿纳米尺
9、度物质对生态环境的影响极其生物安全性的研究进展与展望J生态毒理学报,1320320818朱小山,朱琳,朗宇鹏,等富勒烯及其衍生物对斑马鱼胚胎发育毒性的比较J中国环境科学,2008,28217317719朱小山,朱琳,朗宇鹏,等人工纳米材料富勒烯（C60）低剂量长期暴露对鲫鱼的氧化伤害J环境科学,2008,29485586020ZHUSQ,OBERDORSTERE,HAASCHMLTOXICITYOFANENGINEEREDNANOPARTICLEFULLERNE,C60INTWOAQUATICSPECIES,DAPHNIAANDFATHEADMINNOWJMARENVIRONRES,2006,
10、62159毕业论文文献综述生物技术纳米材料对水体中鱼和浮游植物的毒性研究摘要纳米材料的应用前景广阔，在其广泛应用的同时也会对环境造成潜在的危害。纳米材料释放到环境中，对水体造成影响，从而对水体中的生物产生影响。本文从纳米材料自身的特性，其进入水环境后的行为以及国内外关于纳米材料对水生生物影响的研究进行阐述，并对进一步研究纳米材料对水生生物毒性机制提出展望。关键词纳米材料；水生生物；毒性机制1引言纳米材料具有良好的应用前景，应用范围广阔，已被广泛应用于各领域，包括涂料、废水处理、杀菌、化妆品、食品添加剂、生物医药等1。GRAZYNABP等2等报道，2004年纳米材料的年产量约为1000吨，每天有
11、超过800件的产品生产基于纳米材料，预计到2014年全球将超过15的产品在制造过程中使用纳米材料。然而，纳米材料在被广泛应用的同时将不可避免向环境中释放，可能造成潜在的环境危害和生态风险3。纳米材料进入环境后直接或间接地对水环境造成影响，从而对水体中的生物造成影响4。目前，纳米材料对水生生物的影响已有了相关报道，对其毒性5机制研究虽鲜有报道但也越来越受到重视。2纳米材料的特性纳米材料的结构单元尺寸介于1NM100NM之间，其特殊的理化性质取决于它的颗粒大小6、7、表面积和表面分布、化学构成纯度、结晶型、带点性、表面结构、溶解性、形状和聚集性等4。纳米材料的尺度与基因在同一数量级，纳米颗粒物可能
12、透过细胞膜干扰DNA的排列组合，从而产生变异导致生理障碍3。3纳米材料在水中的环境行为纳米材料进入水体后，可能对水生生态系统造成破坏，白伟等8报道相对弱的电解质溶液能打破富勒烯溶液的平衡，形成可沉降的聚集体，且随着离子强度的增大，其在多孔介质中的沉积更严重。FORTNER等发现，C60在水中形成稳定的聚集体，在较低的离子强度下可稳定存在数月。ADAMSLK等报道9，纳米材料在水中的颗粒大小要比厂家提供数据大，ZHANG等9研究得到，用超声波分散TIO210MIN后颗粒的平均粒径在200800NM。CHENG等11报道富勒烯和包覆的单臂碳纳米管在盐溶液、细胞培养介质、重建硬水和MINIQ水中稳定
13、。而在天然水体系中，纳米材料的水体行为受到更多因素的影响，因此更复杂。白伟等5报道，纳米材料在海水和河口环境中，海洋微表层对纳米材料有影响，海洋微表层中的酯类、碳水化合物、蛋白质等可包被亲脂性的纳米材料，水体和海岸带的水动力学和形态学特征在较大程度上决定纳米材料的分布，人工纳米材料的研究相对较少，目前只能从已知的纳米或微米颗粒的水中环境行为来推测。4纳米材料对水体中鱼和浮游植物的毒性研究41纳米材料对鱼的毒性研究纳米材料进入水体后，可能进入细胞或一些部位，直接对鱼类造成损伤。OBERDRSTER研究发现12，05MGL1的C60对幼年大嘴黑鲈鱼有大脑脂质过氧化损伤影响，并且腮组织中的还原型谷胱
14、甘肽含量降低，可能由于C60具有氧化还原活性和亲脂性，由此得出C60能对水生鱼类大脑造成损伤。田文静，赵宇亮等13将正常斑马鱼受精卵用纳米ZNO处理，预冷匀浆介质，离心，取上清液，测定蛋白含量和抗氧化指标包括GSH、SOD、CAT、MDA，发现GSH含量低于对照组，SOD活性随纳米ZNO浓度的增大而降低，CAT活性低于对照组，MDR含量高于对照组，由此得出纳米ZNO能对斑马鱼胚胎产生氧化损伤，使斑马鱼胚胎生理机能改变，不能成功孵化。玉晓微等14在对纳米二氧化硅处理斑马鱼胚胎发育毒性的研究中发现，常规二氧化硅对斑马鱼胚胎发育无明显毒性效应，而纳米二氧化硅对斑马鱼胚胎发育有明显抑制作用，可导致胚胎
15、孵化率显著降低，死亡率显著升高，幼鱼有畸形现象，还可使斑马鱼提前孵化但不能发育完全，现象表明纳米二氧化硅可能导致氧化损伤。但志刚，倪瑾用DSPEPEG2000NH2超声处理碳纳米管进行斑马鱼的毒性实验，得到PEG功能化碳纳米管使斑马鱼成鱼存活率降低，并造成卵凝结，胚胎或幼鱼发育延迟，甚至使斑马鱼心肌肿大、畸形和死亡。刘信勇，朱琳16在研究NC60TTA对斑马鱼的发育毒性时发现人工纳米材料暴露能对鱼类各组织器官产生氧化损伤。FEDERICI等11研究得到，纳米TIO2可在虹鳟鱼的消化道和腮中积累，并转运到其它组织器官中，从而对水生动物产生毒性作用。纳米材料的粒径大小也会对水生生物的毒性产生影响1
16、7，朱小山等18研究得到，人工纳米材料富勒烯的水溶性衍生物毒性弱于C60，而15MGL1NC60/TTA使斑马鱼胚胎和幼鱼发育延迟，存活率和孵化率下降，部分斑马鱼心包裹水肿和畸形C60。此外，朱小山等19还研究了长期暴露C60对鲫鱼的氧化损伤，结果显示，鲫鱼幼鱼不同组织对低剂量C60应激方式不同，GSH含量降低，CAT低浓度时被诱导，高浓度时活性下降，腮组织GSH含量随浓度变化先降低然后回升最后下降，结果表示，C60毒性机制之一为长期暴露引起机体组织的氧化应激反应，导致机体抗氧化能力衰竭。LOVERN等20研究了纳米TI02211020NM和纳米C60（072NM对大型藻的影响，纳米颗粒用四氢
17、呋喃过滤，并用超声波处理后，将藻暴露于其中，于不同的时间观察大型藻在纳米材料处理后的影响变化。发现，四氢呋喃过滤后的纳米TIO2和纳米C60均能导致大型藻死亡，呈量效关系；并且，经四氢呋喃处理的纳米C60毒性强于纳米TIO2。另外，用不同制备方法制备的纳米颗粒悬浮液毒性也有差别。超声波处理的纳米TI02和纳米C60对大型藻的影响明显比经四氢呋喃过滤处理的小。42纳米材料对浮游植物的毒性研究浮游植物是水环境中重要的生产者，在水生态系统中占有重要的地位。纳米材料对浮游植物的毒害能直接或间接地对水生态系统产生影响，此外，浮游植物对纳米材料的蓄积也能直接或间接的影响水生态系统。AUNA等22报导了纳米
18、材料对浮游植物有毒性效应，纳米C60为90MGL1时，对藻的生长速率抑制大约为30。藻与纳米C60颗粒团聚体接触后加速了藻细胞富集水体中的其他污染物。朱小山等23得到，SWCNTS、MWCNTS和纳米C60在96H斜生栅藻生长EC60分别为226、155、131MGL1，但这3种纳米材料对斜生栅藻毒性没有显著性差异。熊勤等24研究报道了，光照24H处理后，纳米沙藻布面积为008CM2L1，悬浮液中的微囊藻、鱼腥藻裸藻和衣藻的细胞密度分别下降为770、691、891和569。而在硅藻舟型藻中，叶绿素质量分数下降187。5展望目前，对于纳米材料对水生生物的毒性效应都由于使生物造成脂质过氧化损伤，从
19、而引起细胞膜破损，最终使细胞失去正常功能而引起细胞死亡或凋亡25。但是，纳米材料对水生生物的毒性机制研究目前还较少，尤其从分子角度研究纳米材料对水生生物的影响机制还鲜有报导。另外，由于纳米材料本生具有巨大的比表面积和高吸附能力，进入水环境中的行为非常复杂，若只单一考虑其对水生生物的影响而忽略对水中其它污染物的影响会较片面。因此，对于纳米材料对水生生物的毒性机制以及纳米材料进入水体后与水中污染物相互作用的研究还有待于进一步探索。参考文献1汤宏波纳米材料在生态环境方面的应用及潜在危害J新材料产业,2008,3251552GRAZYNABP,GOLIMOWSKIJ,PAWELLURBANNANOPA
20、RTICLESTHEIRPOTENTIALTOXICITY,WASTEANDENVIRONMENTALMANAGEMENTJWASTEMANAGEMENT,2009,29258725953汤洪宵环境纳米材料及其生态风险J水处理信息报导,2006,63124熊道文,李政,方涛纳米材料的水生态毒理学研究进展J环境污染与防治,2009,3145毕永红,胡征宇纳米材料对环境和健康的潜在危害J上海环境科学,2006,2552142176单志强纳米材料特性极其在环境保护领域的应用J环保材料,2005,2324267李泉,曾广斌纳米粒子J化学通报,1995,6298白伟,张程程,姜文君,等纳米材料的环境行为
21、及其毒理学研究进展J生态毒理学报,2009,421741829ADAMSLK,LYONDY,ALVAREZPJJCOMPARATIVEEO0RTOXICITYOFNANOSCALETIO2,SIO2,ANDZNOWATERSUSPENSIONSJWATERRESEARCH,2006,40193527353210ZHANGY,CHENY,WESTERHOFFP,ETA1STABILITYOFCOMMERCIALMETALOXIDENANOPARTICLESINWATERJWATERRESEARCH,2008,428911CHENZ,MENGH,XINGGM,ETALACUTETOXICOLOGI
22、CALEFFECTSOFCOPPERNANOPARTICLESINVIVOJTOXICOLOGYLERE,2006,163210912012白茹,王雯,金星龙,等纳米材料生物安全性研究进展J环境与健康杂志,2007,241596113田文静,白伟,赵春禄,等纳米ZNO对斑马鱼胚胎抗氧化酶系统的影响J中国环境科学,2010,30570570914玉晓微,赵占克,韩冰,等纳米二氧化硅对斑马鱼胚胎发育毒性的初步研究J生态毒理学报,2009,4567568115但志刚,倪瑾PEG功能化碳纳米管的制备及对斑马鱼的毒性实验研究J纳米加工工艺,2009,61303316刘信勇,朱琳多壁碳纳米管存在环境下PB
23、、ZN对斑马鱼毒性的变化J生态毒理学报,2009,4682683317袭著革,林治卿纳米尺度物质对生态环境的影响极其生物安全性的研究进展与展望J生态毒理学报,1320320818朱小山,朱琳,朗宇鹏,等富勒烯及其衍生物对斑马鱼胚胎发育毒性的比较J中国环境科学,2008,28217317719朱小山,朱琳,朗宇鹏,等人工纳米材料富勒烯（C60）低剂量长期暴露对鲫鱼的氧化伤害J环境科学,2008,29485586020ZHUSQ,OBERDORSTERE,HAASCHMLTOXICITYOFANENGINEEREDNANOPARTICLEFULLERNE,C60INTWOAQUATICSPECIE
24、S,DAPHNIAANDFATHEADMINNOWJMARENVIRONRES,2006,62S15921BAUNA,SORENSENSNETALTOXICITYANDBIOACCUMULATIONOFXENOBIOTICORGANICCOMPOUNDSINTHEPRESENCEOFAQUEOUSSUSPENSIONSOFAGGREGATESOFNANOC60JAQUATICTOXICOLOGY,2008,86322张万忠,刘景民,周智敏纳米TIO2的研究与应用进展J石油化工,2007,36111184118923朱小山,朱琳,田胜艳,等三种碳纳米材料对水生生物的毒性效应J中国环境科学,200
25、8,28324熊勤,刘治华,张一卉,等纳米杀藻布杀藻效果研究J环境科学,2006,27471571925张婷,唐萌纳米颗粒吸入毒性研究进展J卫生研究,2008,375633636本科毕业设计（20_届）纳米AL2O3对斑马鱼肝基因表达的影响目录1引言12实验材料与方法121实验材料1211实验用鱼1212主要仪器和设备2213主要试剂222培养方法223实验方法2231染毒2232组织提取2233RNA的提取2234基因检测3235数据处理33结果331肝组织在纳米AL2O3处理不同时间下总RNA的提取432常规RTPCR检测相关基因的表达水平4321纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中HSP70基因
26、表达的影响5322纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中MDR基因表达的影响5323纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中NKA基因表达的影响6324纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中MTF1基因表达的影响74讨论841纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中HSP70基因表达的机理分析942纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中MDR基因表达的机理分析943纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中NKA基因表达的机理分析944纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中MTF1基因表达的机理分析95总结和展望10致谢错误未定义书签。参考文献2附录错误未定义书签。摘要纳米材料的生物安全性问题之所以受到科学家们的关注，是因为纳米材料特殊的物理化学性质可能会导致它
27、们在生物体内的生理行为与常规物质不同，在环境中的行为也可能与常规物质不一样。本文应用浸浴法研究纳米AL2O3对斑马鱼肝基因热休克蛋白70HSP70、多药耐药基因MDR、NAKATPASENKA、金属调节转录因子1MTF1表达的影响。结果表明，经56MGL1的纳米AL2O3处理不同时间后，发现经过6H的稳定期后各基因表达量均上调，一般在12H小时达到最大值，用BIOSENSGELIMAGINGSYSTEM软件对所得电泳图进行分析，求出各基因的相对含量，得出斑马鱼肝脏中HSP70、MDR、NKA、MTF1与对照组相比存在显著性差异（P51）加入氯仿，盖紧管盖，充分振荡混匀并将其在冰上孵育15MIN
28、，然后于4，12000R/MIN，离心15MIN。离心后混合物分为三层，RNA存在于上清层中。4RNA的沉淀将上清层转移至干净的EP管中，加入等体积冰浴的异丙醇，缓慢颠倒混匀，将样品在20下孵育20MIN以上，4，12000R/MIN，离心10MIN，RNA呈片状沉淀附着于管壁或管底；5RNA的洗涤弃去上清，用冰浴的75乙醇洗涤RNA沉淀12次，加入1ML75乙醇，颠倒洗涤管壁，并漩涡振荡样品，尽可能让沉淀悬浮，4，12000R/MIN，离心5MIN，弃去上清，晾干沉淀；6RNA的溶解及保存适度晾干沉淀避免过分干燥，会降低其可溶性，用适量无RNA酶水来溶解RNA，抽提好的RNA保存于40冰箱，
29、同时加入适量RNA酶抑制剂。234基因检测1ONESTEPRTPCR扩增反应体系3表1ONESTEPRTPCR反应体系RNASEFREEH2O55LFPRIME05LRPRIME05L2ONESTEPBUFFER125LRNA5LPRIMESCRIPTRONESTEPENZYMEMIX1LTOTAL25L2反应程序设置表2ONESTEPRTPCR反应条件循环次数温度时间11509430MIN2MIN26389430S5530S7230S17210MIN16保存3ACTIN、MDR、HSP70、NKA、MTF1基因的检测条件表3引物的退火温度及循环数基因退火温度循环数ACTIN5426MDR60
30、38HSP705526NKA5834MTF15828235数据处理采用BIOSENSGELIMAGINGSYSTEM软件将半定量图谱转化为定量数值，并用SPSS软件在对照组和实验组之间进行差显分析，认为P005时存在显著性差异，P001时存在极显著差异。43结果31纳米AL2O3处理不同时间后肝组织的总RNARNA提取的好坏是影响实验成功的关键，条带的清晰度可以用来说明RNA的降解率，图1为纳米AL2O3处理不同时间后肝组织总RNA的电泳图，有3条条带，分别对应沉降系数58S、18S、28S，含量在982914471NGL1,其中处理0H小时和处理6小时鱼肝的RNA质量较差，说明其在保存的过程
31、被降解，存贮越久，降解的越厉害，虽然不以3条带出现作为RNA质量好坏的标准，因为这3种RNA在细胞内含量较多，但其清晰度较高，说明实验相关的其他RNA的降解率也越低，一般以OD260/OD280值作为RNA质量的参照，越接近20，说明RNA纯度越高，经过超微量分度光度计分析，OD260/OD280值在196205之间，如表4所示，说明提取的RNA纯度较高，可以作为基因检测的模板。图1RNA提取条带（注0处理72H的鱼肝；1处理48H的鱼肝；2处理24H的鱼肝；3处理12H的鱼肝；4处理6H的鱼肝；5处理0H的鱼肝。）表4总RNA含量与纯度组号含量（NG/L纯度（OD260/OD280）对照14
32、4711966H1175820212H982920524H1713820148H1159519872H1213620032常规RTPCR检测相关基因的表达水平ACTIN，即肌动蛋白，在各种生物组织或者细胞中其表达量较恒定，亮度之间的差异一般只与编码该蛋白的基因数目成正比，生物学上把这类编码基因称为持家基因。因此往往以ACTIN作为内参，来达到消除其余基因表达的差异由原初RNA含量不同带来的误差。经浓度为56MGL1纳米AL2O3处理不同时间后斑马鱼ACTIN测定的结果，如图2所示，处理6H与24H的比对照组测定较强，而另外三组12H、48H、72H均弱于对照组，说明原初RNA量并不完全相同，计
33、算各基因的绝对含量与相应ACTIN含量并进行比值，求出各基因的相对含量，以排除由RNA含量的不同而导致的误差。58S18S28S0123455图2ACTIN基因的测定水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。321纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中HSP70基因表达的影响纳米AL2O3处理不同时间得到的肝组织HSP70基因测定结果如图3、4所示，6H内HSP70表达量无明显变化，12H、24H、48H、72H时却显著增加（P005）（表5），12H达到最大值，说明斑马鱼经纳米AL2O3处理后，对HSP70基因表达有影响。图3
34、HSP70基因的表达水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。图4HSP70的相对含量322纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中MDR基因表达的影响检测不同时间处理后斑马鱼MDR基因（图5），6H内表达量相对稳定，12H达到最大值，以后呈逐渐下降趋势，但整体上仍高于对照组（图5、6）。经纳米AL2O3处理后，斑马鱼肝组织中的MDR与处理时间虽然无明显的相关性，但与对照组都有显著差异（P005）（表5）。说明纳米AL2O3可以促进MDR基因的表达。1234562000BP1000BP750BP500BP200BP100BP350
35、BP100BP200BP500BP750BP1000BP2000BP175BP123456MM6图5MDR基因的表达水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。图6MDR基因的相对含量323纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中NKA基因表达的影响图7所示为纳米AL2O3处理不同时间，斑马鱼NKA基因表达差异的结果。处理6H后NKA基因表达能力与对照相近，处理12H时达到最大值，12H以后强于对照组（图7、8），12H、48H、72H实验组中的NKA表达量与对照组相比有显差异（P005）（表5），表明纳米AL2O3可以促进NKA基
36、因表达。450BP123456M7图7NKA基因的表达水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。图8NKA基因的相对含量324纳米AL2O3对斑马鱼肝脏中MTF1基因表达的影响与对照相比，不同时间处理斑马鱼MTF1表达强度无明显变化（图9）。处理6H附近无显著差异，其余处理时间12H、24H、48H、72H均有显著差异（P005）（表5、图10），但与处理时间无正相关性。图9MTF1基因的表达水平注M代表MARKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝。2000B
37、P1000BP750BP500BP200BP100BP320BP123456345BPM8图10MTF1相对含量表5纳米AL2O3处理与对照组相比肝脏中各基因显著性差异分析注F（）；F（）；表示H与对照相比存在显著性差异（P005）；表示H与对照相比存在高度显著性差异（P001）。4讨论41纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中HSP70基因表达的机理分析热休克蛋白70（HSP70）是指能够稳定另一种蛋白质的不稳定构想，具有高度保守的序列，并可通过有效地结合和释放、协助多聚体的组装或降解、新生肽的折叠延伸及细胞器蛋白的跨膜运输及调节、修复和降解变性的蛋白质方面起着重要作用的一类蛋白质家族12。刘迪秋1
38、3等报道了鲫鱼肝脏HSP70在重金属基因平方和DF均方F显著性HSP70173353479741400004312004MDR4309586272684200001412001NKA4309586272684200001412001MTF125450512974489000000120009CU、GE处理下表达均上调，HSP90在1MGL1CU处理12H表达至最大值。此外，HARTLFU14及SCHRODERH15等报道在体外胁迫下，HSP70分子伴侣能够起保护酶结构的作用。在本研究中，经过纳米AL2O3处理，斑马鱼肝组织内的HSP70基因表达量比对照均上调，在12H达到最大值，与其他实验结果
39、类似，说明纳米AL2O3可能造成蛋白质的损伤或者变性，引起跨膜运输及调节、修复上的紊乱，为恢复机体正常功能，HSP70基因被增强表达。但为了使实验更具有说明力，可以进一步从与HSP70功能相关的酶活性上研究。42纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中MDR基因表达的机理分析多药耐药性基因MDR1是指某种耐药细胞系对许多结构上无关的和作用机制不同的其它药物或化学品产生交叉耐药性的一类基因。MDR1过度表达生成的PGP糖蛋白）是MDR产生的最重要原因，而在正常情况下，PGP可以将渗入细胞内的有害物质排出体外，减小伤害。穆宝忠16等对MDR进行分子机理研究，发现正常组织发生肿瘤后，PGP表达依然强烈，给肿瘤
40、治愈带来很大的难题17。本实验结果显示，经过纳米AL2O3处理，斑马鱼肝组织内的MDR基因表达量比对照均上调，在12H达到最大值，说明机体在暴露在纳米材料下，随着纳米颗粒进入细胞内累积到一定量，机体为了维持自身功能的有序，MDR1基因被激活，编码过量的PGP将纳米材料排出体外，进行保护。但为了更系统地阐述纳米AL2O3与MDR的相关性，还需从与MDR表达或代谢功能相关的酶活性上研究。43纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中NKA基因表达的机理分析NAKATP基因（NKA）是指用于编码NAKATP酶的一类基因，主要功能是编码蛋白以维持细胞膜的通透性，保持细胞内环境中的相对稳定以及细胞内环境与体外环境的
41、渗透压平衡，且对金属离子具有强敏感性。SFPERRY118等试验发现用生理盐水或140MMOLL1HCL处理虹鳟3H、6H、12H时，存在显著差异（P005）。本实验中，经过纳米材料胁迫，导致细胞内外环境渗透压失衡，又因NKA对金属离子均有强敏感性，促进了NKA的表达，说明纳米材料在一定浓度范围内，可以诱导NKA基因的过量表达，以重新维持环境的稳定，不过超过一定的浓度范围就起抑制作用，如朱小山19等报告鲫鱼鳃组织内NAKATP酶活性在NC60/AQ为020MGL1时被激活，而在10MGL1时酶活性又开始下降，说明机体自我调节的能力有限。44纳米AL2O3影响斑马鱼肝脏中MTF1基因表达的机理分
42、析金属调节转录因子1MTF1，又称锌指转录因子，能与金属硫蛋白（MT启动子的金属感应序列结合，调控其基因的表达，而金属硫蛋白在基本金属元素的调节中起重要作用，并且对非基本的金属元素有抑制和解毒作用，MT20通过与重金属结合可以有效的减轻重金属对机体的毒害，是目前临床上最理想的生物螯合解毒剂，有研究表明21MTF1可被镉激活。本研究中，发现经纳米AL2O3处理一定时间后，MTF1基因被激活，编码产物又进一步调控金属硫蛋白翻译能力增强，产生大量MT以结合金属纳米铝，中和其毒性。说明机体将纳米材料视为外源毒物加以排除，通过调控金属硫蛋白表达产物与铝金属结合，起解毒和减轻重金属对机体的伤害。5总结和展
43、望纳米材料具有良好的理化性质，所以国内外已经开始普遍使用。但由于体积微小，易通过呼吸道或者9气孔进入生物体内，也正因为不知道其是否会对生态环境带来破坏，一系列有关纳米材料的研究正在进行中，通过本次研究发现，一定浓度的纳米颗粒进入水体后会对水生生物，如斑马鱼肝组织的生长代谢相关基因产生了不良影响，说明超过一定浓度的纳米材料能产生生物学效应22，破坏一些生物的正常代谢，但由于本实验研究面不广、涉及面不深，所以无法得出如何浓度下的纳米积累会给环境带来影响，或者纳米材料的自然降解的周期，因此只能说纳米材料使用需谨慎。参考文献1单志强纳米材料特性极其在环境保护领域的应用J环保材料,2005,232426
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