1、1,第九章 临床常见病原体检测,川北医学院检验系谢 宁,2,概 述,感染性疾病 凡由病原生物包括细菌、真菌、 病毒、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体或寄生虫侵入人体所致的疾病，统称为感染性疾病。,3,找到病原菌,感染性疾病,控制更有效！,4,临床病原体检查目的,确定感染的发生和性质。 在疾病早期提供恰当的治疗方案，并采取有效的预 防措施。 防止感染传播所造成的危害。 病原体检查重要性：明确临床诊断 指导临床用药,5,临床病原体检查的基本程序,医生、护士、病人、检验师：正确规范采集运送标本。 检验科：直接镜检、免疫学、分子生物检测、病原体 分离培养鉴定和药敏实验报告结果。 医生：明确诊断、合理用
2、药。,6,第一节 标本的采集运送、实验室评价和检查方法,7,一、标本采集和运送,无菌操作,采集时间、部位,8,检验申请单的基本内容,The patient,s name and hospital number. Age and sex. Collection date and time. Diagnosis. Source of the specimen. Ordering physician. Immunization history and antimicrobial therapy. Objective.,9,（一）血液标本的采集,适应症 采集时机 皮肤准备 培养瓶消毒 采血量 采血套数
3、 振摇 室温送检,10,（二）尿标本的采集,晨起第一次尿液为佳冲洗外阴部、尿道口清洁中段尿导尿耻骨穿刺采集膀胱内尿液不得加防腐剂和消毒剂,11,（三）粪便标本的采集,自然排便，挑取脓、血或粘液部分于清洁容器中送检。排便困难者，采用直肠拭子采集。根据细菌种类不同选用合适的运送培养液以提高阳性检出率。传染性腹泻应连续送检3次。,12,(四) 呼吸道标本的采集,13,痰标本的采集,采集时间：晨痰，且在取痰 前用清水反复漱口。 方法：（1）自然咳痰法：（2）气 管镜下采集法；（3）气管 穿刺法。,14,要求：10个鳞状上皮细胞/低倍 25个WBC /低倍,15,（五）脑脊液与其他无菌体液标本,无菌注射
4、器穿刺采集，置于无菌容器中立即送检。脑脊液标本应立即保温送检，不能暂时保存于冰箱中。第一管用于微生物学检查。胸腹水等体液标本应抽取2-5ml送检。,16,（六）泌尿生殖道标本的采集,常取生殖道分泌物男性：无菌采集尿道口分泌物或前列腺液。女性：用无菌棉签采集阴道或宫颈分泌物。生殖道疱疹常穿刺取疱疹液,17,（七）脓液及创伤感染分泌物标本,18,脓液及创伤感染分泌物标本,开放性脓肿及脓性分泌物： 直接涂片染色镜检 用NS冲洗表面两支无菌棉拭取脓液或深部分泌物 分离培养封闭性脓肿： 灭菌试管 一般细菌培养 消毒皮肤粘膜注射器无菌抽取脓液 厌氧送检供厌氧菌培养大面积烧伤的创面分泌物： 无菌棉拭取多部位
5、创面脓汁分泌物无菌试管送检。,19,二、标本的实验室质量评估标准,无标签的标本或标签信息与申请单信息不一致；送检日期延误的标本；容器有破损或渗漏等；标本储存、运送方式不当；明显污染标本；量明显不足标本；重复送检标本（血培养除外）烈性传染病标本的采集和运送不符合相关规定,拒 收,20,三、检查方法,直接显微镜检查。病原体抗原与抗体的检测。病原体核酸的检测。病原体的分离培养与鉴定。,21,（一） 直接显微镜检查,不染色标本检查法：悬滴法和压滴法染色标本检查法： 革兰染色：细菌、真菌 抗酸染色：抗酸杆菌（结核、麻风） 墨汁染色：隐球菌,22,23,直接显微镜检查的优缺点,优点：快速诊断或初步诊断。
6、缺点：不能准确鉴定细菌真菌的属和种；未进行药 敏试验，不能准确指导临床抗生素治疗。,24,（二）病原体抗原检查,方法：免疫荧光、酶免、化学发光等。 排除交叉抗原的影响，病原体抗原检测可明确感染的病原体,HIV抗原检测实验原理示意图,25,（三）血清学实验,特异性 IgM可作为感染性疾病 早期诊断指标，且可区分原 发与复发感染。 特异性 IgG，尤其双份血清的 滴度呈4倍或4倍以上升高，考 虑病原体感染。,26,（四）病原体核酸的检测,聚合酶链反应（PCR）：扩增 病原体微生物特异的DNA或RNA 片段。探针杂交法：通过已知序列的 探针与病原体的核苷酸杂交， 用以了解病原体的有无。主要适用于不能
7、或很难分离培 养的微生物。,27,（五）病原体的分离培养与鉴定,目的： 明确感染病原体。 为临床提供体外抗微生物药物敏感试验结果。,28,细菌、真菌：选择合适的培养基与培养方法、观察 菌落性状、生化鉴定、血清学实验。病毒、立克次体、衣原体：接种鸡胚、易感动物或 进行细胞培养，观察增殖指标和血清学方法鉴定。,29,细菌感染检测程序,30,病实毒验感室染诊性断疾 病 的,31,细菌分离培养与鉴定的结果评价,培养阴性,培养阳性,32,第二节 病原体耐药性检测,33,抗生素耐受的起点：盘尼西林,年 弗莱明 Fleming,年弗洛里 Florey&钱恩 Chain,34,耐药性的历史,1941 青霉素
8、1960 甲氧苯青霉素1943 链霉素 1962 林可霉素1945 头孢菌素 1962 喹诺酮类1950 四环素 1970 青霉烯类 1952 红霉素 1980 单环-内酰胺类 1956 万古霉素 2010 抗生素时代的终结？,超级细菌！,35,可以预测药物在病人体内的效果，指导临床合理选择 抗生素； 了解本地区或本医院内常见病原菌的种类及耐药性， 有助于临床经验性治疗时合理选药。 定期对病原菌种类和耐药谱分析，有助于发现医院感 染暴发或流行。,细菌药敏检测的意义,36,定义：对某种抗菌药物敏感的细菌变成对该药物耐受称 细菌耐药性。 类型：天然耐药：是通过染色体DNA突变所致。获得性耐药：是由
9、质粒介导、转位因子的插入以及其他遗 传物质携带外来DNA片段导致产生的耐药性。,细菌耐药性,37,细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统； 产生灭活抗生素的水解酶和钝化酶； 细菌抗生素作用靶位改变； 细菌膜外排泵出系统； 细菌生物膜的形成。,细菌产生耐药的常见机制,38,39,K-B纸片琼脂扩散法 稀释法： E试验MIC （最低抑菌浓度）,药敏检测的方法,40,药敏实验结果的解释,根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准判断：敏感（susceptible，S):表示推荐使用该抗生素进行临床治疗。耐药(resistant，R):指常规用药剂量不能达到MIC，临床治疗不可靠。中介(inte
10、rmediate，I):表示药物MIC接近体液或组织可达到药物浓度，但反应低于敏感株；但在一些浓集部位（如尿液中的喹诺酮类）或者使用高于正常给药量时临床上使用有疗效。,41,（1）耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）（2）产超广谱-内酰胺酶(ESBL)（3）氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌（HLAR）（4）耐万古霉素肠球菌（VRE）,特殊耐药菌检测的临床意义,42,（1）耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）MRSA+MRCNS NCCLS规定：MRS对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和含酶抑制剂的复方制剂均应报告耐药，而不考虑体外药敏结果，治疗首选药物为万古霉素。,特殊耐药菌检测的临床意义,43,44,（2）产超
11、广谱-内酰胺酶(ESBL)： 该酶水解青霉素、头孢菌素及单胺类，主要由大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌产生。 NCCLS规定：产ESBL细菌,不论体外药物敏感试验结果如何, 对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南治疗均无效，建议用碳青酶烯类抗生素。,特殊耐药菌检测的临床意义,45,46,（3）氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌（HLAR） NCCLS规定:HLAR指对高浓度庆大霉素或链霉素耐药，提示与细胞壁活性药物无协同作用。,特殊耐药菌检测的临床意义,47,48,（4）耐万古霉素肠球菌（VRE） VRE临床上可用药物很有限，可以对氯霉素（或强力霉素、二甲胺四环素）和利福平做药敏实验。但是对青霉素敏感
12、的VRE可用青霉素和庆大霉素联合治疗；若对青霉素耐药而不是HLAR可以用壁霉素+庆大霉素。,特殊耐药菌检测的临床意义,49,第三节 临床感染常见的病原体检查,50,细菌感染检查项目的选择,普通细菌：常采用直接镜检、分离培养与鉴定明确病原体。 难培养或培养要求高的细菌：综合运用免疫学或分子生物 学检测，如结核分枝杆菌感染以及幽门螺杆菌感染等。流行病学调查：病原体抗体检测，如ASO试验与Widal反应等。,51,病毒感染检查项目的选择,细胞培养快速复制的病毒：细胞培养。 细胞培养不能快速复制的病毒：目前多检测病毒抗原、特异性抗体或核酸，如CMV。不能细胞培养的病毒：病毒核酸检测与病毒特异性抗 体检
13、测，如HCV、HPV等。,52,真菌感染检查项目的选择与应用评价,直接显微镜检查：初步明确真菌感染分离培养：明确何种真菌感染真菌抗原检测：只适合于血清与脑脊液中隐球菌、念珠菌以及荚膜组织胞浆菌等 真菌抗体检测：深部真菌的检测,53,寄生虫感染检查项目的选择与应用评价,直接显微镜检查：观察寄生虫生活史的各阶段，是寄生虫感染的主要诊断依据。 寄生虫抗体检测：辅助诊断。,54,支原体感染检查项目的选择与应用,直接显微镜检查：无价值。 分离培养：阳性可明确诊断。 目前临床多检测支原体抗原 与核酸，用于早期快速诊断。,55,衣原体感染检查项目的选择与应用,直接显微镜检查：检查衣原体 包涵体可提供早期初步
14、诊断。 分离培养：阳性可明确诊断。 目前临床多检测衣原体抗原与 核酸，用于早期快速诊断。,56,螺旋体感染检查项目的选择与应用,直接显微镜检查有初步诊断价值。 特异性抗体的检测为确诊依据。,57,第四节 病毒性肝炎检测,58,肝炎病毒标志物检测,甲型肝炎病毒（HAV） 乙型肝炎病毒（HBV）丙型肝炎病毒（HCV） 丁型肝炎病毒（HDV）戊型肝炎病毒（HEV）庚型肝炎病毒（HGV）输血传播病毒（TTV）,59,1.抗-HAV IgM型Ab阳性：可诊断为急性甲型肝炎。 2.抗-HAV IgG型Ab阳性：表示过去曾受过HAV感染， 但体内已无HAV，是一种保护性抗体，可用于甲 肝的流行病学调查。 （
15、对HAV的检测还有HAV-RNA，其诊断特异性高， 特别是对早期诊断意义更大。）,一 、HAV抗体检测,60,二、HBV血清标志物检测,HBV 特点：又称Dane颗粒，嗜肝性DNA病毒，分为包膜与核心两部分：包膜上的蛋白质即HBsAg；核心部分含双链DNA、DNA聚合酶（DNAP）、核心抗原（HBcAg）和e抗原（HBeAg），是病毒复制的主体。,61,1、乙肝两对半检测（1）HBsAg:表面抗原为HBV的主要外壳蛋白，包括前S1、前S2和S蛋白，具有抗原性，HBsAg阳性表示存在HBV的现症感染，为HBV感染最早证据。HBsAg阳性见于急性乙肝潜伏期；发病后3个月不转阴，则易发展成慢性乙型肝
16、炎或肝硬化。携带者HBsAg也呈阳性。HBsAg本身不具有传染性，但因其常与HBV同时存在，常作为传染性标志之一。,62,（2）抗-HBs：表面抗体抗-HBs是一种保护性Ab（中和性抗体，能中和HBsAg ），抗-HBs阳性提示机体有一定免疫力。一般在感染后3-6个月才出现，可持续多年。注射过乙型肝炎疫苗或抗-HBs免疫球蛋白者，抗-HBs可呈现阳性反应。,63,（3）HBeAg： e抗原 HBeAg阳性是HBV复制的标志，表明乙型肝炎处 于活动期，提示HBV在体内复制，传染性较强； HBeAg持续阳性，表明肝细胞损害较重，且可转 为慢性乙型肝炎或肝硬化。如转为阴性，表示病 毒停止复制 。,6
17、4,（4）抗-HBe： e抗体 乙肝急性期即出现，抗-HBe阳性者易进展为慢性乙 型肝炎；慢性活动性肝炎出现阳性者可进展为肝硬 化；抗-HBe阳性表示大部分乙肝病毒被消除，复制 减少，传染性减弱，但并非无传染性，HBeAb不是保 护性抗体（不能抑制HBV增殖）。,65,（5）抗-HBc ：核心抗体 抗-HBc 是HBV感染后最早出现的抗体，效价高，持续时间 长，是HBV感染的标志；有IgG和IgM两种: 抗-HBc总抗体：抗-HBc总抗体主要反映的是抗 -HBc IgG，其检出率比HBsAg更敏感，可作为 HBsAg阴性的HBV感染的敏感指标；也可用作乙 型肝炎疫苗和血液制品的安全性鉴定和献血
18、员 的筛选。抗-HBc IgG对机体无保护作用，其阳 性可持续数十年甚至终身。,66,（6）HBcAg：核心抗原 HBcAg位于Dane颗粒的核心部位，被HBsAg 包裹，血中一般无游离的HBcAg；如果患 者HBcAg阳性，提示病人血清中有感染性的 HBV存在，其含量较多，表示复制活跃，传 染性强，预后较差。,67,HBV五项血清标志物联合检测的临床意义 HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义 + - + - + 急性或慢性乙型肝炎，高传染性 + - - - + 急、慢性乙肝或慢性HBsAg携带者 + - - + + 急性乙肝趋向恢复或慢性乙肝， 弱 传 染性
19、- + - - + 急性HBV感染康复期或有既往感 染 史，目前保持免疫力 - - - + + 乙肝恢复期，弱传染性 - - - - + 急性HBV感染“窗口期”或既往 感染过乙肝，有流行病学意义 - + - - - 疫苗接种后或HBV感染后康复 - + - + + 急性乙肝康复期，开始产生免疫力 - - - - - 非乙肝感染,68,2、HBV-DNA定性和定量测定 血清中HBV-DNA的存在是HBV感染最直接，最灵 敏和最特异的检测指标。 HBV-DNA检测是评价HBV传染性的最可靠方法。 HBV-DNA检测结果与血清免疫学结果应综合评价。 HBV-DNA检测可用于抗病毒药物治疗乙肝的疗效
20、评价。 筛查献血员，防止乙肝病毒输血后感染。 监测血制品的传染性、乙肝疫苗的安全性。,69,三、HCV标志物检测 1、HCV抗体测定 抗-HCV为保护性Ab,阳性是诊断HCV感染的重要依据。 抗-HCV IgM 阳性： 常见于急性HCV感染，是诊断丙肝的早期敏感指标； 是HCV活动的指标。 在慢性HCV感染时，若抗-HCVIgM 阳性，只表示病变 活动，常伴有ALT升高；是判断HCV传染性的指标。 抗-HCV IgG 出现晚于抗-HCV IgM， 阳性表明体内 有HCV感染，但不能作为HCV感染的早期诊断指标。,70,2、HCV-RNA检测HCV-RNA(+)是HCV感染最直接、最灵敏和最特异
21、的检测指标。HCV-RNA(+)，提示活动性感染；HCV-RNA(-)、抗-HCV IgG（+）：提示既往感染可能性大。HCV-RNA定量检测可用于病情判断、病情预测、监测干扰素等药物的疗效、检测血制品的安全性；HCV-RNA可用于研究丙肝发病机理和传播途径。,71,第五节 性传播疾病病原体检测,性传播性疾病（sexually transmitted disease,STD）：是指通过各种性接触而传播的侵犯皮肤、性器官及全身多脏器的疾病，简称性病（venereal disease）。,72,重要的性病及病原体,性 病 病 原 体 淋病 淋球菌 梅毒 梅毒螺旋体 艾滋病 人类免疫缺陷病毒 非淋球
22、菌尿道炎 溶脲支原体、沙眼衣原体等 生殖器疱疹 单纯疱疹病毒 尖锐湿疣 人乳头瘤病毒,73,艾滋病（AIDS）病原体检查项目与应用,直接显微镜检查与分离培养：临床较少采用。 HIV-RNA检测：排除假阳性可确诊。 HIV抗体检测：颗粒凝集试验、ELISA等为过筛实验， Westerblot确诊实验。,74,梅毒螺旋体感染检查项目的选择与应用,暗视野显微镜检查：有初步诊断价值。梅毒血清学试验： 非特异性抗体的检测：过筛试验。 特异性抗体的检测：确诊试验。,75,淋病病原体的检测方法选择与应用（1）,直接显微镜检查：多形核白细胞内见革兰氏阴性双球菌，男性泌尿生殖道标本可明确诊断，而女性需结合培养结
23、果分析。,76,淋病病原体的检测方法选择与应用（2）,分离培养；广泛采用，阳性即可确诊。 PCR：可用于早期快速诊断，但假阳性率高。 特异性抗原与抗体检测：方法尚不成熟。,77,非淋菌性尿道炎检测方法选择与应用,特异性抗体的检测：意义不大。 分离培养；阳性可确诊。 直接显微镜检查：适用于衣原体的检测。 目前临床多检测抗原与核酸，用于早期快速诊断。,78,单纯疱疹病毒,分离培养；阳性可确诊。 目前临床常检测HSV-DNA与HSV抗原，用 于早期快速诊断。,79,人乳头瘤病毒,不能分离培养 目前临床常检测HPV-DNA与HPV抗原，用于 早期快速诊断。,80,第六节 医院感染常见病原体检查,医院感
24、染（nosocomial infection）：又称院内感染或医院获得性感染，指患者在入院时不存在，也不处于潜伏期，而在医院内发生的感染，包括医院内获得的而在出院后发病的感染。医院感染对象：病人（住院、门诊）、医院职工、探视人员与陪护人员等。,81,医院感染重大事件,2005年安徽宿州 白内障手术2008年西安交通大学第一附属医院 新生儿科2009年天津蓟县妇幼保健院 新生儿科2009年山西太原 血液透析2009年广东汕头 剖腹产手术,82,医院感染的高危人群,慢性疾病，如肿瘤、糖尿病以及肝硬化等。 免疫抑制剂及激素的使用者。 化疗及放疗患者。 手术及麻醉患者。 使用介入性诊断与治疗的患者。
25、广谱抗生素使用者。,83,医院感染的感染源,病人、医院职工、探视人员、陪护人员。 医院环境、未彻底消毒的医疗器械、血 液制品等。,84,医院感染常见的病原体,细菌为主要病原体。细菌的种类因时、地和人而异。不同临床类型其感染细菌的构成比不同。,85,常见临床类型,下呼吸道感染：我国最常见，以铜绿假单胞菌为主。尿路感染：以大肠埃希菌 、变形杆菌为主。手术切口感染：外源性感染，约占25%。胃肠道感染：肠炎，以真菌为主。血液感染：菌血症，以大肠埃希菌为主。皮肤和软组织感染：金葡，溶链引起的蜂窝织炎等。,86,及时；无菌操作；立即送检，床旁接种；尽量在抗菌药物使用前采集标本；盛标本容器须经灭菌处理，但不
26、得使用消毒剂；送检标本应注明来源和检验目的，使实验室能正确选用相应的培养基和适宜的培养环境，必要时应注明选用何种抗菌药物； 作定量(或半定量)培养；作药敏试验，提倡“分级报告”(即分阶段报告涂片镜检、初步培养、直接药敏、初步鉴定、最终鉴定与药敏结果)和“限时报告”(涂片报告2小时，普通培养3天)。,标本采集和送检基本原则,87,医院感染检查内容,基本原则与病原体感染类似，但更应注意正常菌群的污染以及条件致病菌在医院感染中的地位。定期对医院环境进行病原体监测。定期对医疗器械的消毒效果进行监测。,88,思考题：,1、病原体检测标本种类及采集注意事项？2、常见病原体有哪些种类及检测意义？ 3、ESBL、MRS、HLAR、VRE检测的临床意义？4、何为乙肝两对半检测及临床意义？5、何谓院内感染？常见临床类型有哪些？,89,谢谢！,
